整合与非逻辑系统与DNA酶驱动DNA行走器扩增，用于双miRNA的灵敏电化学检测

《Microchemical Journal》：Integrated AND logic system with DNAzyme-powered DNA walker amplification for sensitive electrochemical detection of dual-miRNAs

　　- 与门控制的双足 DNA 步行器实现了双微小 RNA 的电化学检测。- 逻辑门反应的中间产物以高特异性激活了 DNA 步行器。- DNA 酶驱动的双足 DNA 步行器放大作用提升了系统的灵敏度。- 作为电极支撑界面的 TDN 显著减少了非特异性吸附。## 引言微小 RNA (miRNAs) 是一类小非编码 RNA 分子，在各种生物过程中发挥重要作用 [1], [2], [3]。其异常表达与多种疾病的发生和发展有关，包括癌症，某些特定的 miRNAs 是癌症诊断、治疗和预后前景看好的生物标志物 [4], [5], [6]。然而，特定 miRNA 与疾病之间的关系往往不是一对一的。单独检测一种 miRNA 可能不利于疾病诊断，监测到的假阳性结果会影响患者的早期检测和治疗 [7], [8], [9]。因此，开发一种能够同时分析多种 miRNAs 的策略对于提高癌症诊断的准确性和推进病理研究至关重要。传统的定量实时聚合酶链反应和微阵列分析等方法已实现了准确的 miRNA 定量 [10], [11], [12], [13]。然而，它们在同时检测方面遇到了一些不可避免的局限性。同时，繁琐的操作程序、较长的检测时间和昂贵的设备阻碍了其应用 [14], [15]。因此，开发一种用于同时检测多种 miRNAs 的快速且简单的技术对于满足临床需求至关重要。基于 DNA 的布尔逻辑门的出现为多目标分析和计算操作提供了一种可行的策略 [16], [17], [18]。在典型的基于 DNA 逻辑门的生物传感器中，提供两个或更多输入信号，只有当所有输入信号同时被激活时，输出信号才会被触发。越来越多的证据表明，DNA 逻辑门是构建传感平台的有力工具，它们已被成功用于检测各种生物分子，包括小分子、核酸和蛋白质 [19], [20], [21]。例如，Hemphill 团队设计了一个级联与门来识别哺乳动物细胞中的特定 miRNA-21 和 miRNA-122 [22]。Zeng 等人创新地设计了一种由与门控制的 DNA 酶纳米花，实现了对 DNA 修复酶 APE1 和 MGM 的敏感检测 和细胞内成像 [23]。Bi 等人开发了一种基于分子逻辑门和亚甲基蓝敏化的 ZnO@CdS@Au 纳米棒的超灵敏光电化学生物传感器，用于双 miRNAs 检测 [24]。其中，由于电化学生物传感器具有简单、响应快速和低成本的特点，受到了更多关注。为了实现更好的分析性能，结合核酸信号放大策略 [25], [26], [27] 是一种有效的研究方法。DNA 步行器 [28], [29], [30] 作为一类直接由目标激活的自组装动态纳米机器，赋予生物传感器卓越的信号放大能力，已成为 miRNAs 检测的新兴且可靠工具。典型的 DNA 步行器纳米机器包括三个部分：驱动力、轨道底物链和行走链。在 DNA 行走过程中，多个带有检测信号的底物从轨道上释放出来，实现信号放大和输出。例如，Yang 等人证明 RNA 可以激活 CRISPR/Cas12a 催化系统，并构建了一种在活细胞中运行的 3D DNA 步行器，用于特定微小 RNA 的敏感和实时成像 [31]。Zhang 等人开发了一种行走效率高的巧妙 DNA 步行器，用于 miRNA 的快速和敏感检测 [32]。然而，当 DNA 步行器应用于生物传感领域时，一个关键挑战是目标直接解锁 DNA 步行器导致特异性低。针对这一情况，在本研究中，我们建立了一种基于与逻辑门控制和 DNA 酶驱动的高效 DNA 步行器信号放大的新型电化学生物传感平台，用于双靶微小 RNA 检测。在开发的平台上，我们适当地制备了 DNA 探针并将它们连接到磁珠 (MBs) 上，以识别 miRNAs 的二元输入。当某个目标 miRNA 缺失时，与门的输出信号为 0，不产生触发 DNA。只有当两种 miRNAs 同时存在时，与门输出 1，允许释放触发 DNA。释放的 DNA 有助于 DNA 酶构象切换成激活状态。随后，由 DNA 酶驱动的双足 DNA 步行器在修饰有四面体 DNA 纳米结构 (TDN) 的电极上快速移动，通过交替结合和解离事件产生放大的电化学信号。在这个开发的策略中，特异性生成的 DNA 链（触发 DNA 的中间产物）解锁了 DNA 步行器，为生物传感器提供了优异的特异性。同时，具有显著信号放大能力的高效 DNA 步行器，作为一类直接由目标激活的自组装动态纳米机器，赋予所提出的生物传感器高灵敏度。## 章节摘要### 试剂和材料链霉亲和素包被磁珠 (MB-SA)、6-巯基 -1- 己醇 (MCH) 和三 (2- 羧乙基) 膦盐酸盐 (TCEP) 购自上海麦克林生化科技有限公司 (中国上海)。磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.0, 0.2 M) 通过将 0.1 M Na₂HPO₄, 0.1 M KH₂PO₄ 和 0.1 M KCl 溶于超纯水制备。铁氰化物/亚铁氰化物溶液 ([Fe(CN)₆]^3?/4-, pH 7.0, 5.0 mM) 通过将 5 mM K₃[Fe(CN)₆], K₄[Fe(CN)₆] 和 0.1 M KCl 溶于 PBS 获得。### 电化学生物传感器原理我们提出的用于双 miRNAs 检测的电化学传感系统的原理如图 1 所示。根据图 1A，我们设计了一种部分杂交的 DNA 探针用于双 miRNA 识别，其中使用一段短 DNA 链 (触发 DNA) 阻塞 DNA 探针上目标 miRNA 结合位点的一部分。当输入 miR-944 和 miR-205 时，DNA 计算被激活，长 DNA 链与目标 miRNA 杂交，释放触发 DNA。接下来，释放的### 结论总之，本研究成功构建了一种集成与逻辑门和 DNA 酶驱动的双足 DNA 步行器放大的新型电化学生物传感器，用于双 miRNAs 检测。采用了一种理性设计的 DNA 探针系统来实现目标 miRNAs 的二元输入识别，其中产生的触发 DNA 可以激活哑铃结构 DNA 探针上的惰性 DNA 酶，导致双足 DNA 步行器在四面体 DNA 纳米结构上自主行走### CRediT 作者贡献声明**Wanrong Zhu:** 撰写 – 初稿，验证，数据管理。 **Peiwei Wang:** 撰写 – 初稿，验证，形式分析。 **Peng Chen:** 调查，形式分析，数据管理。 **Ding Wang:** 撰写 – 审阅与编辑，监督，资金获取。 **Jingxi Wang:** 监督，资金获取。### 利益冲突声明作者声明，他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能被认为会影响本文报道的工作。### 致谢作者感谢以下项目的资金支持：重庆市自然科学基金项目 (CSTB2023NSCQ-MSX0346)，重庆市教委科技研究青年项目 (KJQN202301159)，以及企事业单位委托科技项目 (2024Q430, 2025Q404, 重庆理工大学)。Wanrong Zhu|Peiwei Wang|Peng Chen|Ding Wang|Jingxi Wang