单细胞分辨率的空间异构体测序揭示多种脑细胞类型中细胞类型特异性的空间异构体变异性

《Nature Methods》：Spatial isoform sequencing at single-cell resolution reveals cell-type-specific spatial isoform variability in multiple brain cell types

　　

空间长读长技术日益普遍，但通常缺乏单细胞分辨率。这留下了一个悬而未决的问题：空间可变异构体是反映某一细胞类型内部的变异性，还是反映区域特异性细胞类型组成的差异。在此，研究人员开发了Spl-ISO-Seq2（500纳米分辨率）以及配套软件Spl-IsoQuant-2和Spl-IsoFind，使得长读长测序能够处理超过4.5亿个条形码，而此前仅为8万个。将该技术应用于成年小鼠脑，研究人员比较了已知区域之间的差异异构体丰度，以及独立于预定义区域的空间异构体模式。两种方法均识别出重叠的命中基因，例如少突胶质细胞中的Rps24。对于已知的Snap25空间异构体变异，研究人员表明其发生在兴奋性神经元中。区域无关的方法还发现了基于区域的比较所遗漏的模式，例如Ighm。值得注意的是，许多空间异构体信号并非仅由细胞类型组成所驱动。最后，该软件可应用于多种空间和单细胞方案，展示了平台之间的可重复性（例如Visium HD/Stereo-seq）。总体而言，研究人员的实验/分析方法实现了亚微米分辨率的异构体视图，并为空间异构体疾病研究开辟了途径。

论文解读：单细胞分辨率的空间异构体测序揭示多脑细胞类型中细胞类型特异性的空间异构体变异性

一、研究背景与科学问题

空间异构体生物学的一个核心问题是：细胞的空间位置是否影响其异构体表达。以往的空间长读长技术如Visium，其55μm的点直径超过小鼠脑平均细胞直径，导致“伪bulk”测量，无法区分空间可变异构体（spatially variable isoform, SVI）究竟源于细胞类型内部的调控，还是源于区域间细胞类型组成的差异。因此，迫切需要一种具有单细胞分辨率的空间异构体测序方法，以厘清细胞类型与空间位置对异构体表达的贡献。

二、研究内容与主要结论

研究人员开发了Spl-ISO-Seq2，基于Stereo-seq平台将空间分辨率提升至500nm，条形码容量从8万个提升至超过4.5亿个。同时研发了配套软件Spl-IsoQuant-2（用于长读长数据处理与条形码识别）和Spl-IsoFind（用于检测空间可变异构体）。将该体系应用于成年雄性小鼠脑的两个连续冠状切片，结合短读长数据进行细胞分割与类型注释，结合PacBio（PB）和Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长数据进行异构体定量。研究结果显示，该技术可实现真正单细胞水平的空间异构体分析，并发现了多个细胞类型特异性的SVI。

在比较预定义脑区间的异构体差异时，中脑与其他区域差异最大，代表性基因包括Nptn和Phactr1，并通过PCR验证了其外显子包含的区域差异。限制在兴奋性神经元分析时，海马CA3区与齿状回（DG）之间、皮层第2–3层与第5/6层之间均存在显著的异构体转换，例如Gria2的flip/flop异构体在海马与皮层间差异表达。基于Moran's I空间自相关的Spl-IsoFind方法无需预定义区域，在全体细胞和不同细胞类型中鉴定出数百个SVI，例如Snap25在兴奋性神经元中表现皮层分层表达模式，Rps24在少突胶质细胞中表现白质与中脑差异。细胞类型约束置换检验表明，大多数空间异构体信号不能仅由细胞类型组成变化解释。此外，区域无关方法还发现了区域比较遗漏的新异构体，如Ighm。在跨平台验证中，Spl-IsoQuant-2和Spl-IsoFind成功应用于Visium HD 3′长读长数据，与Stereo-seq结果显著重叠，证明了方法的通用性和可重复性。

三、关键技术与方法

该研究的主要技术方法包括：1）基于Stereo-seq的500nm分辨率空间条形码cDNA合成，样本人群为一只雄性C57BL P56小鼠的两个相邻冠状脑切片；2）外显子组富集和长分子选择，以富集剪接及近全长cDNA；3）PB和ONT双平台长读长测序；4）Spl-IsoQuant-2软件，实现读段拆分、条形码校正和基因/异构体定量；5）Spl-IsoFind软件，基于Moran's I和置换检验检测空间可变异构体。此外，使用RCTD进行细胞类型注释，仅采用单细胞点进行分析以减少双细胞污染。

四、研究结果总结

1. 冠状脑切片中的基因表达模式：利用短读长数据成功注释了皮层、海马、丘脑和中脑等区域，并通过RCTD将细胞分为兴奋性神经元、抑制性神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等类型。

2. 高精度长读长空间异构体定量：Spl-IsoQuant-2在模拟数据中达到99.95%的条形码识别精度和76.65%的召回率（无串联）或78.11%的召回率（有串联）。在PB和ONT共同测序的分子中，99.4%被分配到相同异构体，证明ONT错误率不会导致广泛错配。

3. 基于预定义脑区的差异异构体检测：通过n×2列联表和卡方检验，识别出中脑与皮层/海马之间的显著差异，Nptn和Phactr1经PCR验证。兴奋性神经元亚群分析显示海马亚区和皮层层次的特异性异构体变化。

4. Spl-IsoFind识别超越预定义区域的SVI：应用Moran's I对所有细胞及细胞类型特异分析，检测到282个SVI（对应161个基因），富集于突触囊泡运输和膜兴奋性相关通路。多数SVI在多个数据集中重复，且细胞类型约束置换后仍有229个显著，表明空间信号主要来源于细胞类型内部调控。

5. 跨平台和生物学重复的强可重复性：在Visium HD 3′数据中，与Stereo-seq数据共享149个显著的SVI（Fisher精确检验P = 1.8×10^?110），例如Arpp19的多个异构体；而纹状体特异Gad2新异构体仅在Visium HD中检测到，反映了区域组成差异。

五、讨论与结论

讨论部分指出，Spl-ISO-Seq2的点尺寸远小于小鼠脑中最小的细胞，因此可将极大多数长读长归属于单个细胞，甚至对少突胶质细胞这类小细胞也实现单细胞分辨率。该方法揭示了如Snap25在兴奋性神经元中的皮层分层表达，以及Rps24在少突胶质细胞中的区域特异调控。研究局限性包括：SVI检测灵敏度受测序深度影响，当前双细胞过滤标准较严格，以及细胞分割基于核染色可能不够精确。此外，性别差异剪接提示在小鼠脑中发现的SVI可能不完全适用于雌性，但人类数据初步显示空间与性别相关剪接存在交集。总之，Spl-ISO-Seq2、Spl-IsoQuant-2和Spl-IsoFind共同构成了单细胞分辨率的空间异构体分析框架，为理解复杂组织中剪接调控的空间机制提供了关键工具，并开辟了空间异构体疾病研究的新方向。