工程化Vibrio natriegens裂解物可替代细胞培养基的多种组分

《Sustainable Food Technology》：Engineered Vibrio natriegens lysate can replace multiple components of cell culture mediaOpen Access

　　

降低细胞培养基的成本和环境影响是培养肉（利用增殖动物细胞在体外产生肉类的过程）的重要目标。尽管先前的方法已证明可使用微生物裂解物替代培养基中昂贵的动物源性胎牛血清（fetal bovine serum, FBS），但这些配方仍依赖大量生长因子，如成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2, FGF2）。在此，研究人员展示了利用表达FGF2的Vibrio natriegens制备全细胞裂解物，在培养肉应用中的细胞培养基中同时替代FBS和FGF2。这种名为“VN40FGF”的培养基能够在无补充FGF2的条件下支持永生化牛肌肉卫星细胞（immortalized bovine muscle satellite cells, iBSCs）的快速增殖。在VN40FGF中生长的细胞保持表型和分化能力。研究人员还证明，工程化V. natriegens可以在废弃细胞培养基中生长，从而进一步提高可持续性和经济性，并减少与废物处理相关的潜在富营养化问题。该方法结合了多种策略以减少培养基输入组分的总数，展示了实现更经济、更可持续的细胞培养的机遇，尤其是对培养肉而言。

培养肉的生产高度依赖成本高昂的细胞培养基，其中胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和重组生长因子是主要成本与可持续性瓶颈。成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2, FGF2）作为无血清培养基中的关键添加物，其纯化过程劳动密集、成本高昂，并带来显著环境负担。此前开发的VN40培养基虽利用Vibrio natriegens裂解物替代了白蛋白等组分，但仍需补充人源FGF2（hFGF2）。为同时替代FBS和外源FGF2，研究人员利用基因工程改造V. natriegens NC7菌株表达牛FGF2（bFGF2），通过简单的细胞培养、裂解和过滤制备全细胞裂解物，并将其添加到不含FGF2的B8基础培养基中，命名为VN40FGF。该培养基在无补充FGF2条件下支持iBSC长期增殖，维持干细胞表型并改善分化能力。进一步研究表明，利用iBSC培养后的废培养基培养工程化V. natriegens可循环生产裂解物，降低成本和环境影响。该研究发表于《Sustainable Food Technology》，为培养肉的低成本、可持续生产提供了新策略。

主要关键技术方法方面，研究人员采用了V. natriegens NC7转化（菌株来自Addgene #215356）、超声破碎与过滤制备全细胞裂解物、Bradford法测总蛋白、ELISA定量bFGF2；使用iBSC模型（来源于5周龄西门塔尔牛半腱肌，并已工程化表达端粒酶逆转录酶（TERT）和细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4））进行增殖与分化实验；通过Pax7免疫染色和自动图像细胞仪评估干性；废培养基经高压灭菌后进行V. natriegens培养，并通过代谢物分析和生长曲线评估营养利用；最后进行成本核算。

研究结果如下。

V. natriegens NC7可被工程化以表达牛FGF2
SDS-PAGE显示，转化bFGF2质粒的V. natriegens裂解物中存在约17 kDa蛋白条带，而空载体对照无此条带。ELISA定量表明，裂解物总蛋白约3800 μg mL^-1，其中bFGF2为66 μg mL^-1，占总蛋白的不到2%。当以40 μg mL^-1裂解物添加至培养基时，递送的bFGF2约为700 ng mL^-1，远高于无血清条件下所需的40 ng mL^-1 hFGF2，说明该工程菌能高效表达牛源生长因子。

VN40FGF在长期iBSC增殖中替代VN40的FGF2需求
研究人员将iBSC分别培养在VN40FGF（含bFGF2裂解物）和VN40（含40 ng mL^-1 hFGF2）中，经多代增殖，两种培养基中细胞生长曲线和倍增时间（约32.6 h）无显著差异，细胞形态相似。FGF剂量滴定实验显示，在10–700 ng mL^-1范围内，无论FGF来自工程菌裂解物还是纯化hFGF2，细胞生长均无显著差异；而无FGF2的阴性对照细胞衰老。这表明VN40FGF可完全替代外源FGF2补充。

在VN40FGF中生长的iBSC保持干细胞性并增强分化能力
通过Pax7免疫染色和自动图像细胞仪定量，在VN40FGF中传代5次后，超过98%的iBSC保持Pax7阳性，与VN40培养细胞相当，说明裂解物不影响卫星细胞干性。分化诱导9天后，细胞形成表达Desmin和Myosin Heavy Chain的多核肌管，且desmin融合指数显著高于VN40培养的细胞，表明牛源bFGF2可能通过物种特异性途径改善分化。

可利用废细胞培养基生产V. natriegens裂解物
研究团队收集iBSC培养后的废VN40FGF，补充盐分并高压灭菌（121 °C，40 min），发现该处理可消除抗真菌剂的影响，使V. natriegens能够生长。在废培养基和新鲜VN40FGF中，V. natriegens均可生长，但富培养基LB中的最大OD₆₀₀更高（1.37 vs 0.5）。代谢物分析显示，iBSC生长导致废培养基中铵和乳酸增加、谷氨酰胺减少，而葡萄糖、谷氨酸和钾无显著变化；V. natriegens生长后几乎完全消耗葡萄糖和乳酸，并产生大量铵。ELISA显示，废培养基中生长的V. natriegens产生的bFGF2递送量为212 ng mL^-1，低于LB培养的700 ng mL^-1，但仍远高于40 ng mL^-1需求；用废培养基源VN40FGF培养iBSC，其生长与LB源VN40FGF相当。三个传代收集的废培养基足以再生成三个传代所需的VN40FGF。

利用废培养基生产的VN40FGF与既往iBSC培养基配方相比具有成本竞争力
成本分析显示，VN40FGF的培养基成本为125美元 L^-1，较VN40（161美元 L^-1）降低22%，较含血清的牛卫星细胞生长培养基（BSCGM，323美元 L^-1）降低61%。利用废培养基而非LB生产V. natriegens裂解物，可将裂解物试剂成本从2.83美元 L^-1降至1.20美元 L^-1，降幅57%。这些成本仅包括实验室规模的试剂费用，不包括人工和设备等运营成本。

在讨论部分，研究人员指出，V. natriegens相对于大肠杆菌具有低内毒素含量和快速生长等优势。尽管VN40FGF中bFGF2浓度过量，但未对细胞产生负面影响，反而可能通过牛源FGF2对牛细胞肌源基因（如MYF5）的更强上调作用提高分化能力。废培养基循环使用不仅降低成本和资源消耗，还可利用V. natriegens消耗乳酸，有助于废物处理。未来工作需关注残留抗生素、异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, IPTG）、内毒素和质粒DNA等食品安全问题，可通过非抗性菌株、食品级诱导剂（如木糖）和额外纯化步骤来解决。

研究结论可翻译为：总体而言，VN40FGF展示了一种低成本、低资源投入的无血清培养基制备策略，可在不添加补充生长因子的情况下用于培养肉生产。这项工作使培养肉向可负担和可持续的生产更近一步。