基于Cu2?激活的双重类酶活性对食品和水样中克霉灵的多通道比色检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Multi-channel colorimetric detection of thiram in food and water samples via activated dual enzyme-like activities of Cu2+

　　

摘要

多菌灵（Thr）残留对生态环境和人体健康构成潜在风险。本文提出了一种用于Thr检测的简便多通道比色检测方法。以Cu²⁺作为比色探针，与Thr配位形成Cu²⁺-Thr配合物，该配合物具有良好的类氧化酶（OXD）和类漆酶（LAC）活性。Cu²⁺-Thr配合物的催化动力学符合米氏方程（Michaelis-Menten）模型。利用Thr激活Cu²⁺的类OXD和类LAC活性，开发了用于Thr检测的比色方法。该方法的检测范围和检出限与涉及纳米材料的方法相当。通过将智能手机与试纸和检测拭子集成，开发了两种便携式传感平台，实现了Thr的现场检测。通过多通道比色法成功测定了食品和水样中Thr的浓度，回收率和相对标准偏差令人满意。该简便、低成本的比色传感平台在食品安全分析和环境监测方面显示出应用潜力。

引言

农药在现代农业生产中发挥着至关重要的作用，它们可以保护作物免受害虫、杂草和真菌的危害，从而提高产量和质量。多菌灵（Thr）是一种二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂，广泛用于水果和蔬菜的病虫害防治[1]、[2]。然而，Thr的过度使用和不当使用会导致环境污染和生物富集，可能对生态环境和人体健康构成潜在风险[3]。Thr残留可通过皮肤接触和食物链进入人体，引起皮肤病变、内分泌干扰、神经毒性和器官损伤[4]、[5]。食品中多菌灵的最大残留限量（MRL）已被严格规定。美国环境保护署（EPA）将水果中Thr的MRL设定为7.0 mg kg^?1[6]。在中国，食品中Thr的MRL在《食品安全国家标准》（GB 2763–2021）中有所规定，其具体限值根据食品类型而异。因此，常规监测食品和环境样品中的Thr对于确保食品安全和人体健康至关重要。

目前已报道了多种Thr检测策略，包括色谱法[7]、[8]、电化学传感器[9]、[10]、荧光法[11]、[12]、[13]、表面增强拉曼光谱（SERS）[14]、[15]、[16]和比色法[17]、[18]、[19]。基于色谱的方法作为食品中Thr检测的标准方法，但由于操作繁琐、需要经验丰富的操作人员和专业设备，面临着诸多挑战。电化学传感器具有灵敏度高的显著优势，且不受实际样品颜色干扰。但该方法的可移植性有待提高。近年来，Thr检测方法主要集中于光学检测[5]，因其简便、低成本和快速的特点。其中，基于SERS的方法占比超过70%，高度依赖于具有拉曼增强效应的贵金属基底。然而，基底的均匀性、重复性和稳定性难以控制，这降低了方法的重复性[20]。对于荧光法，荧光探针不可或缺，它们可以是有机小分子或纳米材料。方法的灵敏度受荧光探针的光稳定性影响。比色法受到了广泛关注，通过与智能手机集成，可以低成本实现便携式现场检测。

已报道的用于Thr检测的比色传感器主要通过两种方式构建：Thr诱导贵金属纳米粒子分散状态变化[21]、[22]、[23]、[24]，以及目标物引起纳米酶催化活性变化[1]、[2]、[6]、[17]、[18]、[19]。由于银纳米颗粒（AgNPs）和金纳米颗粒（AuNPs）具有独特的局域表面等离激元共振（LSPR）特性，它们被广泛应用于比色检测。苹果酸功能化的AgNPs[24]、碳水化合物衍生物修饰的AgNPs[21]、硅烷功能化的AgNPs[22]和4-巯基苯胺编码的Au NPs[23]已被用于Thr检测。基于Thr介导纳米酶催化活性的比色传感器更为普遍。Thr不仅对一些纳米酶的类过氧化物酶活性（POD）表现出抑制效应[2]、[6]、[18]、[25]、[26]，还能促进酶模拟物的催化活性[1]、[17]、[19]。总体而言，这些比色传感器均基于纳米材料的特性设计，且纳米材料的合成是必不可少的步骤，这使得检测过程复杂化。因此，开发更简便的Thr比色检测方法具有重要的实际意义。

本文提出了一种简便的"信号增强"型比色平台，基于Cu²⁺被激活的双酶类似活性，用于食品和水样品中Thr的多通道检测。Cu²⁺作为比色探针，与Thr配位形成Cu²⁺-Thr配合物。该配合物可在无H₂O₂的条件下催化氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB），生成蓝色产物（oxTMB），表现出类氧化酶（OXD）活性。此外，Cu²⁺-Thr配合物还能催化氧化2,4-二氯酚（2,4-DP），并与4-氨基吡啶（4-AAP）形成粉红色产物，表现出类漆酶（LAC）活性。催化动力学符合米氏方程模型。利用Thr激活Cu²⁺的类OXD和类LAC活性，开发了用于检测Thr的比色方法（方案1）。在优化条件下，检测范围和检出限与涉及纳米材料的方法相当。此外，通过将智能手机与试纸和检测拭子集成，开发了两种便携式传感平台，实现了Thr的现场检测。通过多通道比色法成功测定了湖水、冬瓜和葡萄样品中Thr的浓度，回收率和相对标准偏差（RSD）令人满意。该简便、低成本的比色传感平台在食品安全分析和环境监测方面显示出应用潜力。

章节摘要

试剂

多菌灵（Thr）和TMB购自阿拉丁（中国上海）。4-氨基吡啶（4-AAP）购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。氯化铜（CuCl₂·2H₂O）、Tris（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、2,4-二氯酚（2,4-DP）购自麦克林生化有限公司（中国上海）。其他所有化学品均为分析纯级别，未经进一步纯化直接使用。超纯水用于整个实验过程。

Thr的传感机制

Cu²⁺与Thr之间的配位反应已在先前工作中报道[6]、[10]，配位过程中形成新的CuS键。具体而言，Cu²⁺可触发Thr中SS键的断裂，并与生成的二硫代氨基甲酸根离子形成配位配合物（图1a）[12]、[28]。Cu²⁺与Thr在配位反应中的化学计量比为1:1，形成可溶的Cu²⁺-Thr配合物[29]、[30]。由于硫化铜纳米材料已被证明具有类过氧化物酶

结论

本工作基于Cu²⁺被激活的双酶类似活性，提出了一种用于检测Thr的多通道比色方法。Cu²⁺与Thr之间的配位反应形成了Cu²⁺-Thr配合物，该配合物表现出良好的类OXD和类LAC活性。Cu²⁺-Thr配合物的催化动力学符合米氏方程模型，且某些活性氧（ROS）参与了催化反应。因此，Cu²⁺基于被激活的双

利益冲突声明

作者声明他们不存在可能影响本论文所报告工作的已知的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（项目编号：62001335）和武汉工程大学研究生教育创新基金（CX2025135）的资助。

金紫佳|李尧|岳震辉|赵峰|雷震

武汉工程大学化学与环境工程学院，中国武汉 430205