《Oil Crop Science》：Research progress on the structural and functional properties of rapeseed protein
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总结了菜籽蛋白（rapeseed protein, RP）结构与功能特性的影响因素及其潜在机制；总结了不同提取方法对RP营养价值、结构及功能特性的影响；分析了RP当前的应用现状，并对其未来应用方向进行了展望。
总结了菜籽蛋白（rapeseed protein, RP）结构与功能特性的影响因素及其潜在机制；总结了不同提取方法对RP营养价值、结构及功能特性的影响；分析了RP当前的应用现状，并对其未来应用方向进行了展望。
1. 引言
菜籽（Brassica napus L.）属于十字花科油料作物，是全球最重要的油料作物之一。2024年中国菜籽产量达1580万吨，为世界第三大生产国。菜籽粕是菜籽榨油过程中的主要副产物，目前国内大部分菜籽粕用于动物饲料和肥料，资源综合利用率较低。实际上，菜籽粕富含蛋白质（干基约30%–50%），氨基酸组成均衡，亮氨酸和赖氨酸等必需氨基酸含量较高，具有显著的营养与功能潜力。研究表明，菜籽蛋白（RP）表现出抗氧化、抗炎、支持肌肉生长等生物活性。RP的应用既依赖其营养含量，也依赖其功能特性，而这些特性与其结构密切相关。未来食品工业可能在肉类替代品、烘焙食品、饮料、双蛋白产品和功能性食品等领域更广泛地采用RP。全球蛋白质需求日益增长，植物蛋白被视为关键解决方案，相较于动物蛋白，其成本更低、营养价值更高、温室气体排放更少。然而，对RP结构特征、功能特性以及提取方法影响质量的系统性综述仍较少。本综述系统介绍了RP的结构表征分析方法，总结了功能特性的最新研究进展，重点讨论了提取工艺对蛋白质质量的影响，并探讨了当前应用现状，旨在为其未来高值化利用提供理论依据。
2. 菜籽蛋白的蛋白质营养
2.1 蛋白质组成与营养价值
菜籽粕中的蛋白质主要为贮藏蛋白。根据溶解性差异，菜籽蛋白可分为清蛋白（溶于水）、球蛋白（盐溶液提取）、谷蛋白（碱性条件溶解）和醇溶蛋白（乙醇水溶液溶解）四类。谷蛋白和醇溶蛋白均富含谷氨酰胺和脯氨酸，其链的N端和C端具有相似序列和结构域。菜籽粕中已鉴定出380种蛋白质，其中十字花科蛋白（cruciferin）约占总蛋白的60%，油菜籽蛋白（napin）约占20%，油体蛋白（oleosin）约占2.8%，后者对稳定油体防止聚结起关键作用。此外，RP还含有脂质转移蛋白（LTP），这是一种具有优良起泡特性的碱性蛋白。
2.2 氨基酸组成与营养价值
RP的总必需氨基酸含量为36.76%，与大豆蛋白相当，显著高于花生蛋白。RP富含亮氨酸、赖氨酸和缬氨酸等支链氨基酸，这些氨基酸有助于机体蛋白质合成和肌肉生长发育。赖氨酸的存在还能增强凝胶特性，改善蛋白食品的质地。RP中半胱氨酸含量较高，不仅赋予其抗氧化活性，还在多种代谢过程和免疫功能中发挥积极作用。RP的蛋氨酸含量较低，但能满足人体膳食必需氨基酸需求。其蛋白质效率比（PER）为2.64，优于大豆蛋白，适合作为高蛋白食品和补充剂的植物基原料。
3. 菜籽蛋白的结构
3.1 蛋白亚基组成
菜籽中的两种主要蛋白cruciferin和napin均属于种子贮藏蛋白。Cruciferin分子量为300–350 kDa，在pH低于8时溶解度有限。其单亚基为51–55 kDa，结构上形成由两个三聚体连接的六聚体，有时也可形成约420 kDa的八聚体桶状结构。亚基数目在6–8之间变化，对离子强度和酸度敏感，在酸性胁迫或低盐条件下易发生解离。天然形式的等电点（pI）约为7.2，去除不溶性组分后降至约5.7。成熟亚基大小48–56 kDa，pI约为4.6，每个亚基由酸性α链（约40 kDa）和碱性β链（约20 kDa）通过二硫键连接。α链含254–296个氨基酸，β链含189–191个氨基酸，疏水残基主要聚集在β链。Napin分子量高度异质，范围为4–21 kDa。其摩尔质量随pH变化，pH 4时约为1.0×10 g/mol，pH 10时升至约4.0×10 g/mol。Napin在pH 6–10范围内水分散性良好。结构上，napin形成二聚体，由紧密的α链（约4 kDa）和延伸的β链（约10 kDa）通过两个二硫键连接，β链内部另有链内二硫键使其三级结构刚性增强。目前已发现六个napin异构体，均具有高水平的氨基酸酰胺化，pI约为10，尺寸小于2 nm，与其强热稳定性密切相关。疏水斑块不对称地聚集在分子一面上。
3.2 蛋白质的一级和二级结构
菜籽粕中的napin和cruciferin并非结构均一的单一蛋白质，而是由多种氨基酸序列或亚基组成构成的蛋白家族。从RP水解物中已鉴定出通过调节LDLR-PCSK9途径降脂的肽EFLELL，以及具有强ACE抑制活性的短肽VSV和FL。来源于RP的生物活性肽具有正向免疫调节作用，富含脯氨酸和甘氨酸的肽段活性尤为明显。此外，由2–20个氨基酸残基组成的低分子量肽也被发现可通过多种生理功能支持肠道健康。蛋白质二级结构由氢键维持，主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角、反平行构象和无规卷曲。菜籽主要贮藏蛋白的结构差异明显：cruciferin以β-折叠为主，napin则以α-螺旋为主。Napin的二级结构约含37% α-螺旋和11% β-折叠，且构象稳定性极强，能耐受提取和工业加工。一般而言，植物蛋白比动物蛋白含有更多β-折叠和更少α-螺旋。对菜籽与大麻蛋白混合物进行挤压加工后，β-折叠含量在31.0%–38.3%之间，为主要结构。
3.3 蛋白质的三级和四级结构
三级结构是蛋白质在二级结构基础上折叠形成的最终构象，由氢键、二硫键和疏水相互作用维持，其中疏水效应通常是主导因素。游离巯基和非蛋白组分对三级稳定性具有调节作用，将游离巯基氧化为二硫键可增强蛋白质结构完整性。天然条件下，cruciferin在完整种子内组装为六聚体，但加工或提取后高级组装趋于解离为单亚基。Napin由二硫键连接两条肽链，但其自身不能形成四级结构。因此，总体而言，菜籽蛋白并不呈现典型的四级结构特征。
4. 蛋白质提取方法对菜籽蛋白质量的影响
为最大限度地从菜籽粕中回收蛋白质并推动其实际应用，需获得高蛋白浓度的分离物。现有提取技术可分为三类：单一提取法、辅助强化提取法和顺序分级法。单一提取法包括碱溶、盐析、乙醇沉淀、深共晶溶剂处理、等电沉淀、静电分离和逆流电泳分级，但其蛋白质回收率通常较低，一般在30.00%–52.89%之间。为提高回收率，发展了酶辅助、超声辅助、脉冲电场辅助、高压辅助和高静水压辅助等强化提取策略，可将蛋白质回收率提升至74.00%–78.85%。顺序分级法旨在进一步降低RP分离物中植酸等抗营养因子含量，同时提高食品安全性和营养质量，例如碱提取结合等电沉淀。弱酸性盐提取结合超滤获得的蛋白质制剂不仅抗营养因子水平较低，且具有良好的消化率和功能特性。等电沉淀基于蛋白质在等电点（pI）时净电荷为零、溶解度最低的原理。碱提取-酸沉淀可获得最高蛋白质收率，可达78.85%，但易造成蛋白质结构损伤和功能特性劣变。相比之下，深共晶溶剂提取和酶辅助提取不仅蛋白质收率较高，还能更好地保留营养价值，所得提取物结构完整性和消化率较高。超声辅助提取对改善RP整体功能特性最为显著，适合高价值蛋白产品开发。盐析、脉冲电场辅助和高压辅助提取能有效保持RP结构完整性，适用于对蛋白质构象要求高的应用。弱酸性盐提取在氨基酸组成方面具有优势，营养均衡，适合开发营养强化食品。总体而言，超声辅助、酶辅助和脉冲电场辅助等绿色提取技术能够在提取率、营养保留和功能性能之间实现良好平衡。
5. 菜籽蛋白的功能特性
5.1 溶解度
蛋白质溶解度受表面疏水性、表面电荷分布、离子强度、空间构象和体系pH等共同影响。表面疏水性和电荷差异可调节疏水相互作用强度，进而影响RP分子间作用力；离子的存在增强蛋白质-水相互作用，有利于提高溶解度。Cruciferin溶解度相对较低，主要因其分子尺寸大、构象紧凑且非极性氨基酸残基含量高。RP溶解度随pH呈U形变化，在pH 3附近溶解量最大；向等电点移动时，阳离子蛋白与阴离子植酸形成不溶性复合物，溶解度逐渐下降；继续碱化则使RP变性解折叠，暴露更多极性侧链，同时表面净电荷增加，静电排斥增强，溶解度恢复。高纯度通常与更高溶解度相关。超滤法所得RP较等电沉淀法含更少非蛋白杂质（尤其是植酸），在pH 5–9范围内溶解度可达90%以上，而等电沉淀产物溶解度仅26.4%。中性pH下热处理会引起RP变性和聚集，降低溶解性。此外，提取方法如酶辅助、反胶束、高压、脉冲电场等也共同影响溶解度。
5.2 水合与脂肪结合特性
吸水能力（WAC）和吸油能力（OAC）分别指每克蛋白质材料所持有的水或油量，对食品质构和感官特性至关重要；持水能力（WHC）和持油能力（OHC）则分别决定蛋白质与亲水或亲脂基质的相容性。WAC主要源于蛋白质极性基团与水分子间的氢键作用，OAC则主要归因于蛋白质非极性侧链与油脂烃链间的疏水相互作用。因此，WAC和OAC分别随蛋白质中亲水极性基团和非极性氨基酸残基含量的增加而升高。去除RP中的酚类化合物会使蛋白质结构更刚性，降低其结合水和油的能力。酸性条件下RP表面净电荷增加，增强静电相互作用，提供更多水结合位点并促进多孔基质形成，从而显著增加水结合机会。高酸条件下RP结构展开或重排，暴露更多疏水基团，显著增强OAC。WAC与OAC的比值可作为评价蛋白质配料适用性的参考指标。静电相互作用能增强水分子与RP的相互作用，同时促进蛋白质间的分子间缔合，有效改善WHC。酸化和碱化可诱导RP结构重排，进而影响其WHC和OHC。微波或脉冲电场辅助处理可同时提高RP的WHC和OHC，而表面疏水性增加和更多二硫键则倾向于降低WHC。
5.3 乳化特性
乳化能力（EC）指蛋白质迁移至油-水界面并稳定不相容相的能力，通常用乳化活性（EA）和乳化稳定性（ES）评估。EA主要受表面疏水性和带电状态控制，ES则取决于分子柔性、尺寸、表面疏水性和电荷等因素的相互作用。蛋白质作为表面活性物质，可在乳液界面重排形成蛋白膜，降低液滴聚结速率，维持乳化状态。Napin由于分子尺寸小、净电荷低且具有亲水/疏水两亲性，在油-水界面竞争中常占优势，但其稳定的乳液易发生乳析。Cruciferin可通过非共价相互作用在napin层外形成次级界面层，芥子酸浓度较高时有利于该附加层的形成，从而增强界面膜的粘弹性，提高乳液稳定性。液滴尺寸是评价蛋白质乳化能力的重要间接指标。RP聚集可引起液滴簇拥和桥联，不利于乳化稳定性。提高RP在油-水界面的扩散、构象重排和穿透速率可促进界面膜形成，提升乳化活性；界面膜内氢键网络有助于维持结构完整性，从而提高乳化稳定性指数。RP的乳化活性、稳定性和溶解度随pH呈U形变化，在等电点附近最低；高酸或高碱条件下RP结构展开，增加分子柔性，改善乳化性。电解质或酶处理可将RP降解为小分子肽片段，增大比表面积，促进与脂相相互作用，增强乳化性能。α-环糊精能与疏水基团形成包合物，提高乳化剂溶解度并促进油滴表面稳定保护膜形成，从而提升乳化能力和乳液稳定性。反胶束提取、微波辅助、超声辅助、亚临界水提取、脉冲电场辅助等方法均可增强RP乳化能力。超滤所得蛋白质比等电沉淀分离物乳化能力更高，因为超滤能有效去除RP中的盐分。储存期间，低温、适度热处理和适当光照可增强乳化性，但延长储存时间会逐渐降低乳化能力。
5.4 起泡特性
蛋白质能在空气-水界面快速吸附并形成粘弹性膜，即泡沫。常用起泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS）评价。RP起泡特性具有浓度依赖性，当蛋白质质量分数超过0.2%时可达到最小气泡尺寸；提高至1%时形成界面膜，延伸性较大但刚性较低；而稀释至0.01%时体系形成高粘弹性的类固体界面，但泡沫易塌陷。表面电荷特征对植物蛋白起泡潜力至关重要，净电荷积累的减少可削弱静电排斥，促进界面层形成与维持。蛋白质结构中较高的巯基和疏水性氨基酸残基含量会提高平均疏水性和表面疏水性，从而增加泡沫体积，但表面疏水性对构象变化敏感，且相比静电特性或粒径分布的影响较小。RP中不同蛋白组分的起泡特性差异明显。Napin因适中的分子尺寸、受限的净表面电荷、较高的水溶性和明确的两亲结构，在泡沫产生和长期保持方面表现优良；Cruciferin则具有更出色的泡沫结构保持能力。含75%（w/w）cruciferin和25%（w/w）napin的混合配方具有协同效应，相较于单一组分显著提高起泡能力和泡沫稳定性。RP的起泡性受加工参数和提取方法影响。pH为3时起泡能力和泡沫稳定性最高，这归因于酸性条件下蛋白质表面净电荷较高，抑制聚集并促进蛋白质-溶剂相互作用。特定热处理会降低泡沫稳定性，其中napin组分受影响较大，而cruciferin通过增加界面疏水相互作用增强泡沫稳定性。酶解处理可提高RP起泡能力但降低泡沫稳定性。脂质含量也是重要因素，在稀蛋白体系中，脂肪削弱界面分子间缔合，形成较大气泡，损害泡沫产生和保持；在高浓度蛋白体系中脂质干扰较小，但过高脂质可能导致桥联现象。超声和微波辐射破坏RP天然构象，将蛋白质分解为更小肽段，降低起泡能力；反胶束体系、微波辅助、亚临界水提取、高压加工和脉冲电场技术则被证明可改善RP的起泡特性。
5.5 凝胶特性
RP可在多种条件下构建凝胶网络，按形成机理分为热诱导凝胶和冷诱导凝胶。热致凝胶通常在pH 5–9、80–120 °C条件下形成，主要通过疏水相互作用构建三维网络，氢键和二硫键维持凝胶结构的完整性和稳定性。冷致凝胶则在常温下通过盐添加或酸化至等电点触发，以离子交联方式形成弹性三维网络。凝胶强度通常从宏观性质角度评价，包括凝胶表面形貌观察、流变行为分析和力学性能测定。pH、温度、蛋白质提取方法、纯度、酶作用和离子相互作用均显著影响RP凝胶强度。高pH促进RP去折叠，高温增强蛋白质与其它分子的相互作用，从而有利于形成高强度凝胶。就提取方法而言，使用氯化胆碱-尿素提取的RP纯度达95.8%，在蛋白质浓度16%时可形成稳定凝胶；而碱提取和弱酸性甜菜碱-柠檬酸提取所得蛋白质纯度分别为86%和70.3%，但仅在14%蛋白质浓度下即形成稳定凝胶，表明较低纯度可能在某些条件下表现出较高凝胶效率。pH对napin主导的颗粒凝胶影响显著：pH 9时加热促进大量二硫键形成，产生致密大孔结构的稳定napin凝胶；pH 5和7时加热未能诱导足够二硫键形成，凝胶网络强化受限。在cruciferin主导的凝胶体系中，pH 5、7、9时强静电排斥和高负电荷密度有利于形成厚孔壁凝胶；pH升至11时RP变性，二硫键断裂，但形成的凝胶强度仍高于颗粒凝胶体系。酶处理可改变RP凝胶微观结构，如用alcalase处理后凝胶从大孔网络逐步变为小孔网络，聚集体尺寸减小，呈现海绵状结构。钾离子与乙酸存在协同作用，有助于RP凝胶化。通过控制酸化或碱化物质的种类和浓度，可有效调节RP凝胶的流变和结构特性，满足不同食品质构需求。
6. 菜籽蛋白的应用
不同加工方法获得的RP具有多样化应用。发酵菜籽粕可显著提高蛋白质含量并高效降解抗营养因子，扩大其在人类食品和动物饲料中的用途。发酵策略分为微生物发酵、酶处理及两者结合的联合方法。常用微生物包括枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母和黑曲霉；常用酶包括alcalase、纤维素酶、过氧化氢酶和漆酶。联合发酵优于单一方法，可提高RP消化率并更有效地降解抗营养因子。例如，利用碳水化合物水解酶和植酸酶在优化条件下处理菜籽粕，可获得富蛋白上清液和高纤维沉淀，实现高溶解性蛋白质提取、膳食纤维回收、抗营养元素去除以及芥子碱等功能性酚类物质的保留。发酵菜籽粕蛋白主要用于动物饲料，添加于鸡、兔、猪、鱼等日粮中可改善肠道吸收、提高营养消化率、调节脂质代谢并维持肠道菌群稳定。乙醇提取菜籽粕可获得芥子碱、芥子酸、咖啡酸、丁香酸等生物活性组分，这些成分具有较强的抗氧化能力和DNA保护功能，其中芥子碱含量最高。芥子碱对乙酰胆碱酯酶具有明显抑制作用，抑制率可达85%，提示其在神经退行性疾病治疗中的潜在用途。此外，菜籽粕乙醇回流提取物在酸性介质中可作为阴极腐蚀抑制剂，通过静电相互作用和配位键在金属表面形成致密复合膜，抑制效率可超过90%。其吸附行为在单氯乙酸和二氯乙酸介质中符合Langmuir吸附等温线，在三氯乙酸介质中则随温度变化符合不同模型。在RP基质中加入明胶可提高最终膜的力学性能。通过多步分离获得RP组分，并经混合作业和交联改性后可制成具有抗氧化能力的可食性膜。对菜籽粕进行酸碱热预处理后，辅以间歇超声或高压微流化处理，可制备出平均液滴尺寸低于500 nm、具有高负ζ电位和良好分散稳定性的高内相乳液，在化妆品、制药和食品领域具有应用前景。
7. 结论与展望
本综述系统考察了影响RP结构特征和功能特性的多种因素，特别关注温度、pH和发酵等参数对蛋白质构象的影响，分析了离子强度、表面电荷分布和蛋白质组成在决定功能性能中的作用，同时评估了不同提取方法对RP营养概况、构象完整性和技术功能性的影响。国际上，植物育种与加工创新相结合已实现RP-纤维浓缩物的商业化生产，并获得欧洲食品安全局的安全批准；而中国的RP提取和加工技术仍相对不发达，现有提取程序虽可获得较高蛋白质回收率，但所得分离物难以同时满足安全、营养和功能标准。目前关于油籽预处理和榨油条件对RP结构和功能特性的影响研究有限，限制了高品质RP产品的开发。加工变量如温度、pH和压力对RP结构属性有显著影响，但其对蛋白质安全、分子构象和功能性能的具体影响仍需更充分表征。未来研究应侧重于开发新型环境友好技术，从菜籽中同步高效回收油和蛋白质，同时减少抗营养因子，保持RP结构完整性和功能特性。基于RP核心框架的复杂性，未来可优先应用靶向切割酶结合电泳分级技术分离具有不同生理活性的功能肽，以扩展RP在食品、制药及营养健康领域的应用范围，从而支持植物基食品系统的发展，并保障优质植物蛋白供应链安全。
