利用携带独特microRNA序列的转基因乳品模型探究膳食microRNA稳定性与功能

《The FASEB Journal》：Investigating Dietary microRNA Stability and Function Using a Transgenic Milk Model With Unique microRNA Sequences

　　

牛奶microRNA被认为在摄食者细胞中具有调控功能。不同物种乳汁富集有望影响免疫、代谢与肠稳态的microRNA。此类microRNA若要在摄食者体内调控基因表达，须耐受消化并以足够水平抵达肠细胞乃至更远组织。学界提出牛奶microRNA通过与乳汁细胞外囊泡（EV）结合而免遭降解，并由EV递送至细胞。然而口服转运与组织生物利用度研究受限于种间序列同源性，难以区分内源与外源microRNA。研究人员利用一头表达四种独特microRNA序列（AmiR）的转基因（TG）奶牛模型，分析AmiR与牛奶EV的关联、对体外消化的抗性，以及在体外Caco-2细胞中AmiR的摄取与调控活性。研究人员在生鲜野生型（WT）与TG牛奶中确认了此前商业（巴氏杀菌）牛奶报道的四种EV群集，并证实其与AmiR及经典牛奶microRNA相关。AmiR对模拟成人消化呈现差异抗性。Caco-2细胞经TG乳汁EV暴露后，未观察到AmiR具有统计学意义的调控效应，提示细胞摄取缺失或无功能。该模型意在于体外分析铺垫后续体内生物利用度研究，借AmiR序列之独特性规避microRNA序列同源性局限。

研究背景与立项依据

膳食除供能外，能否递送具调控功能的遗传物质（尤其是microRNA）仍存在争议。牛奶microRNA富集于免疫、肠屏障与代谢相关通路，其口服跨细胞调控面临三大壁垒：胃肠（GI）消化降解、肠上皮摄取效率、达到足量生物可利用拷贝数。既往研究受限于种间microRNA序列高度同源，难以区分外源摄入与受体内源转录本；染料标记法在体内易脱附造成假阳性。新西兰AgResearch构建的转基因奶牛原用于敲低牛β-乳球蛋白（BLG）以制备低致敏配方，其乳腺特异性表达两种人工microRNA（AmiR-3、AmiR-4）及对应star链（AmiR-3、AmiR-4），这些序列在小鼠与人基因组中不存在，为规避同源性干扰提供理想追踪标签。研究人员以此TG乳为材料，在体外层面对EV分群、消化存活、细胞递送与最低有效拷贝数进行系统量化，为后续体内口服追踪建立方法学基线。

主要关键技术方法

样本来源于一头F1代TG奶牛（#1508）三个时点乳样与三头WT奶牛（#1603、#144、#59）乳样，生鲜冻存。EV分离采用差速超速离心（12 000×g、35 000×g、70 000×g、100 000×g）获四个 pellet 群集（12K、35K、70K、100K）。体外消化采用TNO TIM-1动态四腔（胃、十二指肠、空肠、回肠）系统模拟健康成人2 h液态餐消化。细胞实验以Caco-2报告系统（psiCHECK-2嵌合AmiR-4结合位点于Renilla荧光素酶3′UTR）评估EV递送调控；以HEK293T共转BLG表达质粒与合成AmiR mimic定量抑制BLG蛋白所需最低拷贝数。microRNA绝对定量依托RT-qPCR标准曲线与合成寡核苷酸，外参UniSp2/UniSp6校正提取与反转录效率。

研究结果

3.1 Detection of AmiRs in Transgenic Milk

RT-qPCR与sRNA-seq证实TG脱脂乳中四种AmiR均存在，AmiR-3丰度最高，且整体高于经典milk microRNA（miR-148a-3p、let-7b-5p）；转基因背景改变部分内源milk microRNA相对读数（如miR-99a-5p降十倍、let-7f升四倍），证明外源AmiR插入可扰动内源small RNA生态。

3.2 Isolation and Characterization of EV Populations From Raw WT and TG Milk

TEM、DLS与Western blot（TSG101、ALIX、CD63、HSP70、XDH）确认生鲜WT与TG乳均含12K/35K/70K/100K四类EV，粒径Z-average无组间差异，TG各 pellet 散射计数与蛋白量（12K、70K显著）高于WT，标志分子表达谱一致，说明分群非加工 artifacts。

3.3 Partitioning and Distribution of AmiRs and Classical Milk microRNAs Over the Four EV Populations and Supernatant

绝对定量显示AmiR与miR-148a/let-7b均随离心力升高而递减，12K最富、100K SN最稀，证实AmiR主要锚定于EV（尤12K/35K），与商业乳报道一致。

3.4 In Vitro Simulated Digestion of Transgenic Milk

TIM-1 2 h后effluent存活率分化：AmiR-4留存约10%、AmiR-4与AmiR-3约3.5%、AmiR-3流失>97.3%；经典milk microRNA区间1%（miR-200a）–35%（miR-146b）。绝对拷贝仍达10¹²量级，提示重复摄入可在肠局部累积。

3.5 Assessing the Possibility of TG EV-Mediated Transfer of AmiRs Into Cells In Vitro and AmiRs' Potential Gene-Regulatory Effects

Caco-2携WT或突变AmiR-4 BS报告质粒，接受60 μg TG/WT混合EV孵育，Renilla/Firefly比值无统计显著变化，不支持功能性EV→肠细胞递送在此条件下发生。

3.6 Estimation of the “Effective” Copy Number of AmiRs and Equivalent EV Amount

HEK293T共转BLG质粒与mimic：AmiR-3在50 pM即显著抑蛋白、100 pM抑mRNA；AmiR-4仅100 pM抑蛋白；二者5 nM无协同。推得起效阈值~10⁹拷贝（每细胞~2×10⁴），等价于12K/35K/70K/100K EV分别约100/500/2500/4000 μg——远超Caco-2实验用量，部分解释阴性结果。

讨论部分总结

研究人员指出，序列同源性伪装、食品基质复杂性与标记物漂移是口服microRNA追踪三大技术噪声；生物学层面则需跨越黏液捕获、GI酶解与组织稀释。TG乳模型以“序列唯一性”消去同源性混淆，但本研究仅体外层面完成：EV分群在生鲜乳复现、AmiR消化留存呈序列依赖、Caco-2无显著调控可能源于摄取通路（caveolin-1缺失）与EV用量不足。讨论强调后续须以多动物队列、增补TIM-1重复、换用caveolin阳性肠细胞或免疫GALT细胞、并结合体内口服验证，方能断言milk EV-microRNA是否具生理级调控。

结论翻译

综上，研究人员在生鲜WT与TG牛乳中刻画了不同EV群集，并确认其与经典milk microRNA及AmiR的关联。AmiR在模拟成人消化后仍可检出，支持该TG乳模型作为体内microRNA口服转运研究的宝贵工具。然而TG乳汁EV暴露的Caco-2细胞中未观察到AmiR具有统计学意义的调控效应，提示所测条件下功能性转运极微，值得进一步探究。