《Molecular & Cellular Proteomics》：Galectin-1 Modulates Cell Adhesions, Cavin-1 phosphorylation, and Vascular Permeability in Kidney Endothelial Cells – Insights from Proteomics, Phosphoproteomics, and Functional Studies
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由干扰素-γ（IFNγ）触发的微血管炎症和内皮损伤是抗体介导的排斥反应（ABMR）的标志性特征，而ABMR是导致移植肾过早丢失的首要原因。肾小球细胞外基质（ECM）重塑和内皮小窝（caveolae）形成是慢性ABMR的重要方面。研究人员发现，半乳糖凝集素-1（
由干扰素-γ（IFNγ）触发的微血管炎症和内皮损伤是抗体介导的排斥反应（ABMR）的标志性特征，而ABMR是导致移植肾过早丢失的首要原因。肾小球细胞外基质（ECM）重塑和内皮小窝（caveolae）形成是慢性ABMR的重要方面。研究人员发现，半乳糖凝集素-1（galectin-1）——一种与ECM相互作用的免疫调节蛋白——在ABMR患者的肾小球中表达升高，而其基因（LGALS1）在肾小球内皮细胞中经IFNγ刺激后表达下降。ABMR中内皮功能障碍的机制、其与ECM重塑的联系，以及诸如半乳糖凝集素-1等免疫调节蛋白的作用，目前仍未完全阐明。本研究在体外探讨了调节半乳糖凝集素-1对肾小球微血管内皮细胞（GMECs）的影响。研究人员证明，在ABMR肾脏中，半乳糖凝集素-1主要由肾小球内皮细胞表达。为模拟ABMR中内皮损伤的关键方面，研究人员在GMECs中敲低LGALS1，随后用IFNγ刺激，并进行无标记定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。蛋白质组学分析鉴定出5446种蛋白质（FDR<0.01），其中分别有236种、827种和267种蛋白质因LGALS1敲低、IFNγ处理及二者的交互作用而差异表达（FDR<0.05）。LGALS1敲低以及处理间的交互作用均显著改变了黏附蛋白的表达（FDR<0.01），尤其是整合素亚基β5（integrin subunit β5），该结果已得到验证。磷酸化蛋白质组学分析鉴定出2727条磷酸化肽段（FDR<0.01），其中28条在LGALS1敲低、IFNγ处理及其交互作用下差异表达（P<0.01）。在LGALS1敲低、IFNγ刺激或两者兼有的GMECs中，CAVN1的磷酸化及其与伙伴蛋白CAV1的共定位（这对小窝形成至关重要）均有所下降。在肾小球微血管的微流控模型中，向LGALS1沉默的GMECs中添加重组半乳糖凝集素-1可增加内皮通透性并促进促炎细胞因子的分泌。因此，由炎症信号和半乳糖凝集素-1调控的内皮信号通路参与了内皮损伤，并可能影响小窝形成，凸显了半乳糖凝集素-1与ABMR之间的潜在联系。
半乳糖凝集素-1在肾脏内皮细胞中调节细胞黏附、Cavin-1磷酸化与血管通透性——基于蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学与功能学研究的洞察
肾脏疾病是全球性健康问题，影响全球超过14%的人群。肾移植是终末期肾病的最佳治疗手段，但超过50%的移植肾在移植后20年内丢失，其主要原因是抗体介导的排斥反应（ABMR）。ABMR由供体特异性抗体（DSA）靶向移植物内皮上表达的人类白细胞抗原（HLA）所驱动，继而触发补体激活、内皮激活和白细胞募集，最终导致微血管炎症、组织损伤和移植物功能障碍。肾小球细胞外基质（ECM）重塑是慢性ABMR和多种原发肾小球疾病的核心特征，但微血管内皮对这一重塑过程的潜在贡献及其表型变化的驱动因素尚不完全清楚。干扰素-γ（IFNγ）等促炎细胞因子由ABMR移植物微环境中的浸润免疫细胞分泌，可上调内皮细胞Ⅱ类HLA表达，从而在DSA存在时促进抗体介导的损伤。研究人员既往的蛋白质组学分析发现，半乳糖凝集素-1（由LGALS1基因编码）——一种进化保守的碳水化合物结合蛋白——在ABMR肾小球中表达升高，而与其相互作用的ECM蛋白表达下降。半乳糖凝集素-1具有免疫调节功能，可通过与T细胞表面糖蛋白及ECM糖蛋白（如层粘连蛋白和纤连蛋白）相互作用来影响细胞毒性T细胞功能，并调节免疫细胞与内皮及ECM的黏附和外渗。基于此，研究人员假设肾小球微血管内皮细胞（GMECs）是肾小球中产生半乳糖凝集素-1的关键细胞，且LGALS1敲低会改变与内皮细胞黏附和ECM相关的蛋白，并在炎症因子（如IFNγ）存在时导致内皮通透性增加。
为验证这一假设，研究人员对原代人GMECs进行了无标记定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。实验设置四种条件：LGALS1 siRNA+IFNγ、LGALS1 siRNA+溶媒对照、非靶向对照+IFNγ、非靶向对照+溶媒对照，每种条件设3个生物学重复，共12个样本。蛋白质组学实验中，细胞经电穿孔转染siRNA后在融合状态下血清饥饿18小时，再用50 U/mL IFNγ处理24小时；磷酸化蛋白质组学实验则用IFNγ处理30分钟。随后采用LC-MS/MS进行蛋白质鉴定和定量，蛋白质组数据经MaxQuant和Perseus分析，磷酸化蛋白质组数据经MSstatsPTM分析。此外，研究人员还利用成像质谱流式（IMC）分析了3例ABMR移植肾活检组织，通过流式细胞术、免疫荧光、ELISA、Western blot等方法验证关键蛋白表达，并利用微流控AngioPlate平台构建肾小球微血管模型，评估内皮屏障功能和细胞因子分泌。
研究结果分为以下几个部分。第一，GMECs是ABMR移植肾中内源性半乳糖凝集素-1的主要来源。通过分析19例健康活体供肾活检的单细胞RNA测序数据，发现LGALS1主要在内皮和免疫细胞亚群中表达；流式细胞术显示GMECs中半乳糖凝集素-1高表达，而外周血单个核细胞（PBMCs）中表达极低；IMC结果显示，在ABMR活检组织中，半乳糖凝集素-1与CD31阳性的内皮细胞广泛共定位，而与CD45阳性的免疫细胞共染极少。第二，LGALS1敲低后的GMEC表型鉴定。电穿孔递送siRNA可实现约80%的敲低效率，敲低后GMECs分泌的半乳糖凝集素-1蛋白显著减少；但内皮表型标志物（PECAM1、CDH5、VWF）和激活标志物（ACTA2、IL6、ICAM1）的mRNA水平无显著变化，与肾小球滤过屏障相关的蛋白ADGRF5和ESM1表达也保持稳定，说明LGALS1敲低未破坏GMECs的基础内皮特性。第三，IFNγ处理改变免疫系统和ECM相关蛋白。共鉴定出5446种蛋白质，其中827种对IFNγ处理显著差异表达；IFNγ上调免疫系统和干扰素信号通路，下调ECM组织和细胞间相互作用通路。第四，LGALS1敲低增加ECM和黏着斑蛋白表达，并降低IFNγ和免疫反应相关蛋白。236种蛋白质因LGALS1敲低而差异表达；其中表达下降的簇3蛋白（含半乳糖凝集素-1本身）富集于细胞因子和干扰素信号通路，而表达升高的簇1蛋白（包括CD44、PECAM1、PLAU、ITGB1和ITGB5）富集于ECM、黏着斑、整合素细胞表面相互作用和弹性纤维形成等通路。第五，IFNγ刺激与LGALS1敲低协同改变黏着斑和细胞骨架蛋白。267种蛋白质因两者交互作用而显著改变，基因本体（GO）富集分析显示这些蛋白高度富集于ECM组织、细胞黏附、细胞骨架调节、黏着斑、锚定连接和细胞黏附分子结合等生物学过程；蛋白-蛋白相互作用网络显示包括CDH5、CD81、ROBO4和FSCN1在内的多个节点蛋白参与其中，ITGB5和PLAU同时出现在交互作用、LGALS1敲低和黏着斑相关通路的重叠列表中，并通过免疫印迹和表面免疫染色得到验证。第六，磷酸化蛋白质组学揭示细胞骨架组织、内吞和小窝形成相关蛋白的磷酸化改变。共鉴定出2727条磷酸化肽段，28条在比较中显著差异磷酸化；其中CAVN1蛋白的Q6NZI2_S169_S171磷酸化肽段在IFNγ处理、LGALS1敲低及两者交互作用下均显著下降，AHNK蛋白的Q09666_S5752磷酸化肽段显著升高，PIK3C2A蛋白的O00443_S338磷酸化肽段显著下降；免疫荧光显示，IFNγ处理或LGALS1敲低后CAVN1与CAV1的共定位显著减少，提示小窝组装可能受到干扰。第七，在AngioPlate微流控肾小球毛细血管模型中，LGALS1敲低与IFNγ处理共同增加血管通透性。IFNγ单独处理即显著破坏内皮屏障，导致4kDa和65kDa葡聚糖扩散增加；LGALS1敲低单独不改变屏障功能，但与IFNγ存在显著交互作用，加剧4kDa葡聚糖的通透性，并降低VE-cadherin表达。细胞因子分析显示，IFNγ处理和LGALS1敲低均降低GM-CSF分泌，而IFNγ显著增加IL-6和MCP-1分泌。向模型中添加重组半乳糖凝集素-1（r-galectin-1）后，在单独存在时降低通透性，但在LGALS1敲低或IFNγ存在时反而增加通透性，并显著增加IL-6、IL-8、MCP-1和IFNγ等促炎细胞因子水平。
研究结论指出，半乳糖凝集素-1通过整合免疫信号与黏附、细胞骨架组织和血管生成支持，充当肾小球内皮对炎症应激反应的中心调节因子。半乳糖凝集素-1的缺失或失调使内皮表型转向修复受损、通透性增加和炎症细胞因子谱改变，这些过程与慢性ABMR的发病机制密切相关。细胞内半乳糖凝集素-1耗竭与细胞外补充所产生的不同效应凸显了其作用的背景依赖性。靶向半乳糖凝集素-1相关通路或恢复该凝集素下游的内皮修复机制，可能为减轻肾移植及肾小球疾病中的慢性肾小球损伤提供新策略，但需进一步研究证实。该论文发表在《Molecular》杂志上。
