反义寡核苷酸构象锁定策略用于靶向抑制前体微RNA

《RSC Chemical Biology》：Use of conformationally locking antisense oligonucleotides for the targeted inhibition of precursor microRNAsOpen Access

　　

反义寡核苷酸（ASOs）被广泛用作治疗剂。一类ASO通过在RNA诱导沉默复合体（RISC）内将成熟微RNA（miRNA）隔离于双链结构中从而增强蛋白表达。另一种靶向控制基因表达的替代策略是使用结合前体miRNA（pre-miRNA）并调节其酶促加工的ASO。研究人员证明，破坏pre-miR-31连接区的ASO（该区域此前被研究人员确定为关键调控元件）在体外是Dicer/TRBP加工的强效抑制剂，但不抑制Dicer/TRBP结合。此外，研究人员将这一策略扩展并验证至pre-miR-144，其具有类似的连接区依赖的结构-功能关系。通过对pre-miRNA二级结构的分析，研究人员发现近20%的人类pre-miRNA预测含有连接区，并在该组多个成员上验证了ASO策略。重要的是，研究人员还在细胞内证实了连接区靶向ASO对pre-miRNA加工的具体抑制作用。本研究重申了RNA结构在调控Dicer/TRBP加工pre-miRNA中的重要角色，并为开发结构知情的ASO以抑制miRNA产生提供了框架。

研究背景与立项依据

微RNA（microRNA，miRNA）是一类约21–22 nt的非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，其生物合成经历细胞核内Drosha/DGCR8（含DiGeorge综合征关键区8蛋白）切割产生前体miRNA（pre-miRNA），再经核输出至胞质由Dicer与TAR RNA结合蛋白（TRBP）切除顶端环生成成熟miRNA双链，最终并入Argonaute（Ago）蛋白形成RNA诱导沉默复合体（RISC）发挥靶mRNA降解或翻译抑制功能。miRNA异常与肿瘤、心血管及神经退行性疾病密切相关，因而成为热门治疗靶点。传统ASO多靶向RISC内成熟miRNA序列以阻断其mRNA结合，但成熟miRNA短、种子序列保守易致脱靶，且RNA编辑或替代切割产生的异构体可削弱ASO效力。另有研究用ASO靶向pri-/pre-miRNA顶端环以空间阻挡Dicer切位或隔离蛋白结合序列，但仅靶向顶端环而不封闭Dicer切位往往无效甚至上调成熟产物。研究人员此前发现pre-miR-31连接区（junction）碱基配对稳定性是Dicer/TRBP高效加工的必要元件，突变破坏该区即抑制加工，由此提出用ASO破坏连接区、将pre-miRNA“构象锁定”为不利底物以抑制成熟的假设。该研究发表于《RSC Chemical Biology》。

主要技术方法概括

研究使用重组人Dicer与TRBP蛋白（杆状病毒/大肠杆菌表达、镍亲和及凝胶过滤纯化）形成Dicer/TRBP复合体；以体外转录制备³²P标记或SYBR Gold染色的pre-miRNA底物（pre-miR-31、pre-miR-144、GG-pre-miR-19a、pre-miR-143、pre-miR-21、pre-let-7c等），在含Mg²⁺的dicing缓冲液中行时间课程切割 assay，并用非变性胶迁移实验（Ca²⁺替代Mg²⁺抑制酶活性）检测结合；基于miRBase预测1613条人类pre-miRNA二级结构并按标准归类连接区；细胞内实验采用HEK293细胞系（ATCC来源），共转染pmirGLO报告质粒与pCMV过表达质粒及磷酸硫酰化/锁核酸（LNA）修饰ASO，行双荧光素酶报告、RT-qPCR（TaqMan Advanced miRNA cDNA合成）、小RNA测序（Illumina 2×150 bp，edgeR差异分析）验证成熟miRNA下调与脱靶情况。

研究结果

Antisense oligonucleotides inhibit pre-miR-31 cleavage by Dicer/TRBP

研究人员设计系列互补于pre-miR-31顶端环并破坏连接区碱基配对的ASO（31-A1至31-A4），体外Dicer/TRBP切割assay显示最短的31-A4（500 nM–5 μM）显著抑制pre-miR-31加工；31-A4对pre-miR-21与pre-let-7c加工无影响，且凝胶迁移显示Dicer/TRBP仍可结合pre-miR-31，证明抑制非全局性酶活阻断亦非单纯空间位阻，而是锁定“开放连接区”构象。

Pre-miR-144 is a targetable pre-miRNA containing a junction region

pre-miR-144二级结构邻近Dicer切位含连接区，研究人员设计144-A1至144-A4，体外assay中均抑制切割，选最短144-A4；SYBR Gold分链定量显示5p与3p成熟链生成同等受抑，排除仅屏蔽切位偏见，证实序列特异性作用于连接区。

The junction region is a common structural feature within pre-miRNAs

研究人员普查miRBase中1663条人类pre-miRNA，296条（约18%）符合连接区定义（切位下直接非配对核苷酸或两切位间非配对元件），其中约70%连接区为3–5 bp。延伸至预测含4 bp连接区的pre-miR-19a（GG-pre-miR-19a变体）与pre-miR-143，相应ASO（19a-A2、143-A4）在10–100倍过量下显著抑制两条底物Dicer/TRBP加工，且pre-miR-19a 3p引导链生成同步下降。

Targeting junction-containing pre-miRNAs is a reasonable approach for inhibiting Dicer/TRBP processing

非连接区pre-let-7c的顶端环ASO（7c-A1）即使100倍过量也不抑制加工；Ca²⁺条件下Dicer/TRBP与pre-miR-31结合不受31-A4影响，说明机制不是阻挡Dicer螺旋酶域识别顶端环，而是构象锁定使底物偏离激发态偏好构象，连接区是此类pre-miRNA高效加工的结构前提。

ASO targeting of junction-containing pre-miRNAs inhibits Dicer cleavage in cellulo

研究人员将31-A4、144-A4、7c-A1改为磷酸硫酰骨架嵌合LNA（31-LNA、144-LNA、7c-LNA）转染HEK293细胞，RT-qPCR显示31-LNA与144-LNA显著降低成熟miR-31、miR-144水平，7c-LNA不影响let-7c；双荧光素酶报告证实靶基因翻译抑制解除；pri-miR-31水平不变提示作用点在Dicer步而非Drosha步；小RNA测序与正交RT-qPCR显示除miR-31外全谱miRNA无重复差异，无实质脱靶。

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，传统抗miRNA ASO隔离RISC内引导链，而本策略在更上游以ASO扰动pre-miRNA连接区，将RNA锁入不利Dicer/TRBP加工构象，同时抑制5p与3p成熟链产生，避免乘客链累积入RISC风险。该“构象锁定”范式依赖结构而非仅序列，近20%人类pre-miRNA含连接区可成靶标，pre-miR-31/144成功但pre-miR-21/181a（无连接区）历史失败与之自洽。局限在于需精确结构认知、递送稳定性、HEK293外细胞与体内验证尚缺。结论部分原文意译：ASO是核酸治疗重要工具，靶向成熟miRNA者多，靶向pre-miRNA者少且结果不一；本研究以pre-miR-31为模型证伪“ASO仅作空间阻断”假设，确立连接区靶向ASO通过构象锁定抑制Dicer/TRBP加工之机制，扩至pre-miR-144/19a/143均有效，细胞内LNA化ASO降成熟miRNA、升靶基因表达且无脱靶；约20%人类pre-miRNA预测含连接区，本框架为结构知情ASO抑制miRNA发生提供基础，强调RNA结构（非仅序列）在核酸药物设计中的决定作用。