脂肪酸结合蛋白5可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖与转移

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Fatty Acid-Binding Protein 5 Potentially Regulates the Proliferation and Metastasis of Uveal Melanoma Cells Through the PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway

　　

背景：葡萄膜黑色素瘤（UVM）是一种侵袭性眼内肿瘤，针对转移性疾病的有效治疗手段有限。本研究探讨了脂肪酸结合蛋白5（FABP5）促进UVM进展的途径。
方法：采用Seurat包对单细胞RNA测序数据集进行预处理，并使用survival包筛选预后相关基因。通过LASSO Cox回归构建预后模型，随后进行Kaplan–Meier（KM）生存分析。为表征肿瘤免疫微环境，研究人员使用ssGSEA、ESTIMATE和CIBERSORT算法评估免疫细胞浸润，同时应用GSEA识别富集通路。此外，通过TIDE预测免疫治疗反应，并使用Maftools计算肿瘤突变负荷（TMB）。在体内验证方面，建立了裸鼠异种移植模型，并对移植瘤组织进行了Western blotting检测。
结果：SPON2、MATK和FABP5被确定为UVM的核心基因，并用于构建具有高AUC值的预后模型。免疫浸润分析显示，高危组患者表现出免疫逃逸特征。富集分析进一步揭示，细胞毒性T细胞相关基因（MATK和FABP5）富集于PI3K/AKT/mTOR通路。FABP5在UVM细胞中过表达，而沉默FABP5可抑制细胞活力、增殖、迁移和侵袭，降低MMP2和MMP9水平，促进细胞凋亡，下调PI3K/AKT/mTOR通路相关分子，并上调凋亡相关蛋白。值得注意的是，这些效应可被PI3K激动剂740Y-P逆转。
结论：FABP5通过PI3K/AKT/mTOR通路促进UVM细胞增殖和迁移。虽然免疫浸润分析仅为假设生成性的，但可能有助于筛选可能从免疫治疗中获益的患者。

脂肪酸结合蛋白5通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控葡萄膜黑色素瘤细胞增殖与转移的机制研究

一、研究背景

葡萄膜黑色素瘤（UVM）是眼部最常见的原发性恶性肿瘤，主要起源于脉络膜（90%），其次为睫状体（6%）和虹膜（4%）的黑色素细胞。与皮肤黑色素瘤相比，UVM具有独特的分子驱动特征，以高转移潜能和不良预后为特点。尽管UVM发病率相对较低，且大多数原发病灶可通过放疗、眼球摘除等手段治疗，但仍有超过40%的患者最终发生远处器官转移，并呈现明显的肝脏嗜性播散倾向。新兴证据表明，UVM转移与肿瘤免疫微环境调控及基因表达重编程密切相关。然而，由于转移性UVM缺乏标准化治疗方案，阐明转移机制并识别潜在治疗靶点对于制定临床干预策略至关重要。

既往研究表明，T细胞相关基因的鉴定可能有助于转移性UVM的治疗开发，部分T细胞相关基因已被证实可延长转移性UVM患者的总生存期，但其治疗获益仅限于部分患者群体，凸显了识别T细胞相关生物标志物以优化患者分层的迫切性。与此同时，PI3K/AKT/mTOR通路作为一条涉及150余种调节蛋白的关键且高度复杂的信号级联，在多种癌症中被异常激活。作为PI3K信号的中心效应分子，AKT磷酸化可触发mTORC1激活并抑制自噬，从而促进细胞生长和增殖。因此，探索PI3K/AKT/mTOR信号级联与T细胞相关基因的相互作用，有助于阐明UVM增殖机制并指导靶向治疗。

在T细胞相关候选基因中，脂肪酸结合蛋白5（FABP5）尤为引人关注。FABP5作为一种小型胞内脂质分子伴侣，可将长链脂肪酸及相关脂质转运至特定的细胞位点。关键的是，FABP5能将脂肪酸和维甲酸递送至过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ（PPARβ/δ），使维甲酸信号从生长抑制转向激活有利于增殖和存活的基因表达。FABP5还通过与PPARγ相互作用重编程脂质代谢，以满足肿瘤细胞升高的能量和膜需求。此外，FABP5可通过上调SNAI1和β-catenin信号促进上皮-间质转化（EMT），增强PI3K/AKT/mTOR信号传导，并通过脂质负载巨噬细胞中的FABP5-PPARγ信号削弱T细胞抗肿瘤免疫，重塑肿瘤免疫微环境。FABP5还通过上调血管内皮生长因子（VEGF）促进血管生成、增加基质金属蛋白酶（MMPs）以降解细胞外基质、诱导脂肪酸从头合成以及激活核因子-κB（NF-κB）炎症信号通路来驱动肿瘤进展。FABP5高表达与肝癌、前列腺癌和消化道肿瘤的不良预后相关，同样被认为是UVM不良预后的标志物。

二、研究内容与技术方法

本研究基于多组学数据开展。研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取包含8例原发肿瘤样本和3例转移样本的单细胞RNA测序数据集（GSE139829），并从癌症基因组图谱（TCGA）获取UVM患者的RNA-seq表达谱和临床随访数据，经TPM转换和log2变换后保留79例具有完整无进展间期（PFI）信息的样本作为训练集，另以GSE22138数据集（63例）作为验证集。在细胞实验方面，研究人员选用人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19作为对照，人UVM细胞系Mel270（原发）、OMM2.3（转移）和MUM-2B（转移）作为研究对象，通过shRNA转染敲低FABP5表达，并利用PI3K激动剂740Y-P进行功能拯救实验。体内实验采用BALB/c裸鼠皮下异种移植模型验证FABP5在肿瘤生长中的作用。主要技术方法包括：Seurat包处理scRNA-seq数据、Harmony批次校正、UMAP降维聚类；survival包进行单变量Cox回归、glmnet包进行LASSO Cox回归构建预后模型；ssGSEA、ESTIMATE和CIBERSORT算法评估免疫浸润；GSEA进行通路富集分析；TIDE预测免疫治疗反应；Maftools计算肿瘤突变负荷；qRT-PCR和Western blotting检测基因和蛋白表达；CCK-8、克隆形成、划痕愈合、Transwell、流式细胞术和ELISA分别评估细胞活力、增殖、迁移、侵袭、凋亡及MMP2/MMP9分泌水平。

三、研究结果

3.1 UVM单细胞图谱与预后风险模型建立

研究结果显示，转移样本中T细胞比例高于原发肿瘤样本，其中仅细胞毒性T细胞与PFI显著相关，被确定为PFI的独立预后预测因子。生存分析显示，细胞毒性T细胞高浸润患者PFI显著缩短。通路富集分析表明，细胞毒性T细胞富集于包括PI3K/AKT/mTOR在内的信号通路。通过LASSO Cox回归筛选出SPON2、MATK和FABP5三个关键基因构建预后模型，ROC分析显示较高的曲线下面积（AUC），表明模型具有稳健的预测性能。高风险评分组患者PFI显著更差，三个基因在高风险组中均高表达。GSE22138外部验证进一步确认了该模型的预后价值。

3.2 免疫浸润、免疫治疗反应与GSEA分析

高风险组显示出更高的ImmuneScore和StromalScore，表明其肿瘤微环境中基质成分和免疫细胞浸润增加。三个关键基因的表达与ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore显著正相关。高风险组多个免疫细胞亚群的富集分数显著升高，TIDE评分更高，免疫检查点抑制剂（ICI）反应率显著降低，总体TIDE评分显著增加。低风险组具有更高的肿瘤突变负荷（TMB）。此外，高风险组多个免疫检查点基因显著上调。Hallmark通路分析显示，MATK和FABP5的表达与PI3K/AKT/mTOR信号通路活性显著正相关。

3.3 FABP5在UVM细胞中的表达

qRT-PCR结果显示，所有UVM细胞系中FABP5表达均显著升高，其中转移性OMM2.3和MUM-2B细胞的表达水平高于原发Mel270细胞。Western blotting证实FABP5蛋白水平在转移性细胞系中也较高。经sh-FABP5转染后，qRT-PCR和WB均证实FABP5敲低成功，其中sh-FABP5#1敲低效率更高，被选用于后续实验。

3.4 sh-FABP5转染后的细胞表型变化

CCK-8实验显示，转染sh-FABP5#1的OMM2.3和MUM-2B细胞活力显著低于sh-NC组。克隆形成实验显示sh-FABP5#1组增殖能力明显降低。划痕愈合实验表明细胞迁移能力受显著抑制。Transwell实验证实FABP5沉默的UVM细胞侵袭能力同样受到抑制。此外，sh-FABP5#1组MMP2和MMP9水平较sh-NC组显著下调。

3.5 FABP5与PI3K/AKT/mTOR通路及细胞凋亡的关联

在转移性UVM细胞系中，sh-FABP5#1转染显著降低了PI3K/AKT/mTOR通路相关分子的水平，提示FABP5可能通过该信号通路影响UVM进展。sh-FABP5#1组促凋亡相关分子的表达显著升高，流式细胞术分析证实sh-FABP5#1组凋亡率显著高于sh-NC组。

3.6 PI3K激动剂740Y-P处理后的细胞变化

CCK-8实验显示，sh-FABP5#1联合740Y-P处理的OMM2.3和MUM-2B细胞活力显著高于单独sh-FABP5#1组。克隆形成实验显示联合处理组增殖能力显著恢复。流式细胞术分析显示联合处理组凋亡率显著低于sh-FABP5#1组，促凋亡相关分子表达明显下调。划痕愈合实验显示联合处理组迁移能力显著增强，Transwell侵袭实验证实细胞侵袭能力大幅回升。MMP2和MMP9水平在联合处理组中显著上调。上述结果表明PI3K激动剂740Y-P逆转了sh-FABP5在UVM细胞中的肿瘤抑制作用。

3.7 FABP5在小鼠肿瘤模型中的作用

在异种移植肿瘤模型中，sh-FABP5#1组肿瘤体积显著小于sh-NC组。Western blotting分析显示sh-FABP5#1组PI3K/AKT/mTOR通路相关分子水平显著降低，促凋亡相关分子表达显著上调。

四、讨论与结论

本研究构建了包含SPON2、MATK和FABP5三个关键基因的UVM预后风险模型。SPON2是一种属于F-spondin家族的分泌型细胞外基质蛋白，研究显示其可促进M2极化肿瘤相关巨噬细胞的浸润，参与UVM转移。FABP5在转移性UVM细胞系中特异性高表达，沉默FABP5可直接抑制细胞增殖、迁移和侵袭以及MMP2/MMP9的分泌，同时促进细胞凋亡，为FABP5驱动UVM恶性行为提供了直接功能学证据。在机制层面，沉默FABP5可降低转移性细胞系和异种移植瘤中PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白水平，增加促凋亡蛋白表达并下调抗凋亡蛋白Bcl-2。使用PI3K激动剂740Y-P可拯救sh-FABP5细胞的增殖、迁移和侵袭能力以及MMP表达，并缓解细胞凋亡，表明FABP5作为PI3K/AKT/mTOR通路的上游调控因子，以通路依赖方式驱动UVM恶性表型。此外，高风险组表现出显著的免疫微环境重塑，FABP5表达与免疫评分密切相关，提示FABP5可能通过PI3K/AKT/mTOR通路调节免疫相关生物学过程。本研究也存在局限性：机制验证主要基于细胞系和小鼠模型，缺乏大队列临床样本的直接验证；FABP5靶向治疗与现有临床方案（如ICI）的联合应用尚未探索；免疫治疗相关发现完全来自计算预测，有待通过治疗性药物在临床前模型中验证。论文发表在《CNS Neuroscience》。

研究结论：通过计算分析构建了包含SPON2、MATK和FABP5的UVM预后模型。细胞和动物实验进一步验证了FABP5通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进UVM细胞恶性增殖、迁移和侵袭并抑制细胞凋亡，这些效应可被PI3K激动剂740Y-P逆转。FABP5/PI3K/AKT/mTOR信号轴在UVM肿瘤发生和进展中发挥潜在作用，基于免疫浸润的风险分层可能有助于指导UVM免疫治疗选择，但该假设仍需在治疗患者队列中加以证实。