基于碳纳米管（CNTs）敏化技术的光纤生物传感器，用于多柔比星浓度检测

《Optical Fiber Technology》：Optical fiber biosensor based on CNTs sensitization for doxorubicin concentration detection

　　•开发了一种高灵敏度的光纤表面等离子体共振（SPR）传感器，用于检测多柔比星（doxorubicin）。•对碳纳米管（CNTs）进行改性后，传感器的折射率（RI）灵敏度提高了约60%。•通过对多柔比星适配体（aptamer）进行功能化处理，实现了对多柔比星的特异性检测。•该传感器具有0––200 μM的宽线性检测范围和0.232 nm/μM的高灵敏度。

1. 引言
随着全球癌症发病率的持续上升，癌症已成为人类死亡的主要原因之一。其核心病理特征在于其多方面的破坏性：不仅会扰乱细胞代谢和微环境，还会侵蚀组织完整性，最终导致器官衰竭[1]。多柔比星（DOX）作为一种蒽环类抗生素，可以通过干扰DNA功能和诱导自由基产生来杀死癌细胞。它常与其他化疗药物联合使用，用于治疗多种类型的癌症[2]、[3]。然而，DOX在临床应用中存在剂量依赖性的副作用，包括累积性和不可逆的心脏毒性，以及由于骨髓抑制导致的血细胞生成减少[4]、[5]、[6]。因此，开发一种简单、快速且灵敏的方法来检测体液中的DOX至关重要。
目前，已有多种方法可用于测量人体液体中的DOX浓度，包括高效液相色谱（HPLC）[7]、[8]、电化学方法[9]、[10]和光学检测技术[11]、[12]。其中，HPLC具有高灵敏度的优势，但也存在仪器成本高、操作复杂以及操作技术要求严格等缺点。虽然电化学检测方法具有较好的特异性和快速响应性，但容易受到外部环境的干扰。光学检测方法主要包括荧光光谱[12]、[13]、分光光度法[14]和表面等离子体共振（SPR）[15]、[16]、[17]。例如，2024年Polat等人基于铜纳米簇（CuNCs）开发了一种用于生物液体中DOX定量检测的荧光传感器，但其狭窄的线性检测范围限制了其在高浓度样本中的应用[18]。2022年Sikora等人报道了一种基于紫外-可见光谱（UV–Vis）的快速DOX定量检测方法，该方法虽然具有成本效益高、响应快和操作简单等优点，但由于灵敏度低和选择性验证不足，其实际应用受到很大限制[6]。
相比之下，光纤SPR检测技术结合了上述传感器的高灵敏度和实时响应性，同时还具备无标记检测和灵活结构的特点[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。因此，近年来受到了广泛关注，被认为是实现高精度和便捷多柔比星检测的理想技术途径。例如，Wang等人提出了一种通过二维金属有机框架（2D MOF）增强的SPR传感器，能够在1 nM至10 μM的范围内检测DOX[15]。然而，传统光纤SPR传感器的制备复杂性、设备成本、灵敏度、目标分子特异性识别以及结构设计仍有改进空间，其综合传感性能需要进一步提升。
基于上述问题，本文报道了一种使用多模光纤（MMF）和单模光纤（SMF）反射SPR结构的光纤传感器。通过在光纤传感区域依次修饰多壁碳纳米管（CNTs）、金膜和DNA适配体，实现了对DOX的高性能检测。其中，CNTs由于具有促进电荷转移和在紫外-可见光区域强π-π等离子体吸收的能力，可以增强电磁场并有效放大SPR信号[26]、[27]；DNA适配体可以提高与目标分子的亲和力，减少生物分子的非特异性吸附，从而显著提高传感器的选择性[28]、[29]。此外，所提出的MMF-SMF反射结构具有制备工艺简单和成本低廉的优点，有利于实际推广。因此，该传感器为高灵敏度和特异性检测DOX提供了可靠手段。

2. 方案设计与原理分析
2.1. 系统设计与传感原理
本实验使用的实验系统如图1所示，包括宽带光源、光谱仪、计算机、1×2 Y型耦合器和探针。光源的光通过跳线及耦合器引导至传感探针，在探针端面调制后，携带传感信息的反射信号通过同一耦合器返回，再通过另一跳线引入光谱仪进行分析和记录。
图1. 实验系统示意图。
本文使用的传感探针是一种由MMF和SMF组成的反射结构，其中SMF和MMF的芯径分别为8.2 μm/125 μm和105 μm/125 μm，SMF传感区域的长度为3 mm。在这种结构中，MMF作为前端部件，负责高效接收和传输来自宽带光源的光能。SMF作为传感区域，其优势在于能够激发出一个轮廓清晰、信噪比高的单一SPR共振峰，从而对折射率的微小变化产生显著响应，有效提高检测灵敏度和准确性。SPR效应的基本原理如下：当光传播到涂有金属薄膜的光纤区域时，会穿透一小段距离形成衰减波，该衰减波与金属薄膜表面的电子相互作用，若入射光波长满足共振条件，则会激发表面等离子体波，产生SPR现象，导致反射光谱中特定波长的光能量显著吸收，形成共振吸收峰。对于所提出的反射型MMF-SMF结构，入射光通过MMF耦合到镀金SMF传感区域，激发的SPR信号以反射光的形式返回进行光谱检测。
当样品中含有DOX时，固定在光纤表面的适配体会选择性地与DOX分子结合，引起共振波长变化。因此，通过观察共振波长的变化，可以定量检测样品中DOX的浓度。

2.2. 适配体与多柔比星的分子对接模拟
多柔比星特异性适配体的序列为5’-NH2-ACC-ATC-TGT-GTA-AGG-GGT-AAG GGG-TGG-T。使用AutoDock进行了分子对接模拟，显示了DOX与适配体之间的结合相互作用（见图2(a)）。可以看出，DOX被适配体的折叠结构包裹，形成了一个“口袋”。结合能为-8.3。为理论证明DOX分子与其DNA适配体之间的选择性结合，模拟并分析了适配体与多种潜在干扰物质之间的结合能（见图2(b)）。适配体对DOX表现出高结合亲和力（特异性识别），而对其他干扰物质的结合亲和力为中等或较弱。模拟结果表明，DNA适配体能够特异性识别DOX。

3. 材料与方法
3.1. 材料与试剂
本文使用的材料与试剂包括：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、11-巯基十一酸（MUA）和多柔比星（DOX），均购自Aladdin公司；硅烷偶联剂KH560由Yuanye（上海）提供；DOX适配体和TE缓冲液由Sangon Biotechnology公司生产；氨基化碳纳米管（外径7–15 nm，内径2–5 nm，长度7–15 nm）购自南京Carbon Search纳米材料科技有限公司。选择性检测所用试剂包括四环素、L-半胱氨酸、氯霉素、葡萄糖和L-组氨酸。其中，氧四环素、四环素和氯霉素购自上海Aladdin，L-半胱氨酸购自中国北京Sinopharm，无水葡萄糖和L-组氨酸购自Macklin。
碳纳米管溶液的制备：将购买的氨基化碳纳米管粉末溶解在去离子水中，配制成5 mg/ml的溶液，进一步超声处理8小时，置于4°C的避光环境中保存以备后续使用。使用前需用磁力搅拌器搅拌0.5小时以确保均匀分布。

3.2. 传感探针的制备与光纤表面功能化
传感探针的制备主要包括光纤的熔接、碳纳米管的修饰、镀金 films的制备以及DOX适配体的功能化（见图3）。为提高传感器灵敏度，我们首先在表面镀金前用碳纳米管层修饰裸光纤。具体实验步骤如下：首先用去离子水冲洗裸光纤结构，然后将其浸入硅烷偶联剂KH560溶液中12小时，使其表面引入环氧基团；接着将探针浸入碳纳米管溶液（5 mg/mL）中较长时间，利用环氧基团与碳纳米管表面的氨基团之间的共价反应实现碳纳米管在光纤表面的均匀牢固固定；最后用去离子水清洗光纤表面以去除多余的碳纳米管。
图3. 碳纳米管修饰及DOX适配体功能化的示意图。
为了激发SPR现象，需在经过碳纳米管修饰的光纤传感区域镀上一层金膜，使用离子溅射仪器进行镀金，溅射时间为2分钟20秒。
DOX适配体的功能化：首先将预先镀金的SPR传感探针浸入50 mM MUA溶液中12小时，在此过程中，MUA分子末端的巯基（–SH）与金表面形成Au-S键，牢固结合形成有序的单层结构，并暴露其羧基（–COOH），为后续分子提供结合位点；随后将探针浸入EDC和NHS的混合溶液中40分钟，激活MUA上的羧基，提升其与氨基的反应效率；最后将传感探针浸入DOX适配体溶液中12小时，此时激活的羧基与适配体末端的氨基发生胺化反应，形成强共价键。

4. 结果与讨论
4.1. 碳纳米管修饰时间的优化
首先研究了未经镀金的金涂层光纤SPR传感器的折射率灵敏度。为优化碳纳米管的改性效果，研究了0–8小时内不同碳纳米管修饰时间对灵敏度的影响（见图4）。在0–6小时内，灵敏度总体呈上升趋势，并在6小时达到峰值，表明较长的修饰时间有助于形成更密集、更均匀的碳纳米管层，从而更有效地增强SPR信号；但超过6小时后，灵敏度开始逐渐下降，可能是由于修饰时间过长导致碳纳米管层过厚，进而引起光传输损失，减弱SPR效应。因此，碳纳米管的最佳修饰时间为6小时。

4.2. 多柔比星检测结果
4.2.1. 灵敏度
随后进行了DOX浓度检测。将经过碳纳米管修饰并用DOX适配体功能化的光纤SPR传感器依次插入浓度为0–400 μM的DOX溶液中。当传感器插入DOX溶液时，SPR光谱可见显著的红移现象，随后逐渐稳定。取出传感器并浸入去离子水中约10秒以洗脱未结合的DOX分子，再将传感器插入下一个浓度的DOX溶液中，重复上述步骤直至测试完所有溶液。从该实验中获得的反射光谱显示在图5(a)中，通过处理其谷值数据点，可以得到图5(b)。下载：下载高分辨率图像（471KB）下载：下载全尺寸图像

图5. (a) 不同浓度下DOX的SPR反射光谱。(b) DOX浓度的非线性拟合曲线。(c) DOX浓度的线性拟合曲线。(d) 线性范围内DOX浓度? SPR反射光谱。

最初，共振波长与分析物浓度呈现出近似线性的关系。随后，当传感器上几乎所有的DOX结合位点都被占据时，共振波长随浓度的变化不再显著。通过对部分数据进行线性拟合，线性区间大约为0–200 μM，DOX的灵敏度为0.232 nm/μM。图5(c)显示了其线性拟合图，图5(d)显示了其SPR反射光谱。

4.2.2 稳定性

为了检验传感器的稳定性，将传感器探针放置在TBS缓冲液（0 μM）、300 μM DOX溶液和500 μM DOX溶液中50分钟，期间记录SPR光谱信号。图6表明，传感器在TBS溶液、300 μM DOX溶液和500 μM DOX溶液中均保持稳定，最大波长波动为0.245 nm，波长波动偏差为0.366 nm。这种轻微的波动可能是由于光谱仪分辨率的限制和光源强度的不稳定性造成的。由于这种波动导致的DOX检测不确定性为1.05 μM，可以忽略不计，这表明该传感器在实际样本中检测DOX具有潜力。

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图6. (a) TBS缓冲液中的稳定性结果；(b) 300 μM DOX溶液中的稳定性结果；(c) 500 μM DOX溶液中的稳定性结果。

4.2.3 响应时间

为了评估传感器对DOX溶液的动态响应特性，将探针浸入300 μM DOX溶液中40分钟，期间记录SPR光谱信号，如图7所示。可以看出，探针浸入溶液后，SPR共振谷立即发生红移，并在一段时间内持续变化，最终达到稳定状态。整个过程共花费了15分钟，表明传感器的响应时间为15分钟。

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图7. 响应时间实验结果。

4.2.4 检测限

根据上述实验获得的数据，检测限（LOD）计算如下：
(1) LOD = 3σ/S

其中，σ表示探针的标准偏差，S表示灵敏度[31]。传感器在缓冲溶液中的标准偏差变化为σ = 0.348 nm，灵敏度为S = 0.232 nm/μM，因此检测限计算为4.49 μM。这一结果验证了所提出的传感器具有足够的检测精度，适合进行初步临床筛查，为个性化给药策略提供了实际支持。

4.2.5 特异性

为了评估传感器在复杂检测环境中检测DOX浓度的准确性，选择了某些抗生素和血液中的几种常见物质作为干扰物质进行选择性实验，包括四环素、L-组氨酸、L-半胱氨酸、葡萄糖和氯霉素。将这些物质制备成500 μM的溶液，并使用共振波长变化作为响应指标来测试传感器对不同分析物的响应。值得注意的是，这个浓度远高于这些物质在生理状态下的典型水平，以严格证明所提出传感器的选择性。测试结果显示在图8中，传感器对目标DOX有显著的波长变化，而对其他干扰物质的响应远低于对DOX的响应。这表明传感器具有良好的选择性，具有在实际血浆/血清样本中检测DOX浓度的潜力。

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图8. 选择性测试结果。

5. 结论

本文提出了一种基于MMF-SMF反射纤维的DOX传感器。首先，通过在纤维表面引入碳纳米管（CNTs），传感器的灵敏度从1794 nm/RIU提高到了2867 nm/RIU。随后，使用自组装单层技术将DOX适配体共价固定到金膜表面，实现了传感界面的功能修饰。实验表明，在0–200 μM的浓度范围内，传感器对DOX的灵敏度为0.232 nm/μM，检测限为4.49 μM，并且具有良好的稳定性和选择性。这为临床实践中实时追踪血液中DOX水平提供了一种可行的技术方法。

CRediT作者贡献声明

陈小曼：撰写——原始草稿，正式分析。
张荣琦：撰写——原始草稿，数据整理。
李毅：实验研究。
吴旭强：验证，软件开发。
李莉：方法论，资金获取，概念构思。
赵勇：数据可视化，资源协调，项目管理。

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