《Microchemical Journal》：A cross-reactive DNA aptamer for neonicotinoid insecticides: Selection and its application in label-free rapid screening and detection of five neonicotinoids in foods
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•通过改进的多目标SELEX方法，获得了一种能够结合5种新烟碱类杀虫剂（NNIs）的适配体。•联合表征明确了由焓变化驱动的诱导契合识别机制。•未标记的比色传感器实现了对食品中5种NNIs的快速单次/总量筛查。引言作为第四代杀虫剂，新烟碱类杀虫剂（NNIs）因其高效杀灭多种害虫、使
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通过改进的多目标SELEX方法，获得了一种能够结合5种新烟碱类杀虫剂（NNIs）的适配体。
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联合表征明确了由焓变化驱动的诱导契合识别机制。
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未标记的比色传感器实现了对食品中5种NNIs的快速单次/总量筛查。
引言
作为第四代杀虫剂，新烟碱类杀虫剂（NNIs）因其高效杀灭多种害虫、使用剂量低、控制期长以及-low哺乳动物毒性而被广泛应用于各种农作物[1]、[2]。NNIs具有较好的水溶性、中等的环境持久性和非挥发性，因此其大量使用可能导致其在土壤、水和各种农产品等环境中残留和积累[2]、[3]。与有机磷杀虫剂相比，NNIs的毒性较低，因此据报道对环境和非目标生物的危害较小[4]。然而，先前的研究也指出，NNIs对包括传粉昆虫和水生昆虫在内的昆虫以及鸟类、哺乳动物甚至人类都表现出不同程度的毒性[2]、[5]、[6]。因此，NNIs在环境中的积累和持久性可能危害生态系统和水生生物以及哺乳动物（尤其是人类）的健康。出于这些原因，迫切需要在各种环境和农产品中监测NNIs的残留。据报道，NNI家族包括多种常用的化合物，如吡虫啉（ACE）、噻虫啉（IMI）、噻虫嗪（CLO）、噻虫胺（TMX）、噻虫啉（TCP）、吡虫酮（IMZ）、氟氯氰菊酯（FLO）、啶虫脒（DIF）和氟磺胺草醚（SUL）[1]、[3]。在实际农业生产中，会交替使用不同的NNI化合物以防止农药抗性的产生。因此，迫切需要开发出多样化、简单、快速且高通量的方法来检测尽可能多的NNI化合物，最好是所有常用的NNI化合物在环境和食品中的存在。
近年来，包括农药在内的各种污染物的检测在食品中的研究关注度日益增加[7]、[8]、[9]。目前，对环境中、生物体和各种作物中NNI残留的高通量分析主要依赖于基于色谱的方法，特别是高效液相色谱（HPLC）和高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。特别是HPLC-MS技术，可以同时以高灵敏度和可靠性检测所有常用的NNI化合物。然而，这些方法需要昂贵的设备、复杂的样品预处理过程以及受过培训的技术人员，不适合在现场对大量样品进行快速筛查和检测NNI残留[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。为了解决NNI残留的快速筛查和检测问题，已经开发了几种免疫测定方法[15]、[16]、[17]、[18]。特别是近年来，通过使用多种含NNI的 hapten（hapten-IMI、hapten-ACE 和 hapten-TMX）作为目标免疫原，分离出了几种对NNIs具有广谱特异性的单克隆抗体[16]、[18]。因此，利用这些广谱特异性单克隆抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法能够检测多种（四种或八种）NNI化合物，满足快速高通量筛查和检测NNI残留的要求[16]、[18]。ELISA方法简单快捷，既不需要昂贵的设备也不需要繁琐的预处理过程。然而，ELISA方法也存在一些显著的缺点，如抗体制备过程繁琐且耗时较长、抗体热稳定性差导致依赖环境条件、成本较高以及存在假阳性结果的风险。
DNA适配体可以在体外分离并低成本化学合成。与抗体相比，它们具有同等或更高的亲和力和特异性来识别和结合目标分子[19]。因此，它们被广泛用作检测各种化学物质的识别探针[20]、[21]。近年来，已经分离出了几种针对NNIs的适配体[22]、[23]、[24]、[25]、[26]，并利用这些分离出的适配体作为生物受体开发了多种用于快速检测NNIs的适配体传感器[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。然而，所有先前的NNI特异性适配体都是使用单一NNI化合物作为目标分子分离得到的，因此获得的适配体仅对一种NNI化合物具有结合亲和力，例如吡虫啉（ACE）、噻虫啉（IMI）、噻虫胺（TMX）或啶虫脒（DIF）[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。因此，所有先前报道的基于适配体的方法只能检测一种NNI化合物（ACE、IMI、TMX或DIF），无法满足快速筛查和检测环境中、生物体和食品中多种NNI化合物的需求[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。为了克服这些基于适配体的方法的局限性，一种有效的策略是筛选具有交叉反应性的适配体，这种适配体能够识别并结合多种或所有常用的NNI化合物。不幸的是，迄今为止，文献中尚未报道任何针对NNIs的交叉反应性适配体。因此，迫切需要筛选针对NNIs的交叉反应性适配体，以提供高通量生物受体，用于开发高通量方法，实现对大量样品中多种甚至所有常用NNI化合物的快速筛查和检测。为此，本研究开发了一种改进的结合SELEX策略，整合了梯度多目标并行选择和序列反向选择，以分离出一种能够识别五种常用NNI化合物的交叉反应性适配体。这种适配体表现出可比数量级（低微摩尔范围）的结合亲和力，并具有出色的特异性，为开发多种NNI化合物高通量检测方法提供了有前景的可靠生物受体。此外，使用选定的交叉反应性适配体作为识别探针，开发了一种简单且成本效益高的分析方法，用于快速高通量筛查和定量食品中的多种NNI化合物，从而确保食品安全。
章节片段
化学物质和设备
本研究中使用的所有DNA序列，包括ssDNA文库，均通过HPLC纯化，并从上海 Sangon Biotech（中国）购买。所有DNA序列的详细信息总结在表S1中（见支持信息，SI），所有DNA序列均在无DNase/RNase的水中制备。使用的9种常用NNI化合物的标准品包括吡虫啉（ACE）、噻虫啉（IMI）、噻虫嗪（CLO）、噻虫胺（TMX）、噻虫酮（IMZ）、氟氯氰菊酯（FLO）和啶虫脒（DIF），以及5种非新烟碱类杀虫剂，包括氟氯氰菊酯（Pho）和卡巴 chlor（Car）、吡虫啉
如上所述，结合多目标并行选择和序列反向选择的SELEX策略是一种有效的筛选交叉反应性适配体的方法，这些适配体能够识别并结合具有相同核心结构的多种目标化合物[37]。使用这种结合SELEX策略，Xu等人成功分离出一种对磺胺类药物（SAs）具有交叉反应性的适配体，该适配体能够识别并结合5种SAs化合物[37]。然而，所报告的
总之，我们开发了一种改进的结合SELEX策略，整合了梯度多目标并行选择和序列反向选择，成功筛选出一种针对NNIs的交叉反应性适配体（NNI-03）。所获得的NNI-03交叉反应性适配体能够以优异的特异性和结合亲和力（Kd值）识别五种不同的NNI化合物，这些亲和力处于可比的数量级（低微摩尔范围）。其实用性和
傅诗岚：写作 – 原始草稿、方法学、实验调查、数据分析。彭颖：写作 – 原始草稿、验证、实验调查。杨宇婷：写作 – 原始草稿、验证。徐瑞毅：写作 – 审稿与编辑、验证。傅峰富：写作 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。杨伟娟：写作 – 审稿与编辑、监督、方法学、资金获取。
国家重点研发计划（2023YFF1105300）、福州大学分析科学与生物安全教育部重点实验室的开放项目计划（资助编号FS2514）提供的财政支持。
