塑料薄膜覆盖与磷肥施用结合使用可调节冷温带棕壤中的土壤磷组分及微生物功能特性：通过磷酸氧同位素和31P NMR技术的多示踪研究获取的见解

《Soil and Tillage Research》：Plastic film mulching coupled with phosphorus fertilization regulates soil P fractions and microbial functional traits in cold temperate mollisol: A multi-tracer insight from phosphate oxygen isotope and 3?1P NMR

　　•P60 + PFM通过热水热和微生物的变化调节寒冷温带Mollisol土壤中磷的可用性。•P60 + PFM将稳定的土壤磷转化为植物可利用的形式，并丰富好氧细菌和AMF，以促进磷循环。•δ18O-PO43-分析验证了PFM在寒冷温带农业生态系统中增强了微生物磷循环。

1. 引言
磷（P）是维持作物生长和发育不可或缺的大量营养素。土壤中总磷浓度通常在0.1到3克/千克之间，这取决于母质，但只有很小一部分以植物可利用的形式存在；大部分土壤磷被固定在了稳定的矿物或有机复合物中，这在全球范围内严重限制了农业生产力（Porder等人，2007年）。根据结合形式，土壤磷分为无机磷（Pi）和有机磷（Po）（Daneshgar等人，2018年）。土壤Pi主要包含与铁、铝或钙矿物结合的正磷酸盐、焦磷酸盐和多磷酸盐（Condron和Tiessen，2005年）。土壤Po可以用NaOH–EDTA混合溶液提取，并通过13P–NMR进行表征，这可以区分正磷酸盐单酯、二酯和磷酸盐作为主要的有机磷种类（Cade-Menun等人，1996年；Cade-Menun和Liu，2014年；Cade-Menun，2017年）。Hedley等人（1982年）建立了顺序磷分级方法，并由Tiessen和Moir（1993年）进行了改进，这是一种经典的方法，用于量化不同土壤磷组分的可利用性。树脂–P和NaHCO?–P代表容易被植物吸收的活性磷；NaOH–P与铁/铝氧化物结合，而HCl–P以钙结合的磷酸盐化合物形式存在，而残余磷则极难被作物利用（Tiessen和Moir，1993年；Condron和Newman，2011年；Daroub等人，2000年）。
土壤微生物是土壤磷转化的核心调节者，参与Pi的溶解、固定、Po的矿化和植物对磷的吸收（Ducousso-Détrez等人，2022年）。磷脂脂肪酸（PLFAs）是反映微生物群落组成和生物量的可靠生物标志物，因为微生物细胞膜含有特定的脂肪酸结构（Kaiser等人，2010年；Zhang等人，2019年）。含有14-20个碳原子的脂肪酸链主要来自细菌和真菌（Zelles，1999年）。Wu等人（2022年）的一项全球荟萃分析表明，添加磷显著增加了真菌、总细菌、放线菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的PLFA和生物标志物丰度。
磷酸氧同位素（δ1?O–PO?3?）是量化微生物介导的磷循环强度的独特示踪剂。氧有三种天然同位素，其丰度分别为99.759%（1?O）、0.204%（1?O）和0.037%（1?O）。同位素比率公式为δ1?O = (R_sample/R_standard ? 1) × 1000（Tamburini等人，2014年）。正磷酸盐中的P–O键具有高化学稳定性，只能通过酶促和微生物代谢才能断裂，从而触发磷酸盐和土壤水之间的氧交换（Longinelli和Nuti，1973年）。这种同位素交换遵循一个温度依赖的平衡方程T = 111.4 ? 4.3 (δ1?O_P ? δ1?O_w)；测量值和理论δ1?O–PO?3?值之间的平衡偏差越小，表明微生物在磷周转中的作用越强（McLaughlin等人，2006年；Tamburini等人，2014年）。因此，δ1?O–PO?3?可以有效区分非生物地球化学磷转化和生物矿化过程。
土壤温度是控制土壤磷供应和作物磷吸收的主要因素。在中国东北部的春玉米田中，持续的早春低温会导致严重的幼苗冷应激和典型的磷缺乏症状（Song等人，2025年；Liao等人，2026年）。当温度升至10-40℃时，作物的磷吸收显著增加（Xia等人，2021年；Kong等人，2024年）。对当地Mollisols的田间观察显示，在寒冷的春条件下，幼苗出现后21天才会出现明显的叶片磷缺乏症状（Xia等人，2021年；Song等人，2025年）。塑料薄膜覆盖（PFM）是寒冷和干旱地区广泛采用的农艺措施；它可以提高土壤温度，减少蒸发，改善养分转化和微生物活动，并有效缓解低温对玉米幼苗的磷限制（Hu等人，2012年；Liu等人，2013年；Wang等人，2021年；Zhang等人，2024年）。
现有研究已经证实了PFM在半干旱地区的多种益处。PFM可以将土壤总氮矿化和硝化作用降低20-28%，同时促进微生物固氮（Zhang等人，2024年），增加春小麦的地上部分磷浓度，并消耗稳定的钙/铝结合残余磷（Hu等人，2012年）。适度的磷输入与覆膜结合使用可以优化土壤湿度和微生物磷转化，从而提高苜蓿产量（Gu等人，2022年）。当地的黑土实验表明，将磷施用量从75千克P?O?/公顷减少到60千克P?O?/公顷，在不覆膜的情况下仍能保持相当的玉米产量（Wu等人，2016年）。我们的田间试验设置了四种不同的处理方式：零磷施用（P0）、无覆膜的中等磷输入（60千克P?O?/公顷，P60）、无覆膜的高常规磷输入（75千克P?O?/公顷，P75）以及中等磷输入与塑料薄膜覆盖相结合（60千克P?O?/公顷，P60 + PFM）；PFM仅在60千克P?O?/公顷的处理方式下实施，而在所有磷梯度下实施，以便清晰区分单一磷施肥效果和减少磷加上覆膜的交互影响。
尽管PFM在寒冷农业区得到了广泛应用，但大多数关于土壤磷循环的研究主要集中在半干旱和亚热带土壤上，对以高有机碳储量和强磷固定能力为特征的寒冷温带Mollisols的关注不足。此外，由于缺乏特定的分子示踪剂，将PFM、土壤微生物活动和磷转化联系起来的证据仍然很少。为了填补这些研究空白，本研究的核心目标是探索塑料薄膜覆盖和磷施肥对寒冷温带Mollisols中土壤磷组分和微生物功能特性的综合影响。具体研究了四个问题：（1）PFM如何通过改变土壤温度和湿度制度来调节土壤磷的可用性，从而驱动无机和有机磷库的转化；（2）微生物群落在此过程中扮演什么角色，使用PLFA生物标志物分析了PFM和磷施肥对微生物群落结构和功能特性的调节作用，以阐明微生物介导的磷周转途径；（3）PFM和磷施用之间存在哪些交互耦合效应，以及在磷输入量从75千克P?O?/公顷减少到60千克P?O?/公顷的情况下，PFM是否能提供等效或更好的土壤磷供应；（4）磷酸氧同位素（δ1?O–PO?3?）结合13P–NMR能否作为多示踪工具，在分子和同位素水平上量化非生物地球化学过程（吸附-解吸、沉淀-溶解）和生物过程（微生物代谢、酶促水解）对土壤磷转化的相对贡献，这种分析方法在寒冷温带玉米农业生态系统中很少使用。我们假设PFM可以通过重构根际微生物群落来改善土壤磷的生物可用性，而不仅仅是提高土壤温度和湿度。

2. 材料与方法
2.1. 田间描述和实验设计
本研究在中国东北部的黑龙江省哈尔滨市（126°48’–126°51’E，45°49’–51’N）进行，该地区具有寒冷温带大陆性季风气候。年平均气温为3.6℃，年均降水量为486.4–543.6毫米。年积温高于10℃的温度范围为2600–2800℃，每年大约有135天无霜。根据USDA土壤分类系统，实验地点的土壤被归类为Mollisol。在幼苗生长阶段，每天上午9:00使用DH2传感器记录温度和湿度，持续一个月。
2.2. 实验设计和农艺管理
本研究基于2013年开始并持续到2016年的田间实验进行采样和分析。研究前0–20厘米土层的化学性质如下：pH 6.82，总碳（TC）18.24克/千克，总氮（TN）1.62克/千克，总磷（TP）0.63克/千克，Olsen–Pi 18.93毫克/千克，土壤Po 270.21毫克/千克。设置三种Pi肥料施用量处理，包括0、60、75千克P?O?/公顷，以及结合60千克P?O?/公顷的PFM处理（P60 + PFM）。实验采用随机区组设计，每个处理有四个重复。每个小区宽3.9米，长15米，种植6行玉米。使用的玉米品种为“Longdan958”。作为底肥，施用了含有120千克N/公顷的过磷酸钙、60千克K?O/公顷的尿素和90千克K?O/公顷的氯化钾。对于PFM处理，在植株行上覆盖透明聚乙烯薄膜。在薄膜上打小孔播种种子，然后覆盖一层土壤。在喇叭口期，移除薄膜并在植株周围施用90千克N/公顷的氮肥。杂草通过手工除去。
2.3. 土壤和作物采样及测量
2015年和2016年分别在幼苗期采集土壤和植物样本（图1）。拔出植物根部后，轻敲整个根系以去除所有松散的土壤块。使用消毒过的刷子收集紧贴在根表面的土壤，称为根际土壤。在收集每株植物的根际土壤的同时，从植株旁边的无根区域采集0–20厘米深的耕作层土壤作为大块土壤。根际土壤和非根际土壤通过2毫米筛子筛选并均匀混合。一部分土壤样本风干，另一部分新鲜土壤储存在-80℃的冷冻柜中以备后续分析。

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图1. 无覆膜（a）和塑料薄膜覆盖（b）下玉米植物的生长状况。
根际土壤是指紧密附着在玉米根表面的土壤，受到根分泌物和微生物活动的影响，通常位于距离根表面1-2毫米范围内。常见的采样方法是摇动法。大块土壤是指不受玉米根系影响的土壤，通常在距离玉米植物一定距离（20厘米）处采样（Ai等人，2012年）。所有根样本都用清水清洗，然后使用WinRHIZO系统（Regent Instruments Inc., Canada）扫描以获取根长和表面积。收获后，将玉米的籽粒、地上部分和根部分别在70℃的烤箱中干燥至重量恒定。使用元素分析仪（vario PYRO cube，Elementar Analysensysteme GmbH，德国）分析土壤总碳和总氮。土壤总磷用H2SO4–HClO4消化，并通过钼蓝显色法测定（Lu，2000年）。在土壤与水比例为1:2.5的情况下，使用pH计检测土壤pH值。土壤Olsen–Pi用0.5 mol·L?1 NaHCO?提取。土壤Po通过点燃（550℃，1小时）和未点燃土壤之间0.5 mol·L?1 H2SO4提取液中Pi浓度的差值计算（Lu，2000年）。所有提取物中的Pi浓度均通过钼蓝显色法测定（Lu，2000年）。
微生物生物量碳（MB–C）、氮（MB–N）和磷（MB–P）通过氯仿熏蒸提取法测定（Brookes等人，1982年）。MB–C和MB–N用0.5 mol·L?1 K?SO?提取，并使用总有机碳/N分析仪（Multi N/C 3100/HT1300，Analytik Jena AG）分析，而磷含量通过Olsen方法测定（Olsen和Sommers，1982年）。生物量值根据碳、氮和磷的测定结果使用KEC、KEN和KEP作为提取系数计算（Song等人，2018年）。
土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性通过上述荧光微孔板酶测定法测定。称量相当于1.0克干土壤的新鲜土壤，然后加入100毫升50 mmol·L?1的醋酸钠缓冲液。彻底摇动混合物，并使用磁力搅拌器持续搅拌以保持土壤悬浮液的均匀性。使用pH值为8.0的缓冲液测定碱性磷酸酶活性，而pH值为6.0的缓冲液用于测定酸性磷酸酶活性。对于其他胞外酶，使用调整至测试土壤固有pH值的缓冲液。
依次将缓冲液、土壤悬浮液、标准底物和相应的酶底物吸取到黑色96孔微孔板中。总共设置了五个测定组：样品测定组：200 μL土壤悬浮液 + 50 μL底物溶液；标准参考组：200 μL土壤悬浮液 + 50 μL标准溶液；样品空白对照：200 μL土壤悬浮液 + 50 μL缓冲液；底物空白对照：200 μL缓冲液 + 50 μL底物溶液；荧光标准组：200 μL缓冲液 + 50 μL标准溶液。封闭微孔板后，在室温下暗处孵育4小时。使用多功能微孔板读取器（Fluoroskan Ascent FL，Thermo Scientific，美国）在365 nm激发波长和450 nm发射波长下测量荧光强度。细胞外酶活性（单位：nmol h?1 g?1）通过以下公式计算：
**淬灭系数 =（标准参考组的荧光值 ? 样品空白对照的荧光值）/ 标准荧光组的荧光值**
**激发系数 = 标准荧光组的荧光值 / 0.5 nmol**
**净荧光值 =（样品测定组的荧光值 ? 样品空白对照的荧光值）/ 淬灭系数** ? **底物空白对照的荧光值**
**细胞外酶活性（nmol h?1 g?1）= 净荧光值 × 100 / (激发系数 × 0.2 mL × 孵育时间（h）× 干土重量（g）**

2.4. 土壤磷的分级萃取
土壤磷的分级采用Hedley（1982）开发的改良顺序萃取法进行。土壤样品依次使用两种碳酸氢根阴离子交换树脂膜条（2 × 1.5 cm2）、0.5 mol L?1 NaHCO?、0.1 mol L?1 NaOH、1 mol L?1 HCl（并加入超声处理）、1 mol L?1 HCl以及浓H?SO?进行消化，消化时间为3小时。每种提取物的Pi含量采用Olsen方法测定。对于0.5 mol L?1 NaHCO?（pH 8.5）、0.1 mol L?1 NaOH和1 mol L?1 HCl提取物，通过过硫酸盐消化法测定TP含量，Po表示TP与Pi之间的差值。磷的多步骤顺序萃取方案包括以下组分：Resin–Pi、NaHCO?–Pi、NaHCO?–Po、NaOH–Pi、NaOH–Po、HCl–Pi、浓HCl–Pi和Residual–P。

2.5. 31P核磁共振分析
对于液体31P核磁共振分析，将2.500克风干土壤通过1毫米筛网筛选后，与50毫升0.25 mol L?1 NaOH–50 mmol L?1 Na?EDTA溶液混合。混合物在20℃下持续振荡16小时后，以8000转/分钟的速度离心30分钟。上清液通过定性滤纸过滤，取30毫升与1.5毫升内标溶液（含有50 μg L?1亚甲基二膦酸，Sigma，≥99%）混合。然后混合物在Christ Beta 1–8 LD Plus（德国）中冻干。所得干粉（约200毫克）溶解在1.0 mol L?1 NaOH–50 mmol L?1 Na?EDTA溶液中，并加入0.1毫升D?O以锁定信号。溶液在4℃下以8000转/分钟的速度离心8分钟后，取800微升上清液转移到5毫米核磁共振管中进行分析。核磁共振测量使用Bruker AVANCE III HD 400 M仪器，配备BBO探头和5毫米标准腔体。31P谱的脉冲P1为14微秒，共振频率为161.52 MHz，循环延迟（dl）为2.0秒，共进行20,480次扫描，测量温度为298 K。所有31P化学位移均以85%磷酸为标准参照。

2.6. 磷脂脂肪酸（PLFA）分析
利用磷脂脂肪酸（PLFA）分析（Wu等人，2009年）确定土壤微生物群落组成。土壤样品经冻干后，使用氯仿、甲醇和柠檬酸缓冲液（体积比1:2:0.8，pH 4.0）的单一相混合物提取PLFA。中性脂质和糖脂通过硅胶固定相柱（SPE–Si，Supelco，英国）用氯仿和丙酮分离。非十九烷酸甲酯（19:0）作为内标。随后，极性脂质通过温和的碱性甲醇水解转化为脂肪酸甲酯。干燥后，脂肪酸甲酯重新溶解在正己烷中，并通过气相色谱（N6890，Agilent Technologies，美国圣克拉拉）和MIDI Sherlock微生物鉴定系统Version 4.5（MIDI Inc., 美国纽瓦克）进行定量和鉴定。内标（19:0）峰用于计算PLFA浓度，以每克干土中的纳米摩尔数表示。

2.7. δ1?O–PO?3?和δ1?O–H?O的测定
NaHCO?–Pi的富集和纯化过程遵循Wen（2017年）基于Zohar（2010年）的方法进行改进。称量2.5克通过2毫米筛网筛选的土壤样品，放入500毫升塑料瓶中。加入300毫升0.5 mol L?1 NaHCO?溶液（pH 8.5），在25℃下以180转/分钟的速度振荡16小时。加入P自由活性炭粉以去除有机物和溶液颜色。以3000转/分钟的速度离心5分钟后，收集上清液，并用3 mol L?1硝酸调节pH至1以缓慢去除HCO??。为了富集Pi，将pH调节至10.5，加入1 mol L?1 NaOH。接下来，加入5克六水合硝酸镁过夜共沉淀。以3000转/分钟的速度离心后，用3 mol L?1 HNO?溶解沉淀物，并用2 mol L?1醋酸钠调节pH至5.5。加入20克DAX–8（40–60目，Sigma Aldrich）过夜去除样品中的有机物。过滤后，再加入1克硝酸铈进一步纯化磷酸铈沉淀物，然后在4℃下过夜。离心并用0.5 mol L?1醋酸钠洗涤三次后，用1 mol L?1 HNO?溶解磷酸铈沉淀物。洗涤超纯水后，加入1克阳离子交换树脂，振荡16小时以去除溶液中的杂质。调节溶液pH至约7后，加入1克硝酸银形成Ag?PO?沉淀。Ag?PO?沉淀物在50℃下洗涤直至检测不到Ag?离子。沉淀物在烤箱中干燥，并在暗处储存以进行氧同位素分析。

关于0.5毫克Ag?PO?样品，将其包裹在银舟中，使用热转化元素分析仪（Vario Pyro Cube，Elementar GmbH）在1450℃下测量δ1?O?PO?3?值，该分析仪连接至同位素比率质谱仪（Isoprime 100，Elementar GmbH）。所有同位素比率均相对于维也纳标准海水（VSMOW）表示。田间土壤水分使用低温真空萃取装置（LI–2000，LICA公司，中国）在超低压和低温下提取。水中氧同位素的测量使用液体水同位素分析仪（Los Gatos Research 912–0050，美国），测量精度为δ1?O/δ1?O < 0.1‰。

2.8. 统计分析
数据使用SPSS Version 18.0进行单因素方差分析。均值之间的差异通过多重范围检验在0.05概率水平下评估。标准差作为均方根误差计算。微生物结构的主成分分析（PCA）和图表生成使用OriginPro 2021完成。平衡方程的偏差（△?δ1?O–PO?3?）计算为δ1?O–PO?3?（测试值）? δ1?O–PO?3?（计算值）。偏最小二乘结构方程建模（PLS–SEM）在R4.6.1中使用pspm包实现。

3. 结果
3.1. 植物生长
磷酸肥料施用对玉米根系生长或植物生物量没有显著影响（表1）。相比之下，在苗期施用PFM显著增加了总根长、根系表面积和植物干物质积累。然而，PFM并未促进玉米产量。值得注意的是，2016年无磷酸肥料处理的玉米产量显著低于其他处理组。

表1. 不同处理下玉米植物的生长、生物量和产量
| 年份 | Pi肥料施用量（kg P?O? ha?1） | 根长（cm plant?1） | 根系表面积（cm2 plant?1） | 植物干物质（g plant?1） | P含量（kg ha?1） | 产量（kg ha?1） |
|------|-----------------|--------------|------------------|------------------|------------------|-------------|
| 2008 | 29.92 ± 25 | 55.87 | b | 0.70 ± 0.11 | bc | 0.16 ± 0.03 | 12.75 ± 0.16 |
| | | | | | | |
| 2015 | 60 | 65.46 ± 14.83 | b | 0.47 ± 0.06 | bc | 0.18 ± 0.03 | 12.50 ± 0.52 |
| | | | | | | |
| | + PFM | 130 | 66.60 ± 25.69 | a | 265.10 ± 28.83 | a | 0.31 ± 0.02 | 12.99 ± 0.79 |
| | | | | | | |
| | | 75 | 28.90 ± 105.34 | b | 190.97 ± 25.37 | b | 0.80 ± 0.14 | 0.20 ± 0.03 | 12.92 ± 0.86 |
| | | | | | | |
| 2016 | 60 | 60 | 65.95 ± 13.37 | b | 0.19 ± 0.04 | 0.10 ± 0.02 | 11.3 ± 0.55 | |
| | | + PFM | 124.15 ± 15.08 | a | 86.94 ± 7.80 | a | 0.29 ± 0.03 | 12.23 ± 0.19 | |
| | | 75 | 191.86 ± 25.45 | ab | 56.83 ± 6.30 | b | 0.21 ± 0.03 | 0.13 ± 0.05 | 12.15 ± 0.49 |
| | | | | | | |
| | | | 0 | 66.76 ± 12.09 | b | 0.23 ± 0.03 | 0.11 ± 0.01 | 12.23 ± 0.71 | a |
| | | + PFM | 224.15 ± 15.08 | a | 86.94 ± 7.80 | a | 0.22 ± 0.04 | 12.23 ± 0.19 | |
| | | 75 | 191.86 ± 25.45 | ab | 56.83 ± 6.30 | b | 0.21 ± 0.03 | 0.13 ± 0.05 | 12.15 ± 0.49 |
| | | | | | | |
**注：**值为平均值±标准误差。同一列中不同小写字母表示p < 0.05的显著差异。PFM表示在苗期施用的塑料薄膜覆盖。

3.2. 土壤性质
不施用PFM时，根际土壤（RS）的pH值低于非根际土壤（BS）（表2）。2015年，P60 + PFM处理显著提高了根际pH值和总氮（TN）。2015年和2016年，PFM显著增加了根际和非根际土壤的总碳（TC）含量。Olsen–Pi浓度在根际土壤中始终低于非根际土壤，并且随着磷酸施用量的减少而降低——最低值（20.80–23.43 mg kg?1）出现在无磷酸肥料处理组。与P60处理相比，P60 + PFM ??显著增加了根际和非根际土壤中的Olsen–Pi含量。PFM处理下的土壤温度和湿度显著高于非覆盖处理。具体而言，2015年和2016年，PFM处理下的土壤温度和湿度分别为27.42℃和14.56%，17.01%；而非覆盖处理下的分别为25.05℃和12.49%，15.61%。平均而言，PFM处理下的土壤温度和湿度比非覆盖处理高2.14℃和2.79%。

表2. 苗期0–20厘米深度土壤的物理化学性质
| 年份 | Pi肥料施用量（kg P?O? ha?1） | pH（H?O） | TC（g kg?1） | TN（g kg?1） | Olsen–Pi（mg kg?1） | 温度（℃） | 土壤水分含量（%） |
|------|----------------:|----------:|-----------:|-------------:|-----------:|------------:|--------------:|
| 2015 | BS | 07.01 ± 0.05 | a | 15.48 ± 0.39 | b | 22.53 ± 2.16 | c |
| | P60 | 6.90 ± 0.06 | a | 14.88 ± 0.30 | b | 34.95 ± 3.92 | b |
| | + PFM | 6.83 ± 0.14 | a | 16.38 ± 0.75 | a | 16.10 ± 0.29 | a |
| | | 39.75 ± 1.48 | a | 27.42 ± 0.47 | a | 14.56 ± 0.87 | a |
| | | 60 + PFM | 6.69 ± 0.08 | c | 15.58 ± 0.43 | b | 14.66 ± 0.03 | b |
| | | | 16.38 ± 0.26 | a | 39.75 ± 0.26 | a | 16.10 ± 0.29 | a |
| | | 60 | 6.69 ± 0.08 | c | 15.58 ± 0.43 | b | 12.18 ± 1.51 | c |
| | | | 60 + PFM | 6.92 ± 0.04 | a | 16.50 ± 0.22 | a | 15.77 ± 0.09 | a |
| | | | 39.95 ± 0.26 | a | | 60 | 07.00 ± 0.05 | a |
| | | | 60 | 07.00 ± 0.05 | a | 13.63 ± 0.61 | ab | |
| | | | 60 | 07.03 ± 0.09 | a | 13.33 ± 0.40 | ab | |
| | | | 60 | 07.74 ± 0.28 | b | 15.61 ± 0.53 | b |
| | | + PFM | 6.70 ± 0.17 | b | 14.20 ± 0.43 | a | 14.10 ± 0.04 | a |
| | | | 60 | 07.93 ± 0.25 | a | 30.44 ± 0.31 | a | |
| | | | 60 | 17.01在根际土壤中，与未覆盖膜的处理相比，PFM处理下MB–C、MB–N和MB–P的含量更高。土壤酸性和碱性磷酸酶的结果显示，与P60处理相比，P60 + PFM显著提高了 bulk 土壤和根际土壤中的酶活性（图5）。下载：下载高分辨率图片（315KB）下载：下载全尺寸图片

图4. 2015年和2016年不同磷处理以及PFM处理下根际土壤和bulk土壤中的微生物生物量碳（MB–C）（a）、氮（MB–N）（b）和磷（MB–P）（c）的浓度。下载：下载高分辨率图片（250KB）下载：下载全尺寸图片

图5. 不同处理下土壤碱性磷酸酶活性（a）和酸性磷酸酶活性（b）。

3.6. 土壤PLFAs和微生物群落多样性
总磷脂脂肪酸（PLFA）浓度范围为42.48至77.66 nmol PLFA g?1，并受到塑料薄膜覆盖的显著影响（图6a）。根际土壤中的总PLFAs含量高于bulk土壤，特别是在P75和P60 + PFM处理下。2015年，P60 + PFM下的根际土壤表现出显著更高的总PLFA浓度，而P0和P60之间没有显著差异。2016年，P60 + PFM下的根际土壤的总PLFA浓度也显著高于其他处理，P60处理的总PLFA浓度最低。根际土壤中的革兰氏阳性（G?）/革兰氏阴性（G?）细菌比例明显低于bulk土壤，塑料薄膜覆盖对这一比例有显著影响（图6b）。这些G?/G?比例的变化表明玉米根系、土壤温度和土壤湿度共同影响微生物群落组成。

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图6. 不同处理下土壤的总PLFAs（a）和G?/G?比例（b）。
2015年，P75和P60处理之间的微生物群落组成没有显著差异。2016年，bulk土壤中的厌氧细菌和放线菌的数量在P60处理下显著低于P75处理。在P0处理下，根际土壤中的好氧细菌和放线菌的数量显著高于P60处理。塑料薄膜覆盖增加了根际中的好氧细菌和丛枝菌根真菌（AMF）的数量。塑料薄膜覆盖下的根际土壤观察到较低的Shannon指数，表明在这种条件下存在优势的微生物类群——尤其是在2016年（表4）。

表4. 2015年和2016年玉米幼苗期土壤的微生物群落结构。

好氧细菌
厌氧细菌
放线菌
真菌
AMF
Shannon指数

a 10.87 ± 1.51a
b 5.66 ± 0.39a
c 2.93 ± 0.15a
d 6.47 ± 0.89a
e 1.36 ± 0.22a
f 2.63 ± 0.02b
2015年
P60
g 11.68 ± 0.70a
h 6.50 ± 0.06a
i 2.47 ± 0.24a
j 6.89 ± 0.74a
k 1.35 ± 0.01a
l 2.68 ± 0.04a
m
P60 + PFM
n 12.00 ± 0.19a
o 5.17 ± 1.23b
p 1.76 ± 0.94b
q 6.74 ± 0.38a
r 1.21 ± 0.11a
s 2.56 ± 0.01c
t
P75
u 10.55 ± 2.42a
v 6.28 ± 0.46a
w 2.10 ± 0.79a
x 5.81 ± 1.64a
y 1.17 ± 0.24a
z 2.70 ± 0.05a
m
RSP0
o 11.79 ± 1.24b
p 7.25 ± 0.49a
q 2.94 ± 0.22a
r 8.18 ± 1.14a
s 1.31 ± 0.13b
t 2.59 ± 0.03a
u
P60
v 12.11 ± 1.13b
w 7.14 ± 0.60a
x 2.94 ± 0.27a
y 7.94 ± 1.09a
z 1.35 ± 0.22b
r 2.59 ± 0.03a
m
P60 + PFM
n 15.87 ± 2.62a
o 7.45 ± 0.98a
p 3.39 ± 0.46a
q 8.99 ± 1.10a
r 1.70 ± 0.09a
s 2.55 ± 0.03a
m
P75
o 14.42 ± 0.66ab
p 7.84 ± 0.53a
q 3.55 ± 0.44a
r 9.04 ± 1.22a
s 1.59 ± 0.19ab
t 2.57 ± 0.02a
m
BSP0
o 10.25 ± 0.62a
p 4.83 ± 0.49ab
q 5.88 ± 0.24c
r 5.21 ± 0.34a
s 1.23 ± 0.08a
t 2.67 ± 0.01ab
2016
o 9.32 ± 1.05a
p 3.91 ± 0.54b
q 5.27 ± 0.31c
r 4.48 ± 1.49a
s 1.10 ± 0.36a
t 2.70 ± 0.02a
m
P60 + PFM
o 8.62 ± 2.09a
p 4.43 ± 0.28ab
q 8.68 ± 1.69a
r 6.50 ± 1.34a
s 1.43 ± 0.19a
t 2.65 ± 0.01b
m
P75
o 10.23 ± 0.35a
p 5.71 ± 1.52a
q 7.24 ± 0.21b
r 5.04 ± 0.27a
s 1.20 ± 0.06a
t 2.67 ± 0.01ab
m
RSP0
o 11.19 ± 1.81b
p 5.26 ± 0.54b
q 6.63 ± 0.80b
r 6.37 ± 0.67c
s 1.31 ± 0.22b
t 2.65 ± 0.04b
m
P60
o 8.86 ± 0.64c
p 4.54 ± 0.45bc
q 5.08 ± 0.25c
r 7.03 ± 0.08b
s 1.06 ± 0.09b
t 2.70 ± 0.02a
m
P60 + PFM
o 14.54 ± 0.56a
p 7.07 ± 0.54a
q 8.42 ± 0.04a
r 8.07 ± 0.83a
s 1.76 ± 0.14a
t 2.57 ± 0.01c
m
P75
o 10.00 ± 0.62bc
p 5.46 ± 0.09b
q 5.19 ± 0.49c
r 6.42 ± 0.16c
s 1.19 ± 0.11b
t 2.68 ± 0.02a
值以平均值 ± 标准误差表示。同一列中不同的小写字母表示p < 0.05时的显著差异。

在所有处理中检测到45种PLFAs（图7）。主成分分析（PCA）显示，土壤微生物结构显著受到塑料薄膜覆盖和玉米根系的影晌（图7a, c）。在这两年中，主成分1和2（PC1和PC2）分别解释了2015年总方差的61.6%和14.0%，以及2016年的41.9%和18.0%（图7b, d）。在所有处理中，bulk土壤的得分均高于根际土壤。

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图7. 2015年（a, b）和2016年（c, d）PLFAs的主成分分析。

在bulk土壤中，P60和P60 + PFM处理之间的PLFA轮廓有明显区分，P60 + PFM在PC1上的得分更高。在PC2上，bulk土壤和根际土壤的PLFA轮廓有显著区分。在根际土壤中，P60 + PFM处理的微生物结构在PC1上与其他处理明显不同。P60 + PFM的根际土壤主要由PLFAs 15:0 iso、15:0 ante、16:0 2OH、18:1 ω7c、18:2 ω6,9c和18:1 ω5c等微生物群落特征，主要为G?细菌、真菌和好氧细菌。

3.7. δ18O?PO43?
图8a显示了δ1?O?PO?3?和δ1?O?H?O的值，而图8b展示了2016年的分数平衡偏差（△δ1?O?PO?3?）。δ1?O?PO?3?的值范围为17.51‰至19.24‰，显著高于δ1?O–H?O的值（–7.24‰至–2.23‰）。在覆盖有塑料薄膜的根际土壤中，δ1?O–PO?3?的值高于非根际土壤，而δ1?O–H?O的值在覆盖条件下最低。对于未覆盖的土壤，根际土壤的分数平衡偏差范围为–0.16‰至1.68‰，而非根际土壤的范围为1.92‰至2.37‰。对于覆盖有塑料薄膜的土壤，根际土壤的偏差范围为–0.32‰至0.40‰，而非根际土壤的范围为0.24‰至1.03‰。最小的偏差出现在覆盖有薄膜的根际土壤中，而最大的偏差出现在未覆盖的非根际土壤中。这些结果表明，在覆盖和根际环境中，酶和微生物活性更强，导致磷的生物可利用性更高。

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图8. 2016年土壤的δ18O – PO43?和δ18O – H2O值（a）以及△δ18O – PO43?（b）。

3.8. 水热条件与根形态、干物质积累和土壤磷组分的相关性分析以及PLS-SEM解释
相关性分析显示，土壤水热条件、土壤磷组分、微生物特性、根系特征和植物磷相关指标之间存在密切关联（图9）。土壤温度（T）和土壤含水量（SWC）与总微生物PLFA、碱性磷酸酶（ALPase）、微生物生物量-P（MB?P）以及活性磷池（包括Olsen–Pi和Resin–Pi）呈正相关。较高的土壤温度和湿度也与根系形态指标（根长RL、根表面积RS、根平均直径RA、根体积RV）、植物干物质（PM）和植物磷积累（PA）呈显著正相关（*p < 0.05）。活性无机磷组分与根系形态和植物磷积累呈正相关，而某些中度活性的有机磷组分则与这些根系-植物变量呈负相关。此外，土壤总碳（TC）和总氮（TN）与根系生长和植物磷积累呈正相关。总体而言，改善的土壤水热条件可以刺激微生物活性，促进活性土壤磷组分的分解，促进根系发育，最终增强植物磷积累。

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图9. 水热条件与根形态、干物质积累和磷组分之间的相关性分析（T，温度；SWC，土壤含水量；RL，根长；RS，根表面积；RA，根平均直径；RV，根体积；PM，植物干物质；PA，磷积累）（注：仅分析统计显著的指标）。

PLS-SEM被用来揭示塑料薄膜覆盖对bulk土壤和根际土壤中磷转化的调控途径（图10a?d）。塑料薄膜覆盖显著改善了bulk土壤（路径系数 = 0.70，***p < 0.001）和根际土壤（0.67，***p < 0.001）的水热条件。改善的水热条件积极促进了根系形态和微生物群落的发展。在bulk土壤中，微生物群落对磷组分和植物磷积累没有显著的直接影响。相比之下，根际微生物群落对磷组分（*p < 0.05）和磷积累（**p < 0.01）有显著的直接影响。总效果分析进一步表明，根系形态对bulk土壤中的磷积累有最强的总影响。对于根际土壤，水热条件的影响最大，其次是微生物群落，然后是根系形态和磷组分。这些发现表明，覆盖驱动的磷获取主要依赖于bulk土壤中的根系介导的途径，而根际土壤则受到根系生长和微生物过程的共同作用。

4. 讨论
4.1. 磷施用和塑料薄膜覆盖对土壤物理化学环境的改变
PFM对玉米幼苗生长表现出持续而显著的促进作用，这体现在总根长、根表面积和植物干物质积累的显著增加上（表1）。这种促进生长的效果主要归因于PFM改善了土壤水热条件，特别是土壤温度和土壤湿度的提高（表2和图9）。这些优化条件有助于加速根系伸长，促进根系发育，并促进植物对养分的吸收（Dong等人，2009年；Ding等人，2023年），这对于中国东北部寒冷温带地区玉米幼苗的生长尤为重要，因为低温常常限制早期生长。相比之下，三种磷（P）施用量（0、60、75 kg P?O? ha?1）对玉米根系生长或地上生物量没有显著影响（表1）。这一结果表明，在研究区域的寒冷温带气候条件下，PFM在调节玉米早期生长方面比磷施用量起更重要的作用，这可能与缓解低温胁迫对幼苗生长的紧迫性有关。

土壤pH值、总碳（TC）、总氮（TN）和Olsen–Pi受到磷施用和PFM的共同调节（表2和图9）。在未覆盖膜的处理中，根际土壤的pH值始终低于bulk土壤（表2）。这种现象可能是由于玉米根系分泌有机酸和其他物质（Teng等人，2018年），这些物质可以酸化根际微环境，促进土壤养分的溶解。PFM被发现降低了bulk土壤的pH值，这可能是由于在水热条件改善的情况下，土壤有机碳和氮的矿化作用增强（Hai等人，2015年；Wang等人，2017年），从而导致土壤硝酸盐氮浓度增加，进而使pH值下降。然而，玉米根系在生长过程中吸收的硝酸盐氮减少了根际土壤中硝酸盐的积累，从而防止了根际土壤pH值的显著下降（Gao等人，2009年；Wang等人，2015年）。Olsen–Pi浓度是土壤有效磷的重要指标，随着磷施用量的减少而降低，在无磷处理（P0）中观察到最低值（20.80–23.43 mg kg?1）。与未覆盖膜的P60处理相比，P60 + PFM显著增加了根际和bulk土壤中的Olsen–Pi含量（表2）。这一结果与Zhang等人（2017年）的报告一致，他们发现磷施用与Olsen–Pi浓度呈正相关，并进一步扩展了这些发现，表明PFM可以独立于磷的投入来提高土壤磷的有效性，这可能与PFM促进了磷的转化有关。

值得注意的是，在实验期间，尤其是在根际土壤中，PFM降低了土壤中的TC和TN含量（表2）。这与Li等人（2004年）和Mo等人（2具体来说，在PFM处理下，HCl–Pi的含量增加了18.6%，而NaHCO?–Po和残留–Pi的含量分别减少了14.26%和6.09%。这种转变效应在根际土壤中尤为明显，PFM显著增加了树脂–Pi的比例，并减少了浓缩的HCl–Po的比例，表明PFM可以特异性地增强根际中的磷的迁移。PLS?SEM（图10）进一步使我们能够通过标准化的路径系数定量解析水热改善和微生物群落重建对磷有效性之间的相对贡献。在bulk土壤中，尽管塑料薄膜诱导的水热改善显著重塑了微生物群落（0.65，***p < 0.001），但这些微生物变化未能直接驱动土壤中磷组分的变化（0.18，ns）。这表明微生物途径对bulk土壤中磷的有效性的贡献较小；相反，水热改善主要通过刺激根系形态发育来调节磷的有效性。相比之下，根际土壤表现出明显的微生物驱动途径：除了根系介导的调节外，重建的微生物群落对磷组分有显著的直接贡献（0.38，*p < 0.05）。因此，水热改善是覆膜下的根本驱动力，但其功能输出在不同的土壤区室中有所不同。bulk土壤中的磷有效性主要响应于由更好的水热状态引发的根系相关变化，而根际土壤中的磷有效性则受益于根系生长和微生物群落重建。较高温度可以通过增强磷酸酶的活性来加速有机磷（Po）的分解（Luo等人，2024年），从而促进中等稳定性的NaHCO?–Po转化为植物可利用的HCl–Pi，同时减少HCl–Pi向稳定残留Pi的转化。3?1P???NMR分析进一步证实了这一机制：正磷酸盐和正磷酸酯酯是土壤中的主要磷化合物，分别占可提取磷总量的大约58%–61%和38%–41%，PFM处理增加了根际和bulk土壤中的这些化合物的含量（表3）。这些发现与Zhang等人（2013年）的研究结果一致，他们报告说正磷酸盐和正磷酸酯酯是中国东北黑土中的主要磷化合物。然而，本研究还发现PFM可以通过促进有机磷的矿化来增强这些磷化合物的生物有效性。根际土壤和bulk土壤在PFM处理下表现出不同的磷转化模式。在没有覆膜的处理中，根际土壤中的正磷酸酯酯含量高于bulk土壤。然而，PFM逆转了这一趋势（表3），表明PFM加速了根际中正磷酸酯酯向正磷酸盐（植物可利用的Pi）的转化。在bulk土壤中，PFM增加了总可提取磷、正磷酸盐和正磷酸酯酯的含量（表3），表明PFM对土壤磷组分的调节作用超出了根际范围，并通过改善水热条件影响到整个耕作层。较高温度可以通过增强磷酸酶的活性来加速有机磷（Po）的分解（Luo等人，2024年），从而促进中等稳定性的NaHCO?–Po转化为植物可利用的HCl–Pi，同时减少HCl–Pi向稳定残留Pi的转化。3?1P???NMR分析进一步证实了这一机制：正磷酸盐和正磷酸酯酯是土壤中的主要磷化合物，分别占可提取磷总量的大约58%–61%和38%–41%，PFM处理增加了根际和bulk土壤中的这些化合物的含量（表3）。这些发现与Zhang等人（2013年）的研究结果一致，他们报告说正磷酸盐和正磷酸酯酯是中国东北黑土中的主要磷化合物。然而，本研究进一步发现PFM可以通过促进有机磷的矿化来增强这些磷化合物的生物有效性。根际土壤和bulk土壤在PFM处理下表现出不同的磷转化模式。在没有覆膜的处理中，根际土壤中的正磷酸酯酯含量高于bulk土壤。然而，PFM逆转了这一趋势（表3），表明PFM加速了根际中正磷酸酯酯向正磷酸盐（植物可利用的Pi）的转化。在bulk土壤中，PFM增加了总可提取磷、正磷酸盐和正磷酸酯酯的含量（表3），表明PFM对土壤磷组分的调节作用超出了根际范围，并通过改善水热条件影响到整个耕作层。焦磷酸盐仅占总可提取磷的1.3%–1.4%，并且与土壤性质没有显著相关性，证实了其在土壤磷循环中的次要作用（Zhang等人，2013年）。在31P–NMR光谱中没有观察到磷酸二酯信号（化学位移范围：2.5至?3 ppm），这与之前几项研究的结果一致（Turner等人，2003年；Cade-Menun和Liu，2014年）。这种现象主要是由于微生物对易降解有机磷的快速矿化和分解；这些过程通常会耗尽磷酸二酯并将其浓度降低到检测限以下（Cade-Menun和Liu，2014年）。此外，土壤中的磷酸二酯天然只占总磷的2%–17%，这一比例接近NMR技术的检测限。此外，磷酸二酯具有较低的电荷密度，并且与土壤矿物的结合力较弱。这些固有特性使它们容易通过微生物酶促水解而迅速降解（Turrión等人，2001年）。4.3. 土壤微生物群落对磷施用和塑料薄膜覆盖的响应通过磷脂脂肪酸（PLFA）分析，土壤微生物群落显著受到了PFM的影响（图6a）。总PLFA浓度是微生物生物量的指标，随着磷施用量的减少而降低，这与Rooney和Clipson（2009年）的研究结果一致，他们报告说磷的限制可以降低土壤微生物活性。然而，PFM对微生物群落的影响比磷施用量更为显著：在P60?+?PFM处理中，总PLFA浓度显著高于其他处理，尤其是在根际土壤中（图6a）。此外，PFM增加了根际中好氧细菌、丛枝菌根真菌（AMF）和真菌的丰度（表4）。这与Wang等人（2014年）的研究结果一致，他们证明了PFM可以通过改善土壤湿度和温度条件来增强微生物活性。根际土壤和bulk土壤之间的微生物群落结构不同。根际土壤主要由革兰氏阴性（G?）细菌和真菌主导，而bulk土壤则以革兰氏阳性（G?）细菌为主。这种模式反映了两种土壤区室之间碳源可用性的差异：G?细菌 prefer 新鲜的碳源，如根系分泌物，而G?细菌更适应利用较老的、腐殖化的有机物（Potthast等人，2012年）。PFM通过降低根际中的G?/G?比率进一步改变了这种群落结构（图6b），表明改善的水热条件和增加的易降解碳含量更有利于G?细菌和真菌的生长。PLS?SEM结果进一步显示，微生物对玉米植物磷积累的总体效应在根际土壤中高于bulk土壤（图10 c,d）。主成分分析（PCA）证实PFM和玉米根是微生物群落分化的首要驱动因素（Li等人，2004年；Li等人，2022年）。PC1是解释土壤PLFA组成变化的主要轴，分别占41.9%（2015年）和61.6%（2016年），这一主要梯度主要反映了由塑料薄膜覆盖（PFM）管理和根际效应（bulk土壤 vs. 根际土壤）在连续两年间的综合差异化。塑料薄膜覆盖改变了土壤的水热条件，共同扩大了由PC1反映的磷-根际环境梯度范围。从2015年（41.9%）到2016年（61.6%），PC1的解释率增加，表明连续的塑料薄膜覆盖增强了种植年份间磷-根际环境过滤对土壤微生物群落的筛选作用（Dini-Andreote等人，2015年）。如PLFA加载生物图（图7a, c）所示，革兰氏阴性细菌、真菌和好氧细菌的丰富生物标志物脂肪酸（15:0 iso, 15:0 anteiso, 16:0 2OH, 18:1 ω7c, 18:2 ω6,9c等）与PC1有强烈的正相关性。这进一步证实了PC1梯度体现了土壤微生物群体的渐进性演替：塑料覆盖和根际微生境共同促进了大量营养型微生物（G?细菌、真菌）的增殖，这是PC1所捕捉到的核心生态过程（Fierer等人，2007年；Yin等人，2025年）。Shannon指数是衡量微生物多样性的指标，在PFM处理下的根际土壤中较低，特别是在2016年（表4），表明形成了适应优化水热和营养条件的优势微生物类群。在这些微生物类群中，AMF在PFM处理下的丰度显著增加（表4）。AMF在土壤磷循环中起着关键作用：它们可以扩展植物根系的吸收范围，增强植物对土壤磷的吸收，并刺激菌丝体中微生物的活性（Allen, 1991年；Wang等人，2023年）。这些发现共同表明，PFM创造了富氧、富含营养的根际环境，有利于好氧微生物和AMF的生长，而磷的减少则抑制了整体微生物生物量并改变了群落组成。4.4. 微生物活性与磷循环之间的耦合机制：来自氧同位素的证据在两年的研究期间，根际土壤中的微生物生物量碳（MB?C）、微生物生物量氮（MB?N）和微生物生物量磷（MB?P）的浓度始终高于bulk土壤，塑料薄膜覆盖（PFM）进一步提高了根际中的这些参数（图4和图10）。这证实了PFM通过优化土壤水热条件和提高养分有效性来促进微生物生长（Wang等人，2014年；Li等人，2021年）。值得注意的是，在PFM处理下的根际土壤中，MB?P含量达到了8.46?mg/kg，而Olsen-Pi浓度在根际中较低（平均：30.65?mg?kg?1），而在bulk土壤中较高（平均：38.84?mg?kg?1）。这种模式表明玉米根和土壤微生物之间可能存在磷的竞争；然而，微生物磷库的快速周转（Seeling和Zasoski，1993年；Oberson等人，2001年）使得固定的磷能够迅速释放回土壤中，抵消了竞争限制并保持了植物可利用的磷供应。下载：下载高分辨率图像（302KB）下载：下载全尺寸图像下载：下载高分辨率图像（311KB）下载：下载全尺寸图像下载：下载高分辨率图像（192KB）下载：下载全尺寸图像图10. a. 部分最小二乘结构方程建模（PLS–SEM）揭示了塑料薄膜覆盖对bulk土壤中磷组分转化的调控机制（***p?基于在中国东北地区漫岗土上进行的一项野外试验，本研究通过顺序磷分级、31P核磁共振光谱（31P NMR）分析、磷脂脂肪酸（PLFA）分析以及磷酸盐氧同位素追踪技术，探讨了在低温春季条件下，塑料薄膜覆盖（PFM）对土壤磷转化及根际微生物群落的影响。研究表明，PFM通过优化土壤水热条件，激活了难利用的稳定磷库，并重塑了根际微生物群落结构，从而增强了磷酸酶活性并促进了微生物介导的磷循环，成为缓解低温磷限制的关键因素。P60+ PFM被认为是一种具有前景的农业措施，能够满足玉米苗期的磷需求，缓解缺磷现象，并防止土壤中磷的过量积累。尽管该策略在短期内主要促进了幼苗生长而非增加籽粒产量，但它有效激发了土壤中的磷资源，减少了化学磷的投入，为寒冷地区春播玉米的可持续磷管理提供了支持。由于本研究仅限于幼苗阶段，其结果无法全面反映整个生长季的磷动态变化。因此，需要开展更长期的实验来进一步明确早期磷组分的稳定性、微生物群落的组成及其对籽粒产量的长期影响。

**机构审查委员会声明**
不适用。

**CRediT作者贡献声明**
陈磊：方法学设计、实验实施、数据分析与整理。
宋书辉：初稿撰写、数据可视化处理、方法学设计、实验实施、数据分析与整理。
王红：修订与编辑工作、数据验证、数据分析。

**知情同意声明**
不适用。

**作者名单**
宋书辉 | 陈磊 | 王红