《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Freshwater Haplosporidian Diversity Associated With Invasive Non-Native Bivalves in the River Thames, Including Haplosporidium raabei Infecting Dreissena polymorpha
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单孢子虫（Haplosporidian）为水生无脊椎动物的原生动物寄生虫。研究人员报道了英国伦敦泰晤士河斑马贝（Dreissena polymorpha）寄生虫Haplosporidium raabei的首次记录。在上泰晤士河里士满段，该原生动物在D. pol
单孢子虫（Haplosporidian）为水生无脊椎动物的原生动物寄生虫。研究人员报道了英国伦敦泰晤士河斑马贝（Dreissena polymorpha）寄生虫Haplosporidium raabei的首次记录。在上泰晤士河里士满段，该原生动物在D. polymorpha群体中的流行率高于此前英国及欧洲大陆已报道水平，所有采集的D. polymorpha标本均经分子检测检出H. raabei DNA。研究人员还经分子检测（DNA与RNA）在泰晤士河其他入侵双壳类中发现H. raabei信号，包括亚洲蛤（Corbicula fluminea）和 quagga 贻贝（Dreissena bugensis）。研究人员同时报道了与D. polymorpha关联、与H. raabei近缘但遗传独立的H. raabei-like序列。本研究提出两种新型PCR检测体系，可特异灵敏地分辨H. raabei与H. raabei-like两个谱系，并确认原生unionid贻贝中存在H. raabei分子信号。研究人员还报道了与入侵双壳类C. fluminea、D. bugensis及泰晤士河环境DNA（eDNA）关联的多种新型单孢子虫谱系，揭示淡水双壳类关联的单孢子虫多样性尚待探索。
研究背景与立项依据
单孢子虫目（Haplosporida，Ascetosporea）涵盖众多海洋软体动物与甲壳类寄生虫，但已表征的淡水单孢子虫多样性有限。目前唯一被描述的淡水双壳类感染种为Haplosporidium raabei，寄主为斑马贝Dreissena polymorpha，可致鳃、性腺与消化腺结缔组织致死性病变。该种原记录于莱茵河与默兹河流域，2012年后仅见于英国Grafham Water与Cardiff Bay档案组织学材料。泰晤士河上游潮汐段里士满共存三种入侵双壳类（D. polymorpha、亚洲蛤Corbicula fluminea、quagga贻贝Dreissena bugensis）及多种濒危原生unionid贻贝（Anodonta anatina、Unio pictorum、U. tumidus）。入侵双壳类可能作为寄生虫储库或扩增宿主，存在向衰退原生unionid种群溢出的风险。在此背景下，研究人员开展泰晤士河共栖原生与入侵双壳类的单孢子虫筛查，评估H. raabei及其近缘谱系的宿主范围与淡水单孢子虫多样性。
主要技术方法概述
研究人员于2020年11月与2021年11月泰晤士河里士满Water Lane与River Lane两站点低水位露床采样，获入侵双壳类（D. polymorpha 12只、D. bugensis 44只、C. fluminea 213只）与原生unionid贻贝（U. tumidus 27只、U. pictorum 7只、A. anatina 3只），同步采集表层沉积物与岸线水体滤膜及6 L大体积水样。组织学方面，个体解剖取mantle-gonad-digestive gland-gill-foot横截面，Davidson固定、石蜡包埋、H&E染色光镜检；分子方面，组织与eDNA经提取后，以通用单孢子虫嵌套PCR（Hartikainen等）扩18S SSU（核小亚基核糖体RNA基因）片段，并设计H. raabei与H. raabei-like特异短扩程（300 bp，3′端18S）PCR及近全长18S（约1600 bp）PCR，阳性产物Sanger测序；RNA提取后DNase处理、cDNA合成，以特异PCR检rRNA信号；部分eDNA克隆文库恢复多谱系；序列以MAFFT比对、MrBayes贝叶斯建树；阴性对照含提取空白与无模板对照。
研究结果
3.1 双壳类与环境样本分子筛查
通用嵌套PCR自306只双壳类中20只扩得与H. raabei一致序列，10只扩得相似度97%的H. raabei-like序列；近全长18S确认D. polymorpha中H. raabei（1607 bp，等同HQ176468 clone A）及H. raabei-like（1602 bp，与H. raabei重叠区59 nt差异，姊妹群）。特异PCR显示D. polymorpha（12只）H. raabei组织切片阳性100%、消化腺42%，H. raabei-like组织切片83%、消化腺50%；D. bugensis与C. fluminea中H. raabei特异阳性率亦显著高于通用PCR，H. raabei-like主要限D. polymorpha。三属原生unionid经通用PCR阴性，但H. raabei特异PCR阳性（U. tumidus 33%、U. pictorum 43%、A. anatina 33%），H. raabei-like特异PCR全阴。cDNA-PCR证实H. raabei rRNA信号存于D. polymorpha、D. bugensis、C. fluminea；H. raabei-like rRNA存于D. polymorpha、C. fluminea。另经通用PCR自24/306个体扩得新型谱系Thames haplo 1（主要关联D. bugensis 27%、C. fluminea 5%、U. tumidus 4%）。eDNA靶向PCR显示H. raabei在沉积物和水中广泛阳性（2020沉积物3/3、2021水样8/9至11/11、6 L水2/2），H. raabei-like阳性较少（沉积物1–2/6、小体积水1–2/20、大体积水2/2）。
3.2 组织病理学检验
全部个体横截面H&E镜检未见符合H. raabei或其他单孢子虫的细胞（多核变形体、孢子囊、孢子），参照Smithsonian模式标本与数字扫描切片比对亦阴性；再切深100 μm复检PCR阳性个体仍阴。主要病理发现为微孢子虫Morrittospora corbiculae感染C. fluminea（2020年23/147、2021年39/66）及个别D. polymorpha、D. bugensis、U. tumidus，无单孢子虫病变。因两谱系在约650 bp通用扩增区仅10 nt差异，无法设计互斥ISH探针，故未开发谱系特异原位杂交。
讨论部分总结
研究人员指出，泰晤士河D. polymorpha经靶向PCR获100% H. raabei阳性，远高于欧洲大陆与英国档案组组织学流行率（<4%或0.7%），系分子领先筛查优于组织学、短扩程PCR灵敏度更高、取样于11月属既往组织学低估窗口所致。H. raabei分子信号扩及D. bugensis、C. fluminea与原生unionid，结合cDNA rRNA阳性，支持其非D. polymorpha专性、可能低丰度亚临床感染；H. raabei-like与H. raabei姊妹群、主要限D. polymorpha且组织切片多于消化腺、C. fluminea中偏消化腺提示可能为滤食获得，因缺组织学证据暂不能立新种。新型Thames haplo 1关联D. bugensis/C. fluminea，姊妹群近H. tuxtlensis与H. pickfordi；Thames haplo 4近Minchinia mercenariae样谱系，提示咸淡水管通或谱系生态可塑性；Thames haplo 5与8分别近泰晤士河中华绒螯蟹、Hampstead Heath红沼螯虾单孢子虫序列，反映入侵物种促寄生虫建立。组织学阴性而DNA/cDNA阳性，与海洋单孢子虫亚临床感染先例一致，RNA信号更支持活细胞存在。
结论翻译
本研究揭示了与入侵双壳类关联的淡水单孢子虫谱系及淡水环境中新型谱系多样性。研究人员首次经分子检测在多双壳类检出H. raabei，并发现近缘但系统发育独立的姊妹谱系H. raabei-like（需形态澄清方可定种）。分子检测与组织学观察的不一致表明此类单孢子虫可能丰度低、具季节性或生活史阶段难经常规组织学辨识。本文所提高灵敏特异H. raabei PCR可用于重审该寄生虫已知分布并探究其在受威胁原生unionid种群中的病变意义。高度入侵的D. polymorpha、D. bugensis与C. fluminea可作为单孢子虫源/储库，对非本土物种扩散下的原生双壳类构成潜在风险。论文发表于《Journal of Eukaryotic Microbiology》。
