《Journal of Functional Foods》：Restoration of glucocorticoid receptor expression by sterol-enriched
Sargassum horneri attenuates particulate matter-induced epithelial stress and surfactant transcriptional alterations in alveolar type II epithelial cells
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摘要
环境颗粒物（particulate matter, PM）通过诱导氧化应激和炎症信号传导破坏肺泡上皮完整性。虽然已有报道称羊栖菜（*Sargassum horneri*）可预防PM相关的气道损伤，但其甾醇富集组分是否参与糖皮质激素受体（glucocor
摘要
环境颗粒物（particulate matter, PM）通过诱导氧化应激和炎症信号传导破坏肺泡上皮完整性。虽然已有报道称羊栖菜（*Sargassum horneri*）可预防PM相关的气道损伤，但其甾醇富集组分是否参与糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）相关的上皮调控尚未得到研究。在本研究中，研究人员表明，一种甾醇富集的羊栖菜乙醇提取物（sterol-enriched *Sargassum horneri* ethanol extract, S-SHE）在溶剂分配各组分中具有最高含量的岩藻甾醇（fucosterol），并可减轻PM诱导的细胞毒性。在暴露于PM的MLE-12细胞中，S-SHE降低了细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成、丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平以及Al和Fe的表面蓄积，并缓解了PM诱导的形态学改变。S-SHE还抑制了Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）/髓样分化因子88（myeloid differentiation primary response 88, MyD88）/肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6, TRAF6）相关的炎症信号传导、核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）转录活性以及促炎细胞因子和趋化因子的表达。值得注意的是，S-SHE恢复了GR表达，并调节了表面活性物质相关基因的表达，包括Sftpb和Sftpc。这些结果表明，羊栖菜的甾醇富集组分可减轻PM诱导的上皮应激，并可能与皮质类固醇相关的上皮调控具有潜在相关性。
论文解读：甾醇富集羊栖菜提取物通过恢复糖皮质激素受体表达减轻颗粒物诱导的肺泡上皮应激与表面活性物质相关转录改变
一、研究背景与目的
颗粒物（particulate matter, PM）是呼吸道重要的环境毒物，能够诱导氧化应激、上皮损伤及炎症反应。由于吸入的PM易沉积于远端气道和肺泡区域，肺泡上皮细胞不仅作为物理屏障，还通过释放细胞因子和上皮介质成为炎症信号的关键启动者。过度或持续的PM暴露会破坏上皮完整性，促进或加重慢性呼吸系统疾病。在气道上皮细胞中，II型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial type II cells, AEC II）通过表面活性物质产生和损伤后上皮修复维持肺泡稳态。表面活性蛋白B（surfactant protein B, SP-B，由Sftpb编码）和表面活性蛋白C（surfactant protein C, SP-C，由Sftpc编码）对维持肺泡稳定和正常肺功能至关重要。然而，PM暴露是否扰乱AEC II维持的肺表面活性物质系统仍未完全阐明。
糖皮质激素（glucocorticoids, GCs）通过糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）依赖性抑制促炎信号通路（包括NF-κB和激活蛋白1）而成为控制气道炎症最有效的药物之一。GR信号在气道上皮细胞中也参与调节细胞对炎症和环境应激的响应，并与肺表面活性物质程序功能相关。小鼠肺上皮特异性GR缺失可降低晚期妊娠期间表面活性蛋白A、B、C和D的mRNA表达，表明上皮GR在表面活性物质相关肺成熟中发挥作用。然而，合成GC的长期使用受到不良反应和上皮反应性差异的限制。因此，需要寻找能够减轻PM诱导的上皮应激并调节GR相关通路的替代制剂。
研究人员前期研究表明，羊栖菜（*Sargassum horneri*）来源的提取物和生物活性成分可减轻PM诱导的氧化应激和炎症反应，其保护效果可与泼尼松相当。海洋褐藻富含生物活性化合物，包括具有抗氧化和抗炎特性的植物甾醇。岩藻甾醇（fucosterol）是羊栖菜属的主要甾醇，具有针对包括PM在内的环境应激源的细胞保护活性，计算机分子模拟也将其预测为GR的潜在分子靶点。然而，甾醇组分在羊栖菜抗PM诱导上皮应激中的作用，特别是涉及GR相关调控的机制仍不清楚。此外，羊栖菜的作用是否超越抑制氧化和炎症反应而扩展至调节AEC II稳态核心的表面活性物质相关反应，仍是未知数。
基于此，本研究采用甾醇富集的羊栖菜乙醇提取物（sterol-enriched *Sargassum horneri* ethanol extract, S-SHE），探讨其对PM诱导的MLE-12细胞上皮应激的保护作用，重点关注GR相关调控，并进一步评估S-SHE是否减轻PM诱导的氧化应激和TLR2/MAPK/NF-κB炎症信号，以及这些效应是否伴随GR表达的恢复和PM诱导的表面活性物质相关改变的减轻。
二、主要技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法开展研究：以来自中国北京的城市气溶胶PM标准参考物质（CRM No.28，购自日本国立环境研究所NIES）作为PM暴露源；对采自韩国济州岛近海的羊栖菜进行70%乙醇提取，依次用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和水进行溶剂分配获得四个不同极性组分（S-SHE、T-SHE、P-SHE、PS-SHE）；采用高效液相色谱（HPLC）分析甾醇、酚酸和单双糖组成，气相色谱（GC）分析单糖组成，Folin-Ciocalteu法和比色法测定总酚、总黄酮和硫酸基含量；使用MLE-12小鼠肺上皮细胞系，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞毒性，采用荧光探针DCF-DA检测细胞内活性氧（ROS）生成，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）水平，场发射扫描电子显微镜结合能谱分析（FE-SEM-EDS）观察细胞形态和过渡金属组成，蛋白质印迹法检测GR、TLR2、MyD88、TRAF6、MAPK和NF-κB通路蛋白表达，实时定量PCR（qPCR）检测炎症因子、趋化因子和表面活性物质相关基因mRNA表达，免疫细胞化学检测p-IκBα阳性细胞，双荧光素酶报告基因实验评估NF-κB转录活性。
三、研究结果
3.1 SHE溶剂分配组分的得率
四种溶剂分配得到的SHE组分中，正己烷组分S-SHE得率最高（75.35%），其次为氯仿组分T-SHE（13.41%）、乙酸乙酯组分P-SHE（2.46%）和水组分PS-SHE（1.07%），表明溶剂极性导致SHE组分的含量和组成存在显著差异。
3.2 SHE组分中总酚、总黄酮和硫酸基含量
P-SHE的总酚含量最高（31.91 mg GAE/g），T-SHE总黄酮含量最高（320.60 mg QE/g），而S-SHE的总酚和总黄酮含量相对较低。PS-SHE的硫酸基含量最高（12.53%）。富含萜类的T-SHE和富含多酚的P-SHE所含酚类和黄酮类化合物高于富含甾醇的S-SHE和富含多糖的PS-SHE。
3.3 SHE组分中酚酸、甾醇及单双糖组成
在SHE组分中鉴定出11种酚类化合物，没食子酸为主要酚酸。甾醇分析显示，仅检出岩藻甾醇，且S-SHE中含量最高（25.96 mg/100 g），远高于其他组分。糖类分析显示，S-SHE总糖含量最高（6.67 mg/100 g），其中甘露糖醛酸（54.59%）为主要单糖成分，同时含有半乳糖醛酸（3.69%）和硫酸基。S-SHE是岩藻甾醇含量最高的组分。
3.4 SHE组分和PM在MLE-12细胞中的细胞毒性特征
四种SHE组分在0-250 μg/mL浓度范围内处理3小时均未表现细胞毒性。PM暴露3小时和24小时均可剂量依赖性地增加LDH活性。S-SHE（31.3和62.5 μg/mL）可减轻PM诱导的细胞毒性，降低各PM浓度下的LDH水平。据此选择31.3和62.5 μg/mL S-SHE作为后续机制分析的代表性有效浓度。
3.5 S-SHE减轻PM诱导的ROS生成和脂质过氧化
PM暴露显著增加MLE-12细胞内ROS水平，而S-SHE剂量依赖性地将ROS降至接近基线水平。PM暴露升高MDA水平，表明氧化性膜损伤，S-SHE以剂量依赖性方式显著降低PM诱导的MDA增加，最高浓度使MDA恢复至接近未处理对照水平。在溶剂组分比较筛选中，S-SHE对PM诱导的细胞内ROS生成表现出最显著和一致的抑制效果。
3.6 S-SHE在PM暴露下的金属螯合与细胞形态恢复
FE-SEM成像显示，PM处理导致MLE-12细胞表面粗糙度显著增加、上皮边界破坏和正常细胞形态丧失。S-SHE共处理有效恢复正常形态特征。EDS元素分析显示，PM暴露使细胞表面Al和Fe水平分别从未处理组的1.38%和0.04%增加至4.72%和1.54%，S-SHE共处理可剂量依赖性地降低Al和Fe的表面蓄积，在62.5 μg/mL时均达到显著差异。
3.7 S-SHE抑制PM诱导的TLR2激活并恢复MLE-12细胞中GR表达
对Tlr1-Tlr9 mRNA表达分析显示，PM暴露后Tlr2表达升高最为显著，较未处理对照增加18.7倍。S-SHE在31.3和62.5 μg/mL浓度下分别使PM诱导的Tlr2表达降低88.5倍和107.6倍。GR mRNA表达方面，PM降低Gr mRNA表达，而S-SHE在31.3和62.5 μg/mL浓度下分别使Gr mRNA表达较PM处理组增加166.2倍和283.6倍。蛋白质印迹分析进一步证实，PM增加TLR2蛋白表达1.3倍，降低GR蛋白表达，而S-SHE在31.3和62.5 μg/mL浓度下分别使GR表达增加1.5倍和2.9倍。PM还增加MyD88和TRAF6蛋白表达，S-SHE可下调这些蛋白表达。
3.8 S-SHE减弱PM诱导的TLR相关MAPK和NF-κB信号通路激活
PM使p-IKKα/IKKα比值和p-IKKβ/IKKβ比值分别增加5.1倍和5.7倍，S-SHE在62.5 μg/mL时分别使两者降低1.5倍和1.6倍。MAPK通路方面，PM使p-p38和p-JNK表达分别增加2.2倍和3.0倍，S-SHE可显著降低p-p38表达，但对p-JNK的抑制作用仅在31.3 μg/mL时显著，p-ERK未受明显影响。NF-κB激活方面，PM增加胞浆p-IκBα和核内NF-κB表达，S-SHE可降低两者，在62.5 μg/mL时p-IκBα降低1.2倍，核内NF-κB在31.3和62.5 μg/mL时分别降低2.3倍和3.2倍。免疫细胞化学分析显示，PM将p-IκBα阳性细胞比例增加至7.5%，S-SHE在31.3和62.5 μg/mL时分别显著降低至2.5%和2.3%。
3.9 S-SHE和NAC减弱PM诱导的NF-κB转录活性
双荧光素酶报告基因实验显示，PM使NF-κB活性增加1.99倍。S-SHE剂量依赖性地降低报告基因活性，在1000 μg/mL时抑制效果最强，使NF-κB活性较PM组降低1.51倍。NAC预处理单独使PM诱导的NF-κB激活降低0.81倍，NAC与S-SHE联合处理进一步降低RLU值，表明对PM诱导的NF-κB激活具有协同抑制作用。
3.10 S-SHE减弱PM诱导的促炎细胞因子和趋化因子表达
PM显著增加Il1β、Tnfα、Il6和Tgfb的mRNA表达，分别较未处理对照增加13.7倍、2.7倍、4.2倍和13.4倍。S-SHE可显著抑制这些PM诱导的细胞因子表达增加。PM将IL-1β分泌增加1.4倍，S-SHE在31.3和62.5 μg/mL时分别使IL-1β水平降低4.8倍和20.9倍。趋化因子方面，PM将Ccl2和Ccl5表达分别增加3.9倍和4.7倍，S-SHE可显著抑制两者的表达增加。
3.11 S-SHE减弱PM诱导的表面活性物质相关基因表达改变
PM显著增加Sftpa1、Sftpb、Sftpc和Sftpd表达，分别较未处理对照增加2.4倍、6.0倍、9.1倍和2.0倍。S-SHE可减弱这些PM诱导的表达改变，在31.3和62.5 μg/mL浓度下，Sftpa1分别降低2.3倍和3.7倍，Sftpb分别降低5.9倍和5.2倍，Sftpc分别降低12.8倍和10.8倍，Sftpd两种浓度下均降低1.7倍。
四、讨论与结论
讨论部分指出，S-SHE是羊栖菜溶剂分配组分中岩藻甾醇含量最高、对PM诱导ROS生成抑制效果最强的组分，但S-SHE并非仅含甾醇，其同时含有甘露糖醛酸、半乳糖醛酸和硫酸基等海藻源成分。含糖醛酸和硫酸基的海藻多糖具有抗氧化活性和金属离子结合能力，因此S-SHE的保护效果可能反映岩藻甾醇与其他共存生物活性成分的联合贡献。
氧化应激是PM暴露后肺泡上皮细胞最早发生的事件之一。PM中的过渡金属等氧化还原活性组分可促进ROS生成和脂质过氧化。S-SHE通过ROS清除和过渡金属螯合减轻PM诱导的氧化应激，缓解PM诱导的形态学改变并降低Al和Fe表面蓄积。S-SHE对氧化应激的减弱伴随炎症信号传导的抑制。PM暴露增加TLR2表达，激活下游MyD88/TRAF6相关信号，增强JNK、p38和IκBα磷酸化及NF-κB转录活性，上调IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α、CCL2和CCL5表达，S-SHE可减轻这些反应。NAC同样降低PM诱导的NF-κB报告基因活性，表明氧化应激与PM暴露下炎症信号密切相关。
PM暴露降低MLE-12细胞GR表达，提示GR相关调控的破坏可能同时促进炎症增强和表面活性物质相关转录改变。氧化应激可干扰GR信号传导并导致炎症性气道疾病中皮质类固醇反应性降低，PM暴露与类固醇抵抗表型的发生相关。S-SHE恢复GR表达的同时伴随炎症信号抑制和表面活性物质相关转录改变的减轻，提示甾醇组分可能参与GR相关调控通路。
PM暴露增加表面活性物质相关基因特别是Sftpb和Sftpc的表达，S-SHE可减轻这些转录改变。PM可通过金属和氧化应激机制干扰表面活性物质的生物物理特性和功能。含糖醛酸和硫酸基的海藻成分具有抗氧化、抗炎和金属结合特性，S-SHE所含甾醇组分与海藻来源共存成分的联合作用可能参与调节表面活性物质相关反应。
研究结论为：S-SHE减轻了PM诱导的MLE-12细胞氧化应激和炎症信号传导，从而减少PM暴露下促炎介质表达。同时，S-SHE恢复了GR表达并减轻了表面活性物质相关基因表达改变，表明其可能缓解PM诱导的上皮应激，同时影响与肺泡稳态相关的上皮反应。这些效应可能反映S-SHE中甾醇组分与共存海藻来源成分的联合贡献。本研究仅限于单一体外肺泡上皮细胞模型，需要进一步研究阐明GR相关和表面活性物质相关反应的机制，并在其他细胞和体内模型中验证这些发现。综上所述，这些发现支持将S-SHE作为潜在的食品来源生物活性组分以对抗PM诱导的上皮应激进行进一步研究。
