MARK4增强氧化应激下应激颗粒形成并促进tau蛋白累积

《FEBS Open Bio》：MARK4 enhances stress granule formation under oxidative stress and increases tau accumulation

　　

微管亲和调节激酶4（MARK4）过度激活被认为参与阿尔茨海默病的发病机制。MARK4促进微管结合蛋白tau的累积，从而增强tau诱导的神经变性。然而，MARK4增强tau累积的潜在机制尚不完全清楚。T细胞胞内抗原1（TIA1）是应激颗粒（SG）形成的关键调节因子，已被认为可启动tau异常。本研究报道MARK4与TIA1协同诱导应激颗粒形成。在哺乳动物培养细胞和原代神经元中，MARK4与TIA1共定位于SG。MARK4抑制TIA1二聚化并在氧化应激下增强SG形成。MARK4与TIA1共表达促进tau累积，而在果蝇模型中敲低TIA1的果蝇直向同源物可抑制tau毒性。这些结果确定MARK4为SG形成的新调节因子，并提示氧化应激与tau病理之间的机制联系。

研究背景与立项依据：微管亲和调节激酶4（Microtubule affinity regulating kinase 4，MARK4）属Par-1家族，可磷酸化tau蛋白微管结合重复区的Ser262与Ser356位点，其过度激活与阿尔茨海默病及多种癌症相关。尽管MARK1–4均表达于脑内并能磷酸化tau相同位点，仅MARK4被遗传关联至阿尔茨海默病且在果蝇模型中增毒效应最强，提示存在MARK4特异的非激酶依赖机制尚未阐明。应激颗粒（stress granule，SG）是由未翻译mRNA、RNA结合蛋白经液液相分离（liquid–liquid phase separation，LLPS）形成的无膜细胞器，瞬时应激下保护细胞，持续存在则与神经退行病相关。含TIA1的SG被特异性关联于tau异常，TIA1过表达促tau寡聚体并加剧PS19小鼠表型，但H₂O₂等活性氧（ROS）会氧化TIA1抑制其成核能力，MARK4如何在此背景下调控SG与tau仍不清楚。该研究即围绕“MARK4是否作为SG组分、是否经TIA1互作在氧化应激下促tau累积”展开。论文发表于《FEBS Open Bio》。

主要关键技术方法：研究使用HeLa细胞与小鼠E15皮层原代神经元（东京都立大学伦理审批A8-003）进行免疫荧光与FRAP（荧光漂白恢复）动态分析；以砷酸钠与1 mM H₂O₂诱导SG，1,6-己二醇消解LLPS验证无膜属性；通过MARK4系列缺失/激酶死突变体定位结构域；Western blotting检测TIA1氧化二聚体与tau总量及pSer262；果蝇采用GMR-GAL4驱动人0N4R tau、UAS-MARK4及Rox8（果蝇TIA1同源）RNAi，羽化后10天作视网膜 lamina 空泡面积定量与头部蛋白印迹，qRT-PCR校验Rox8敲减效率。

研究结果：

MARK4 is a component of stress granules：免疫荧光显示MARK4在HeLa胞质呈点状，与G3BP1、TIA1、FMRP共标，1,6-己二醇消除该点状信号，不与P-body标记DCP1A共标；原代神经元砷酸盐诱导下内源MARK4与G3BP1共定位于SG，确认MARK4为SG组分。

MARK4 preferentially localizes to stress granules induced by oxidative stress：在砷酸盐诱导SG中约50%含MARK4，而1 mM H₂O₂处理下超80% TIA1阳性颗粒含MARK4（卡方检验P<0.001），表明MARK4偏好定位于氧化应激型非经典SG。

The spacer domain in MARK4 is required for its localization to stress granules：catGRANULE预测MARK4 spacer区360–400与580–586残基LLPS倾向高且MARK2无此特征；缺失突变表明MARK4^386–709及全长共标G3BP1，MARK4^1–368或Δ360–400丧失共标，激酶死突变D199A/T214AS218A仍共标，证明spacer区360–400介导定位且不需激酶活性。

MARK4 promotes stress granule formation：MARK4过表达提升含SG细胞比例与SG密度（Student t检验P<0.01），FRAP显示mCherry-MARK4降低EGFP-TIA1在SG内恢复率，SG流动性下降；MARK4^1–368及激酶死突变不再促SG形成，说明定位于SG且具激酶活性是促形成前提。

MARK4 reduces TIA1 oxidation：1 mM H₂O₂处理促TIA1氧化二聚（ox-TIA1），MARK4共表达抵消该二聚化（ANOVA Tukey P<0.05），即MARK4在氧化应激下保护TIA1免于氧化并维持其成核功能。

MARK4 and TIA1 synergistically increase tau protein levels：HeLa中单转MARK4或TIA1不升tau总量，共转则总tau与pSer262-tau显著升高（P<0.0001）；共转不升TDP-43（反降），提示通路特异；激酶死MARK4+TIA1不累积tau；S2A与S2E突变tau仍被MARK4+TIA1累积，但S2E背景下TIA1协同更显著；MARK4^1–368+TIA1亦升tau，说明协同非靠SG内直接结合tau，而是塑造促累积胞内环境。

Roles of tau phosphorylation in tau accumulation caused by TIA1 and MARK4：磷酸化位点非累积必需但影响TIA1协同幅度，MARK4激酶活性和TIA1共同促成条件。

Knockdown of TIA1 suppresses tau-induced neurodegeneration in Drosophila：果蝇视网膜炎模型下Rox8 RNAi经qRT-PCR确认敲减，H&E切片lamina空泡面积在tau+对照组显著大于tau+Rox8 RNAi（P<0.0001），在tau+MARK4背景下敲Rox8亦减轻变性（P<0.05），但头部tau总量与pSer262未变，说明Rox8作用于毒性阶段而非蛋白丰度。

讨论与结论翻译：MARK4除作为tau激酶外，是其特异入SG并调控氧化应激下SG动力学的新因子，MARK2不入SG解释其家族内增毒差异。MARK4降低TIA1在SG内流动性、抑制H₂O₂介导TIA1氧化二聚，从而在氧化应激下维持SG成核，SG持续与低流动性利于tau寡聚早期事件。果蝇Rox8敲减缓解tau神经变性呼应PS19小鼠中Mark4缺失与TIA1降低的保护效应，确立MARK4–TIA1功能轴。结论为：MARK4是SG组分与新调节因子，经spacer区LLPS倾向入SG，凭激酶活性与抑制TIA1氧化在H₂O₂应激下促SG形成并和TIA1协同促tau累积，果蝇中TIA1同源物Rox8敲减抑制tau毒性，该轴连接氧化应激与tau病理，MARK4作为可成药靶点具神经退行与肿瘤干预潜力。