长期施用生物炭增强黄土高原钙成褐土的碳固存但不提高作物产量

《Soil and Tillage Research》：Long-term biochar application enhances carbon sequestration but not crop yield in a Calcaric Cambisol of the Loess Plateau

　　

•长期施用生物炭增强了碳封存。
•生物炭改良提高了炭而非微生物残体的相对贡献率。
•生物炭诱导的“酶锁”抑制了碳分解和养分循环。
•在黄土高原的钙积褐土中，生物炭改良并未提高作物产量。

1. 引言
生物炭是实现主粮作物碳（C）中性生产的有前景策略（Xia 等，2023）。其施用可通过激发效应改变原生土壤有机碳（SOC）的矿化（Kuzyakov 等，2000）。生物炭通常引发正激发，而在雨养农田中则以强负激发为主（Zhang 等，2022）。生物炭诱导的负激发会延缓 SOC 周转，进而限制养分循环和作物产量（Biederman 和 Harpole，2013；Llovet 等，2021）。因此，在负激发下，SOC 封存与作物产量提高的协同效应不太可能实现。尽管大多数现有研究强调了生物炭的碳封存潜力（Weng 等，2022；Han 等，2024；Kalu 等，2024），但 SOC 封存与养分循环之间的权衡关系仍然知之甚少，尤其是在黄土高原的半干旱雨养农田中（Fatima 等，2020）。

微生物介导的碳循环过程在调节 SOC 封存与养分循环平衡中起关键作用（Liang 等，2017；Kopittke 等，2022）。生物炭施用可显著重塑土壤微生物群落的组成和结构（Chen 等，2021；Kerner 等，2023），从而通过土壤微生物碳泵机制调节 SOC 动态（Liang 等，2017；Chen 等，2024）。具体而言，这种群落改变可以改变微生物生活史策略和死亡途径，这些是微生物残体形成和稳定的关键调节因素（Sokol 等，2022；Camenzind 等，2023；Zhang 等，2024）。然而，田间老化生物炭无法为土壤微生物提供有利栖息地（Quilliam 等，2013），因为其固有的自由基和有毒有机化合物可能抑制微生物增殖和胞外酶合成（Hale 等，2012；Yang 等，2023），从而诱导负激发效应（DeCiucies 等，2018；Zhang 等，2022）。微生物碳泵效率和本底激发强度均受微生物资源限制调节（Yang 等，2024），这与生态酶化学计量学紧密耦合（Sinsabaugh 等，2016；Zheng 等，2022）。确实，不同的施肥制度可显著重塑土壤生态酶化学计量学，从而对跨越黄土高原的半干旱雨养农田中的 SOC 稳定产生关键影响（Huang 等，2022；Huang 等，2024）。值得注意的是，管理措施诱导的酚氧化酶（PO）活性抑制促进酚类物质积累，并进一步抑制驱动有机物分解的水解酶，这是一种被称为“酶锁”的已记录机制（Freeman 等，2001；Chen 等，2018）。此外，这两种酶调节途径可能会相互作用并形成顺序酶级联，调节 SOC 周转（Allison 和 Vitousek，2005；Birch 和 Bell，2026）。然而，关于长期生物炭改良下土壤微生物和关键胞外酶如何共同调节钙质土壤中 SOC 转化的知识空白仍然存在。深入了解这些机制对于黄土高原半干旱雨养农田的知情土壤管理至关重要。

本研究的目标是：(1) 评估长期连续施用生物炭和无机肥料对 0–60 cm 土壤剖面 SOC 储量的影响；(2) 量化 0–20 cm 土层中生物炭来源碳和微生物残体对 SOC 的相对贡献；(3) 阐明长期生物炭改良如何调节黄土高原钙积褐土中关键胞外酶活性、SOC 矿化和作物产量。为实现这些目标，进行了一项 12 年的田间试验，以考察 SOC 封存潜力和作物生产力对连续生物炭投入的响应。量化总碳输入（包括外源生物炭和内源作物残茬）以计算 SOC 封存效率。结合固态 13C 核磁共振（NMR）波谱和分子混合模型，辅以基于氨基糖的微生物生物标记物分析，用于定量解析 SOC 来源。此外，进行了一项实验室培养实验，以阐明胞外酶如何介导 SOC 矿化。我们假设，如果长期施用生物炭抑制微生物同化作用和关键胞外酶活性，那么生物炭改良将增加 SOC 封存但不提高作物产量，因为“酶锁”效应可以限制黄土高原钙质农田土壤中的养分循环。

2. 材料与方法
2.1. 研究站点与试验设计
一项长期田间试验于 2011 年 3 月在山西农业大学东阳试验站（37°33′21″N，112°40′2″E，海拔 800 m，中国晋中）启动。关于试验站点、土壤分类、气候条件、耕作制度和初始土壤性质的详细信息已由 Huang 等（2024）记录。12 年连续管理后的土壤性质见表 S1。

该田间试验旨在评估生物炭作为作物秸秆的替代品，依据是秸秆衍生生物炭的生产产量。额外包含了一个双倍率生物炭处理，以代表传统农艺施用量（定义为全量生物炭施用量）。在随机区组设计中考察了五个处理，每个处理三次重复：对照无肥（CT），单施无机肥（CF），单施生物炭（B），无机肥与半量生物炭配施（CFHB），以及无机肥与全量生物炭配施（CFB）。每个试验小区面积为 15 m × 5 m。生物炭每年与无机肥一同施用，以模拟田间条件下连续碳输入并评估其长期累积效应。对应的施用量在所有生长季节中对玉米和高粱均保持不变。尿素、过磷酸钙和硫酸钾作为无机肥来源，相应的施用量分别为 225 kg N ha?1、60 kg P ha?1 和 60 kg K ha?1。生物炭由山西山西天龙农业科技有限公司通过玉米秸秆在 450 °C 下热解 2 小时制成，升温速率为 5 °C min?1。秸秆衍生生物炭的平均产率约为 33%（干重基）。生物炭的 pH 值为 10.0，其总有机碳、氮、磷和钾含量分别为 445 g kg?1、8.9 g kg?1、2.9 g kg?1 和 23.5 g kg?1。通过 13C NMR 量化的官能团特征见图 S1 和表 S2。生物炭施用量在 B 和 CFB 小区为 4500 kg ha?1，在 CFHB 小区为 2250 kg ha?1。每年，尿素分两次等量施入：一半作为底肥在播种前施用，另一半作为追肥在玉米大喇叭口期或高粱拔节期施用。所有剩余肥料和生物炭均在播种前作为底土改良剂掺入土壤。

2.2. 碳和氮输入的估算
收获时，玉米和高粱的地上部（茎秆和叶片）被彻底清除，根系和残茬保留在原位。内源碳和氮输入根据地上部生物量量化，采用 Fan 等（2014）记录的茎秆比和根系比。地上部生物量通过作物收获指数计算，定义为谷物产量/(谷物产量 + 地上部生物量)。收获指数在 CT 和 B 处理中设定为 0.46，在 CF、CFHB 和 CFB 处理中设定为 0.51（适用于玉米和高粱）（Huang 等，2024）。根据 Fan 等（2014），残茬和根系生物量占地上部生物量的比例分别为 23% 和 26%。作物残茬的有机碳浓度假设为 40%，而总氮浓度玉米设为 0.70%，高粱设为 0.65%（Huang 等，2024）。根际沉积碳和氮估计与收获时根系碳和氮池相当，遵循 Bolinder 等（1999）的方法。生物炭来源的碳和氮输入根据其碳氮含量和施用量量化。在此基础上，粗略估算了每个处理中作物残茬和外源改良剂的总碳和氮输入。

2.3. 土壤采样与团粒分级
仅在 2022 年 10 月高粱成熟收获后采样一次。简要而言，使用直径 10 cm 的不锈钢取土钻从每个试验小区随机采集三个垂直土层（0–20、20–40 和 40–60 cm）的 8 个完整土壤柱。将每个小区相同深度区间获得的土壤柱充分混合，生成一个综合混合样品。新鲜土壤样品保存在装有冰的保温容器中，立即送往实验室并保存在 4 °C 下直至进一步处理。土壤容重按照 Blake 和 Hartge (1986) 描述的取土钻方法在各深度原位测定。未扰动的表土（0–20 cm）沿其固有裂开面轻微分散，筛分至<8 mm 并分为三个子样品。第一个子样品用于土壤团粒分级。第二个筛分至 2 mm，用于实验室培养测定以及土壤微生物生物量和胞外酶活性的测定。剩余部分风干，用于 13C NMR 分析、氨基糖测定和土壤基本性质测量。采集自 20 至 40 cm 和 40–60 cm 的土壤样品处理至直径<2 mm 并分为两份：一份用于实验室培养和酶活性量化，另一份风干用于 SOC 和全氮含量测定。

水稳性团粒通过湿筛法分离（Elliott，1986）。团粒分离的详细方案已在以前的研究中描述（Huang 等，2019）。分离出三种团粒粒径分级为 250–2000 μm、53–250 μm 和<53 μm，分别定义为大团聚体、微团聚体和粉黏粒级。随后，每个分级被分为三个子样品，分别用于量化含水量、表征团粒相关性质以及测定土壤呼吸和胞外酶活性。在研究的土壤中未发现大于 2000 μm 的团粒。

2.4. 13C 核磁共振波谱法
使用 Bruker AVANCE III 400 波谱仪记录固态 13C NMR 波谱。13C 和 1H 的工作频率分别为 100.62 MHz 和 300 MHz。分析前，土壤样品依次用 10% (v/v) HCl 和 10% (v/v) HF 溶液处理，以消除顺磁性杂质并提高信噪比。数据采集的详细方案已在以前的工作中描述（Huang 等，2023a）。基线校正后，获得的波谱被分为七个代表性化学位移区域（0–45、45–60、60–90、90–110、110–145、145–160 和 160–212 ppm），分别代表烷基碳、氮烷基和甲氧基碳、氧烷基碳、二氧烷基碳、芳香碳、酚碳和酰胺/羧基碳。通过积分各自化学位移区域内的信号强度量化每个官能团的相对丰度。

土壤有机质通常由六种主要生物化学组成构成，即碳水化合物、蛋白质、木质素、脂类、炭和羰基化合物（Baldock 等，2004）。为进一步鉴定有机官能团的化学归属和潜在来源，采用分子混合模型基于 NMR 分析获得的官能团相对丰度来量化这六种生物化学分级的相对贡献。该模型包含一个由六个变量及其相应经验系数组成的方程组（Nelson 和 Baldock，2005）。在此计算框架内，有机官能团的相对丰度用作已知常数，导出的解反映每种生物化学成分的相对比例（Huang 等，2023b）。

2.5. 氨基糖分析
氨基糖的量化遵循 Zhang 和 Amelung (1996) 提出的方法。样品制备的详细工作流程，包括热酸水解、纯化和衍生化，以及随后的氨基糖衍生品的仪器分析，已在以前的工作中全面描述（Huang 等，2023a）。胞壁酸（MurA）作为细菌细胞壁残余的特异性生物标记物。在细菌细胞中，葡萄糖胺（GluN）与 MurA 的摩尔比始终为 2:1（Joergensen，2018）。

利用这一已建立的比值关系，细菌和真菌残体质量（以 g C kg?1 表示）的贡献量通过以下公式进行量化：(1) 细菌残体质量 = MurA × 45；(2) 真菌残体质量 = (GluN/179.17 ? 2×MurA/251.23) × 179.17 × 9。在上述公式中，MurA 和 GluN 分别代表测得的肽聚糖和氨基葡萄糖浓度；251.23 和 179.17 分别代表它们各自的分子量（g mol?1）；而 45 和 9 则是分别将细菌 MurA 含量和真菌 GluN 含量转换为相应残体碳质量的转换系数。总微生物残体质量随后估算为细菌和真菌残体库的代数和。

2.6 微生物呼吸测定

开展了一项为期 30 天的对照培养试验，以测定不同土层深度及仅取自 0–20 cm 土层团聚体组分的土壤呼吸动态。采用碱液吸收法测定土壤 CO? 释放量，且未区分生物源与非生物源。所获得的土壤呼吸速率用于表征农田熟化生物炭对土壤有机碳矿化的激发效应。培养系统和计算方法的具体方案已在先前的研究中进行了详细记录（Huang 等, 2019；Huang 等, 2024）。

2.7 分析程序

土壤基本理化性质，包括体积含水量、pH、电导率、有效养分、土壤有机碳（SOC）和全氮（TN），均按照 Bao（2000）所述的标准方法进行测定。微生物生物量碳（MBC）和氮（MBN）采用氯仿熏蒸提取法进行分析（Vance 等, 1987），MBC 和 MBN 分别采用 0.45 和 0.54 的转换系数（k 因子）（Joergensen, 1996；Joergensen 和 Mueller, 1996）。微生物代谢商（qCO?）被确定为总累积 CO?-C 与 MBC 乘以培养持续时间的比值。蛋白酶（PO）、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、β-葡萄糖苷酶（BG）、β-纤维二糖苷酶（CB）和 β-木糖苷酶（XYL）的活性通过荧光微孔板测定法测定，遵循 Saiya-Cork 等（2002）和 DeForest（2009）所述的方法。0–60 cm 土层 SOC 和全氮储量（SOCstock 和 TNstock）的量化、其相对变化量（ΔSOCstock 和 ΔTNstock），以及在 12 年试验后各处理的碳氮固存速率（CSR 和 NSR）与固存效率（CSE 和 NSE）的测定，均按照我们先前研究中建立的详细方案进行（Huang 等, 2022；Huang 等, 2024）。各团聚体组分中储存的有机碳量由该组分的 SOC 浓度与其质量占比的乘积求得。

2.8 统计分析

所有数据处理和统计分析均使用 R 软件（版本 4.5.0；R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）完成。采用单因素方差分析（ANOVA）检测各土层和团聚体组分处理间差异，随后在 P < 0.05 水平进行 Duncan 多重极差检验。为探讨主要变量之间的关系，进行了线性回归分析，分别针对整土和土壤团聚体进行分析。采用偏最小二乘路径建模（PLS-PM）来解析生物炭施用后土壤碳固存的直接和间接路径。潜变量的选择基于其生态功能和机理含义。具体而言，MBC 和真菌残体作为微生物体内周转的替代指标，因为真菌残体有助于土壤大团聚体的稳定化。PO 和 NAG 被用来表征酶级联反应驱动的体外修饰作用，因为它们对有机质转化具有关键功能。大团聚体和土壤呼吸分别指示物理保护作用和酶介导的碳矿化作用，而难降解生物炭组分则反映了稳定土壤碳库的生物化学性质。PLS-PM 使用 R 中的"plspm"包进行实现。采用 500 次迭代的 Bootstrap 重抽样检验路径系数的显著性，并利用拟合优度（GoF）指数评估整体模型拟合度。

3 结果

3.1 玉米和高粱产量以及碳氮投入

经过 12 年的连续种植，各处理间玉米和高粱产量表现出一致的变异特征。CF、CFHB 和 CFB 处理的产量显著高于 CT 和 B 处理，而 CF、CFHB 和 CFB 处理之间或 CT 与 B 处理之间未观察到产量差异（图 1）。未施肥对照组中，作物秸秆、根系生物量和根际沉积物的年碳输入量为 2025 kg C ha?1 yr?1（表 1）。外加生物炭使该数值大幅增加，在 CFB 处理下达 4764 kg C ha?1 yr?1。各处理的年氮输入量存在差异，CT 处理最低，CFB 处理最高（表 S3）。

图 1. 2011 至 2022 年钙质褐土中不同处理下玉米和高粱平均产量。实线和圆点分别代表中位数和均值，箱体上下线分别代表 25 和 75 百分位产量值，箱体外的横线分别代表 10 和 90 百分位产量值，而箱体上方和下方的黑色方块分别代表小于 10 和大于 90 百分位的数据。处理 CT、CF、B、CFHB 和 CFB 分别代表未施肥对照、单独施用无机肥、单独施用生物炭、无机肥与半量生物炭协同施用以及无机肥与全量生物炭协同施用。不同字母表示各处理间在 Duncan 多重极差检验下 P < 0.05 的显著差异。

表 1. 2011 至 2022 年钙质褐土中不同施肥处理下玉米和高粱的平均作物产量、年均地上生物量、根系生物量估计值、内生作物残体和外加生物炭向土壤的碳（C）年输入量，以及累积碳输入量。

作物/处理?/产量/地上生物量/根系生物量/年碳输入/累积碳输入
玉米 CT 6336 7438 1711 2142 0 20128 54 CF 11322 10878 2502 3133 0 18798 B 5995 7037 1619 2027 2002 2022 4175 CFHB 11686 11228 2582 3234 1001 25410 CFB 11363 10917 2511 3144 2002 30880
高粱 CT 5643 6625 1524 1908 0 11447 CF 8674 8333 1917 2400 0 14400 B 5756 6757 1554 1946 2002 23692 CFHB 8453 8122 1868 2339 1001 20042 CFB 8595 8258 1899 2378 2002 26285

? CT，未施肥对照；CF，单独施用无机肥；B，单独施用生物炭；CFHB，无机肥与半量生物炭协同施用；CFB，无机肥与全量生物炭协同施用。

3.2 碳氮储量、固存速率和效率

与初始基线相比，长期田间管理显著改变了 0–60 cm 土壤剖面的 SOC 和 TN 储量。CT 处理使 SOC 和 TN 储量分别减少了 3% 和 5%，而 CF 处理下检测到 SOC 增加 3%（SOC）和 TN 增加 6%（表 2 和表 S4）。相比之下，B、CFHB 和 CFB 处理使 SOC 储量大幅增加 11–22%，TN 储量增加 6–13%。CT 处理发生净碳损失 156 kg C ha?1 yr?1，而 B 和 CFB 处理观察到最高 CSR（1092 kg C ha?1 yr?1）。同样，CT 处理显示净氮损失 24.7 kg N ha?1 yr?1，而 CFB 处理实现了最高 NSR（64.6 kg N ha?1 yr?1）。B 处理表现出最高 CSE（27%）和 NSE（41%）。年碳输入量与 CSR 和 CSE 均呈正相关（P < 0.001；图 2），而年氮输入量对这两个变量均无显著影响（图 S2）。在连续玉米高粱种植条件下，已确定年碳输入阈值为 2374 kg C ha?1 yr?1，以抵消 SOC 消耗。

图 2. 钙质褐土中施用生物炭和无机肥 12 年后年碳（C）输入量与碳固存速率（CSR）（a）及碳固存效率（CSE）（b）之间的关系。

3.3 SOC 有机官能团和生物化学组分

连续 12 年的生物炭施用显著改变了 0–20 cm 土层土壤的 13C NMR 谱图（图 3a）。在 CT 和 CF 处理中，有机碳官能团的相对丰度顺序为：烷基 C > O-烷基 C > 芳香 C > N-烷基/甲氧基 C，酰胺/羧基 C > 二 O-烷基 C > 酚类 C（图 3b）。与 CT 相比，B、CFHB 和 CFB 处理使芳香 C 增加 60–99%，酚类 C 增加 32–43%，烷基 C 减少 18–22%，N-烷基和甲氧基 C 减少 22–30%，O-烷基 C 减少 15–30%。分子混合模型显示，生物炭对总 SOC 的相对贡献从 CT 的 4% 和 CF 的 8% 增加到生物炭施用下的 29–38%，同时碳水化合物、蛋白质、木质素和脂类含量下降（图 3c）。

图 3. 施用 12 年生物炭和无机肥对钙质褐土 0–20 cm 深度土壤样品固态 CPMAS 13C NMR 谱图（a）、不同有机官能团相对比例（%）（b）和不同生物化学组分相对含量（%）（c）的影响。处理 CT、CF、B、CFHB 和 CFB 分别代表未施肥对照、单独施用无机肥、单独施用生物炭、无机肥与半量生物炭协同施用以及无机肥与全量生物炭协同施用。误差棒为平均值的标准误差（n = 3）。

3.4 土壤微生物生物量和微生物残体质量

与 CT 相比，CF 处理使 MBC 增加 21%，而 B、CFHB 和 CFB 处理分别使 MBC 减少 28%、14% 和 23%（表 3）。MBN 也呈现出类似的模式，最高值记录于 CF 处理，最低值记录于 B 处理。细菌残体质量保持稳定，几乎不受施肥影响。真菌残体质量在 CF 处理下增加 26%，但在 B、CFHB 和 CFB 处理中分别下降 26%、11% 和 19%（相对于 CT）。真菌残体与细菌残体之比在 B、CFHB 和 CFB 处理中为 2.0，在 CT 处理中为 2.5，在 CF 处理中达到最高值 2.9。在 0–20 cm 土层中，微生物残体质量占总 SOC 的 21–48%，其中 CF 处理和 B 处理记录的贡献率分别为最高和最低值。

表 2. 2011 至 2022 年钙质褐土 0–60 cm 土壤深度下，不同施肥处理对土壤有机碳（SOC）、容重、SOC 储量（SOCstock）、SOC 储量变化（ΔSOCstock）、碳固存速率（CSR）和碳固存效率（CSE）的影响。不同字母表示在 Duncan 多重极差检验下各施肥处理间 P < 0.05 的显著差异。括号中的数据表示各土层 SOC 储量占总 SOC 储量的比例（%）或相对于初始土壤各土层净 SOC 固存量的比例（%）。

深度/处理?/SOC/容重/SOCstock/ΔSOCstock/CSR/CSE
0–20 cm
初始土壤 9.4c 1.35 a 25.5c（43）
CT 8.6 d 1.35 a 23.1 d（40） -2.4 d（-10） -204 d
CF 9.5c 1.35 a 25.6c（42） 0.1c（1） 12c
B 14.2 a 1.26 b 35.8 a（49） 10.3 a（40） 859 a
CFHB 11.5 b 1.30 ab 30.0 b（45） 4.5 b（18） 377 b
CFB 14.4 a 1.24 b 35.9 a（49） 10.4 a（41） 866 a
20–40 cm
初始土壤 6.4 b 1.46 a 18.7 a（31）
CT 6.0c 1.44 a 17.4 b（30） -1.3 b（-7） -108 b
CF 6.4 b 1.45 a 18.7 a（30） -0.02 ab（0） -1.4 ab
B 6.9 a 1.41 a 19.5 a（27） 0.8 a（4） 66 a
CFHB 6.6 b 1.43 a 18.9 a（28） 0.2 ab（1） 16 ab
CFB 6.9 a 1.41 a 19.3 a（26） 0.6 a（3） 49 a
40–60 cm
初始土壤 5.5 b 1.44 a 15.8 b（26）
CT 6.2 a 1.43 a 17.7 a（30） 1.9 a（12） 156 a
CF 6.0 a 1.43 a 17.2 a（28） 1.4 a（9） 117 a
B 6.3 a 1.42 a 17.8 a（24） 2.0 a（13） 166 a
CFHB 6.2 a 1.43 a 17.7 a（27） 1.9 a（12） 162 a
CFB 6.3 a 1.42 a 17.9 a（25） 2.1 a（14） 179 a
0–60 cm
初始土壤 60.0c
CT 58.1 d -1.9 d（-3） -156 d
CF 61.5c 1.5c（3） 128c
B 73.1 a 13.1 a（22） 1090 a 27 a
CFHB 66.6 b 6.7 b（11） 555 b 15c
CFB 73.1 a 13.1 a（22） 1094 a 23 b

? CT，未施肥对照；CF，单独施用无机肥；B，单独施用生物炭；CFHB，无机肥与半量生物炭协同施用；CFB，无机肥与全量生物炭协同施用。

表 3. 2011 至 2022 年钙质褐土 0–20 cm 深度下，不同施肥处理对土壤微生物生物量碳（MBC）、微生物生物量氮（MBN）、肽聚糖、氨基葡萄糖、细菌残体质量、真菌残体质量、真菌残体与细菌残体之比以及微生物残体对土壤有机碳（SOC）相对贡献的影响。数值为平均值 ± 标准误差（n = 3）。不同字母表示在 Duncan 多重极差检验下各施肥处理间 P < 0.05 的显著差异。

处理?/MBC/MBN/肽聚糖/氨基葡萄糖/细菌残体/真菌残体/真菌残体/细菌残体/微生物残体/SOC
CT 105 ± 8.6 b 21.1 ± 3.0 a 23.7 ± 3.5 a 330 ± 24 b 1.06 ± 0.16 a 2.67 ± 0.19 b 2.5 ± 0.3 ab 44 ± 5 a
CF 127 ± 10.2 a 23.2 ± 2.5 a 26.2 ± 4.3 a 411 ± 21 a 1.18 ± 0.20 a 3.36 ± 0.13 a 2.9 ± 0.4 a 48 ± 3 a
B 75.7 ± 6.7c 15.1 ± 0.8 b 22.7 ± 2.3 a 252 ± 18 d 1.02 ± 0.10 a 1.98 ± 0.13 d 1.9 ± 0.1 b 21 ± 2c
CFHB 90.1 ± 6.7 bc 17.2 ± 1.2 b 25.0 ± 3.4 a 299 ± 24 bc 1.13 ± 0.15 a 2.37 ± 0.18 bc 2.1 ± 0.1 b 30 ± 3 b
CFB 80.4 ± 9.4c 15.6 ± 1.0 b 24.0 ± 3.8 a 274 ± 24 cd 1.08 ± 0.17 a 2.15 ± 0.25 cd 2.0 ± 0.6 b 22 ± 1c

? CT，未施肥对照；CF，单独施用无机肥；B，单独施用生物炭；CFHB，无机肥与半量生物炭协同施用；CFB，无机肥与全量生物炭协同施用。

3.5 团聚体质量分布及相关有机碳含量和储量

在所有处理中，湿筛后均回收了超过 97% 的总土样质量。大团聚体的质量占比在 B 处理中最低，在 CF 处理中最高（表 S5）。在所有处理中，粉粒和黏粒组分的 SOC 含量始终低于团聚体组分的 SOC 含量。

与CT处理相比，CF处理对各个团聚体分级的SOC含量影响微乎其微。相比之下，B、CFHB和CFB处理显著提高了所有团聚体分级的SOC含量。生物炭改良强烈促进了细粒级中的有机碳积累，相对于CT处理而言，而大团聚体包被的SOC则保持不变。具体而言，微团聚体中有机碳积累增加了15–54%，粉砂和黏粒分级中增加了74–117%。炭对总SOC的相对贡献与大团聚体的质量比例呈负相关（P = 0.001），而真菌坏死体则与大团聚体比例呈正相关（P < 0.001；图S3）。

3.6 土壤剖面与团聚体中的土壤呼吸速率

在所有土壤深度和团聚体分级中，CT和CF处理的土壤呼吸速率始终高于B、CFHB和CFB处理（图4）。在所有处理中，呼吸速率随土壤深度增加而降低（0–20 cm > 20–40 cm ≥ 40–60 cm），随团聚体粒径减小而降低（大团聚体 > 微团聚体 ≥ 粉砂和黏粒）。B和CFB处理的qCO?值高于CT和CF处理（图S4）。

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图4. 12年生物炭和矿物肥料施用对石灰质褐土土壤剖面（a）和表层土壤团聚体（b）中土壤呼吸速率的影响（30天培养期间）。处理CT、CF、B、CFHB和CFB分别代表不施肥对照、单独施用矿物肥料、单独施用生物炭、矿物肥料与半量生物炭配施以及矿物肥料与全量生物炭配施。误差棒为标准误（n = 3）。不同字母表示同一土壤层或团聚体分级内处理间在P < 0.05水平上的显著差异，依据Duncan多重范围检验确定。

3.7 土壤剖面与团聚体中的胞外酶活性

在0–20 cm表层土壤和团聚体分级中，五种测定胞外酶的活性在非生物炭土壤（CT和CF）中略高于生物炭改良土壤（B、CFHB和CFB）（表4）。在20–60 cm土壤剖面内，PO和NAG的活性趋势与表层土壤一致，而BG、CB和XYL则呈现相反趋势，在生物炭改良处理中活性更高。在总体土壤（0–60 cm）中，PO和NAG活性与土壤呼吸速率的相关性更强（R2 = 0.66–0.67），而BG、CB和XYL活性相关性较弱（R2 = 0.44–0.46；表5）。然而，在团聚体分级中，所有酶均与土壤呼吸速率呈现强烈且均衡的相关性。

表4. 不同肥料处理对石灰质褐土土壤剖面及表层土壤团聚体中酚氧化酶（PO）、N-乙酰-葡糖胺酶（NAG）、β-葡萄糖苷酶（BG）、β-纤维二糖苷酶（CB）和β-木糖苷酶（XYL）活性的影响。数值为平均值 ± 标准误（n = 3）。不同字母表示同一土壤层或团聚体分级内肥料处理间在P < 0.05水平上的显著差异，依据Duncan多重范围检验确定。

深度/团聚体 处理^a PO NAG BG CB XYL
(μmol g?1 h?1) (nmol g?1 h?1) (nmol g?1 h?1) (nmol g?1 h?1) (nmol g?1 h?1)

0–20 cm
CT 16.6 ± 1.2 ab 8.7 ± 0.7 b 108 ± 5.4 b 18.5 ± 0.7 bc 36.7 ± 2.2 ab
CF 18.1 ± 1.0 a 9.7 ± 0.4 a 119 ± 6.3 a 20.6 ± 1.2 a 40.0 ± 4.0 a
B 15.4 ± 1.0 b 7.5 ± 0.5 c 96.6 ± 7.0 c 17.1 ± 1.2 c 33.6 ± 1.5 b
CFHB 15.4 ± 1.0 b 8.7 ± 0.6 b 108 ± 2.4 bc 18.7 ± 1.2 abc 35.2 ± 2.3 b
CFB 15.1 ± 1.3 b 8.0 ± 0.3 bc 102 ± 7.5 bc 19.2 ± 0.4 ab 34.6 ± 1.5 b

20–40 cm
CT 12.4 ± 1.1 b 6.6 ± 0.2 b 22.3 ± 0.3 c 2.7 ± 0.4 c 4.0 ± 0.3 b
CF 14.4 ± 0.8 a 8.3 ± 0.4 a 23.0 ± 0.9 c 2.7 ± 0.3 c 3.8 ± 0.6 b
B 11.6 ± 0.9 b 5.8 ± 0.4 c 27.6 ± 0.8 ab 3.8 ± 0.3 ab 5.6 ± 0.6 a
CFHB 12.1 ± 0.8 b 6.5 ± 0.7 bc 27.0 ± 0.6 b 3.4 ± 0.2 b 5.5 ± 0.7 a
CFB 11.4 ± 0.6 b 5.8 ± 0.2 bc 29.2 ± 1.5 a 4.2 ± 0.5 a 6.3 ± 0.5 a

40–60 cm
CT 12.6 ± 0.4 b 7.6 ± 0.2 b 22.2 ± 2.1 ab 2.6 ± 0.2 ab 3.2 ± 0.6 bc
CF 14.1 ± 1.1 a 8.3 ± 0.4 a 20.6 ± 0.7 b 2.2 ± 0.5 b 2.8 ± 0.4 c
B 10.9 ± 0.8 c 5.9 ± 0.3 d 23.2 ± 1.5 ab 3.1 ± 0.6 ab 3.9 ± 0.4 ab
CFHB 11.6 ± 0.9 bc 6.6 ± 0.4 c 23.8 ± 1.2 a 3.3 ± 0.3 a 4.5 ± 0.5 a
CFB 11.8 ± 0.4 bc 6.1 ± 0.4 cd 23.2 ± 1.0 ab 3.3 ± 0.6 a 4.1 ± 0.6 ab

大团聚体
CT 22.8 ± 1.3 b 11.0 ± 0.9 ab 133 ± 7.2 b 26.4 ± 2.3 ab 48.5 ± 2.5 b
CF 26.3 ± 2.4 a 12.4 ± 1.3 a 152 ± 4.0 a 29.7 ± 2.4 a 53.8 ± 4.4 a
B 19.7 ± 1.0 c 9.1 ± 0.6 b 124 ± 7.9 b 24.5 ± 1.7 b 46.9 ± 1.1 b
CFHB 22.5 ± 0.5 b 10.2 ± 1.2 b 132 ± 4.5 b 26.5 ± 0.4 ab 49.6 ± 1.0 ab
CFB 20.1 ± 1.2 bc 9.7 ± 1.3 b 127 ± 7.3 b 26.3 ± 1.6 ab 48.8 ± 1.7 b

微团聚体
CT 17.7 ± 0.7 b 9.4 ± 0.8 ab 109 ± 7.0 ab 21.3 ± 1.3 ab 40.9 ± 1.0 ab
CF 21.0 ± 1.1 a 10.6 ± 1.3 a 124 ± 11.2 a 23.7 ± 2.2 a 44.3 ± 2.1 a
B 16.2 ± 1.8 b 7.9 ± 0.9 b 93.4 ± 10.9 c 19.7 ± 1.6 b 35.8 ± 1.3 c
CFHB 18.5 ± 0.5 b 9.1 ± 0.7 ab 93.4 ± 4.8 c 21.3 ± 1.4 ab 36.2 ± 2.9 c
CFB 15.9 ± 2.6 b 8.3 ± 0.4 b 97.0 ± 2.9 bc 20.7 ± 2.0 ab 37.3 ± 2.3 bc

粉砂和黏粒
CT 15.0 ± 2.3 b 7.8 ± 0.8 b 95.0 ± 19.6 ab 17.6 ± 3.7 ab 33.9 ± 5.2 ab
CF 19.1 ± 2.1 a 9.8 ± 0.4 a 113 ± 16.6 a 21.0 ± 2.2 a 40.7 ± 4.6 a
B 13.7 ± 1.2 b 6.8 ± 0.5 b 70.2 ± 3.1 c 15.3 ± 2.3 b 31.9 ± 1.1 b
CFHB 16.0 ± 1.8 ab 7.3 ± 0.7 b 80.5 ± 4.6 bc 16.3 ± 2.4 ab 30.6 ± 2.9 b
CFB 15.9 ± 2.6 ab 7.1 ± 1.0 b 76.3 ± 2.4 bc 16.0 ± 2.5 ab 34.5 ± 2.6 ab

^a CT，不施肥对照；CF，单独施用矿物肥料；B，单独施用生物炭；CFHB，矿物肥料与半量生物炭配施；CFB，矿物肥料与全量生物炭配施。

表5. 石灰质褐土土壤剖面（n = 45）和表层土壤团聚体（n = 45）中酚氧化酶（PO）、N-乙酰-葡糖胺酶（NAG）、β-葡萄糖苷酶（BG）、β-纤维二糖苷酶（CB）、β-木糖苷酶（XYL）活性与土壤呼吸速率之间的关系。

分级 因子 方程 R2 P

0–60 cm 土壤
PO vs. 土壤呼吸速率 y = 1.12x + 11.18 0.67 < 0.001
NAG vs. 土壤呼吸速率 y = 1.95x + 12.05 0.66 < 0.001
BG vs. 土壤呼吸速率 y = 0.05x + 23.66 0.46 < 0.001
CB vs. 土壤呼吸速率 y = 0.27x + 24.12 0.44 < 0.001
XYL vs. 土壤呼吸速率 y = 0.14x + 24.34 0.46 < 0.001

团聚体
PO vs. 土壤呼吸速率 y = 0.98x + 7.35 0.60 < 0.001
NAG vs. 土壤呼吸速率 y = 1.98x + 7.57 0.54 < 0.001
BG vs. 土壤呼吸速率 y = 0.16x + 7.97 0.75 < 0.001
CB vs. 土壤呼吸速率 y = 0.80x + 8.15 0.65 < 0.001
XYL vs. 土壤呼吸速率 y = 0.53x + 3.96 0.74 < 0.001

3.8 偏最小二乘路径模型（PLS-PM）揭示的生物炭改良下土壤碳固持机制

PLS-PM分析阐明了生物炭改良调节土壤碳固持的不同路径（图5）。生物炭对微生物体内周转和体外修饰过程产生负面影响。体内微生物周转的抑制间接限制了土壤大团聚体的形成，而体外酶促修饰的抑制则降低了土壤呼吸。然而，这些体内和体外介导的路径对土壤碳固持的贡献微乎其微。相比之下，生物炭直接增加了难降解炭组分所占的相对比例，这是长期土壤碳固持的主要驱动因素。

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图5. 偏最小二乘路径建模（PLS-PM）的概念路径图，量化了外源碳（C）输入向石灰质褐土土壤碳固持的多步机制级联效应。箭头表示变量交互的假设因果方向。实线红线代表统计学显著的阳性路径系数（P < 0.05），实线蓝线表示显著负向路径系数（P < 0.05），虚线表示不显著路径（P > 0.05）。各箭头旁的数值为标准回归系数；每个潜变量框下方的R2系数量化了前序预测变量所解释的方差比例，而全局拟合度（GoF = 0.7539）反映了完整PLS-PM框架的总体解释能力。潜变量缩写：体内周转（In vivo turnover）整合了微生物生物量碳（MBC）和真菌坏死体库；体外修饰（Ex vivo modification）由酚氧化酶（PO）和N-乙酰-β-D-葡糖胺酶（NAG）酶活性构建；炭（Char）代表生物炭衍生的黑碳库；碳固持（C sequestration）包括碳固持速率（CSR）和碳固持效率（CSE）。星号表示显著性阈值：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。

4. 讨论

4.1 生物炭诱导的负激发效应增强了SOC固持

长期无施肥耕作导致SOC耗竭，这归因于内源碳供应不足和寡营养土壤条件的形成（Fan等，2014；Xun等，2016；Huang等，2024）。矿物肥料施用缓解了养分限制，维持了作物碳输入，并有效保持了SOC存量（Fan等，2014；Huang等，2024）。生物炭添加下土壤呼吸的降低证实了负激发效应的发生。新鲜生物炭由于富含易降解碳，通常引发短期正激发效应，而长期施用则耗竭可用底物并使系统转向负激发效应（Zhang等，2022；Han等，2024；Kalu等，2024）。尽管仅在收获期进行了单次采样，培养基呼吸反映的是长期生物炭施用下的稳态呼吸，可靠地表明了持续存在的负激发效应。与矿物肥料不同，生物炭并未刺激作物来源碳的输入。PLS-PM分析验证了生物炭来源的外源碳是土壤碳存量增加的主要来源和直接驱动因素（图5）。土壤碳固持表现随碳输入增加而持续提升，表明经过12年田间管理后土壤仍处于未饱和状态。较高的生物炭施用量可进一步增强负激发效应并提高土壤碳饱和阈值，从而支持长期SOC固持（Fatima等，2020；Llovet等，2021；Weng等，2022）。

本研究结果表明，在持续玉米-高粱轮作下，需要至少2.37 Mg C ha?1 yr?1的碳输入才能抵消SOC损失（图2a）。该临界阈值高于有机施肥条件下相似黄土高原耕作系统的报道值（Huang等，2024），但低于湿润热带稻作系统中有机-无机配施处理获得的数值（Mandal等，2008）。这些差异可能由基线SOC状况和可实现的碳固持速率驱动，这些已被公认为是维持SOC存量所需碳输入量的关键决定因素（Fan等，2014；Huang等，2024）。

在典型谷物轮作系统中，生物炭改良产生的碳固持速率（CSR）高于长期堆肥施用（Fan等，2014）。然而，本研究中基于生物炭体系的CSR仍低于黄土高原集约化粪肥和秸秆还田实践所达到的水平（Huang等，2019；Huang等，2024）。相对于堆肥改良土壤的CSR提升，是由生物炭改良下较高的碳固持效率（CSE）驱动的，而相较于区域有机体系的固持潜力降低，则主要归因于年外源碳输入量的差异。值得注意的是，生物炭介导的CSE始终高于旱作农业生态系统中秸秆还田和常规有机肥施用的CSE（Zhao等，2018；Huang等，2019；Huang等，2022；Huang等，2024）。这些不同的固持表现源于不同有机底物诱导的不同激发响应。富含易降解碳的粪肥和秸秆通常触发正激发效应并加速原生SOC矿化，从而限制整体CSE（Huang等，2019；Huang等，2022；Huang等，2024）。相比之下，生物炭以化学难降解组分为主，主要诱导负激发效应，从而促进长期SOC稳定化（Han等，2024；Kalu等，2024）。事实上，外源碳输入的数量和质量均可调节激发效应的方向和幅度（Liu等，2017）。综合来看，长期生物炭改良主要通过负激发诱导的碳稳定化来增强SOC固持。增加生物炭施用量可进一步提升SOC饱和上限，凸显其在改善黄土高原旱作农业生态系统碳固持能力方面的可靠潜力。

4.2 生物炭改良增强了炭而非微生物坏死体的相对贡献

长期生物炭添加改变了表层土壤SOC组成，生物炭衍生的碳（即炭）占比超过微生物坏死体（图3c）。这种主导地位源于生物炭固有的难降解性：易降解生物炭组分和作物残留物逐渐矿化，而无活性的芳香碳则持续原位留存（Chen等，2024；Han等，2024），这与所测生物炭的缩合芳香特征一致。生物炭触发的负激发效应虽适度提高了与碳水化合物和蛋白质结合的微生物碳，但不足以抵消持续的炭积累。已充分记载的负激发效应驱动的native SOC分解抑制进一步巩固了田间老化生物炭的相对主导地位（DeCiucies等，2018；Weng等，2022；Kalu等，2024）。炭贡献与大团聚体比例之间的负相关性证实，易降解凋落物而非稳定生物炭有利于团聚体保护的有机碳固持（Witzgall等，2021）。总体而言，大量惰性炭的积累稀释了易降解残留物和微生物来源的碳库，解释了改良表层土壤中炭所占比例的升高（Fatima等，2020；Llovet等，2021）。

相比之下，生物炭改良主要通过减少真菌而非细菌坏死体库来降低整体微生物坏死体贡献（表3）。生物炭衍生的易降解碳促进了细菌的快速增殖，以补充新形成的坏死体并抵消潜在的分解损失，而生长缓慢的真菌则无法弥补因资源竞争改变所触发的生物量限制（Zhang等，2021）。这种差异性积累进一步得到残留生物聚合物固有化学差异的支持：富含肽聚糖的细菌坏死体具有更高的生化难降解性和更长的原位滞留时间，而以几丁质为基础的真菌残体则经历更快的土壤周转（K?gel-Knabner，2002；Liang等，2019）。然而，这些关于微生物生长速率差异的解读仍属于机制性推断，缺乏直接实验验证。此外，生物炭携带的有毒成分和自由基可引起广泛的生理胁迫，抑制整体微生物同化作用和生物量合成（Hale等，2012；Llovet等，2021；Yang等，2023）。结合前述碳稀释效应，真菌生长的优先抑制最终降低了表层土壤SOC中微生物坏死体的相对比例，并削弱了真菌介导的团聚体稳定化（Chen等，2021；De Goede等，2025）。

4.3 生物炭诱导的"酶锁"效应抑制了SOC分解

长期生物炭触发的PO和NAG降低在功能上耦合于抑制总体土壤和团聚体中的土壤呼吸（表4，表5）。这种联系指向上游酶抑制是减缓SOC矿化的核心途径（Allison and Vitousek，2005；Birch and Bell，2026）。总体土壤与团聚体间差异性的酶调控模式可通过本文提出的酶级联反应、"酶锁"和生态酶化学计量学加以解释（Freeman等，2001；Sinsabaugh等，2016）。

在完整的土体基质中，底物限制约束了下游水解酶，并建立了由 PO（酚氧化酶）和 NAG（N-乙酰己糖胺苷酶）主导的层级调控，而湿筛法破坏了固有的团聚体结构，并增强了可溶性碳和养分的生物有效性。由此产生的资源过剩消除了顺序底物约束，使所有检测的酶能够共同调节呼吸作用，并在团聚体级分中掩盖级联特征（Huang et al., 2022, Huang et al., 2024）。事实上，新兴的机制证据证实，生物炭添加显著抑制了 PO 活性（Ma et al., 2026）。因此，PO 受抑产生的累积酚类副产物通过“酶锁”机制进一步抑制下游 NAG，约束了顺序酶级联并减缓了 SOC（土壤有机碳）矿化（Huang et al., 2022, Huang et al., 2024, Birch and Bell, 2026）。与这些新兴的机制见解一致，我们的田间观察证实，即使在离散单点采样的限制下，生物炭主要通过 PO 介导的“酶锁”级联抑制 SOC 分解。4.4. 对养分循环和作物生产的启示
生物炭改良被广泛倡导以实现农业土壤中的碳中性作物生产（Xia et al., 2023）。然而，我们在钙质土上的长期田间实验虽然实现了明显的 SOC 固持，但未能刺激作物生产力。与第 4.3 节概述的 PO 介导的“酶锁”级联相关联，持续添加生物炭抑制了微生物分解代谢，进而减缓了有机质周转并限制了养分矿化（Biederman and Harpole, 2013, Quilliam et al., 2013）。延缓的养分循环削减了植物可利用养分供应，解释了碳固持与产量提高的脱钩，这与先前发现的作物产量停滞同时 SOC 库升高的发现一致（Llovet et al., 2021）。实际上，这些结果警告说，单独掺入生物炭无法兼顾黄土高原钙质农田的碳汇和粮食产量；与补充肥料联合施用对于缓解生物炭引起的养分限制并实现碳和农艺双重效益至关重要。5. 结论
长期生物炭改良从根本上调节了黄土高原钙质农田土壤中的微生物代谢策略和胞外酶介导的碳分解。连续耕作而不施肥导致 SOC 逐渐耗竭，而持续输入生物炭有效逆转了这一趋势并增强了土壤碳固持。生物炭通过增加炭的比例重塑了 SOC 组成，同时重塑了微生物驱动的团聚体稳定过程。长期添加生物炭抑制了微生物合成代谢，同时抑制了碳降解酶活性以限制微生物分解代谢潜力。本研究强调了一条全面的酶级联抑制途径，该途径整合了“酶锁”和化学计量分解机制：生物炭引起的酶限制约束了微生物养分获取并进一步抑制 SOC 分解，从而促进了长期 SOC 积累。然而，长期生物炭改良带来的碳固持效益无法转化为研究中干旱钙质土壤作物生产力的提高。总体而言，长期施用生物炭是一种通过双重调节微生物合成代谢和分解代谢酶级联来稳定 SOC 和促进碳固持的有效策略，但其在区域钙质农业生态系统中对作物生产的协同改善仍然有限。CRediT 作者贡献声明
Xiaoyan Jiao：撰写 – 审阅与编辑，监督，项目管理，调查，资金获取，形式分析，数据整理，概念化。Erwei Dong：撰写 – 审阅与编辑，验证，软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。Yumei Yue：软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。Yuan Wang：软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。Qiuxia Liu：验证，软件，方法论，调查，形式分析。Jinsong Wang：软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。Xiaolei Huang：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，监督，项目管理，资金获取，概念化。Yijun Zhang：软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。Huijun Li：软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。Ruihao Fan：软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。Tao Zhang：软件，方法论，调查，形式分析，数据整理。
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