利用傅里叶变换红外光谱法探究溶菌酶热变性过程中的水化层

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Probing the lysozyme hydration shell during thermal denaturation via FTIR spectroscopy

　　

摘要
本研究采用傅里叶变换红外（FTIR）光谱结合HDO差光谱方法，探究溶菌酶在水热变性（25–85 °C）过程中水合壳的演化。水合过程涉及两个截然不同的阶段：变性前阶段（25–65 °C）以及随后的热变性阶段（75–85 °C）。在整个温度范围内，水合壳的热稳定性显著优于本体水。关键在于，水合水会主动响应蛋白质的动态结构变化。在65 °C时，它能够感知热变性的微观起始。由于结构刚性的瞬时丧失，蛋白质暴露出先前埋藏的疏水基团，同时保持其天然折叠。这种状态维持了水的氢键协同性，从而生成结构异质性最高、结构熵出现局部最大值的水合层增强。在85 °C下对天然态与变性态水合壳进行等温比较表明，变性引起的极性与非极性基团空间分离部分破坏的这种协同性。这导致水的氢键网络相比天然态减弱。我们的发现表明，水合水作为一种敏感的分子探针，能够在宏观解折叠发生之前反映蛋白质变性的最早阶段。

引言
蛋白质的结构完整性与构象动力学与其周围水合壳的持续重组密切相关[1], [2]。溶剂绝非仅作为惰性背景，而是与生物分子紧密耦合，作为积极参与者协调折叠过程、维持整体稳定性，并充当分子增塑剂以赋予必要的构象柔性[3], [4], [5]。天然态与变性态之间的精细热力学平衡，很大程度上取决于周围水合网络与蛋白质表面极性域和非极性域的相互作用方式[6], [7]。

鸡蛋清溶菌酶（HEWL）是一种公认的模型球蛋白，被广泛用于研究蛋白质-水相互作用与稳定性。它由一条由129个氨基酸组成的单一多肽链构成，分子量约为14.4 kDa。其结构完整性主要由四个共价二硫桥维持，这极大地缩小了变性态的构象空间，并防止蛋白质变为完全伸展的无规卷曲[8]。

溶菌酶的热变性通常被描述为从天然态（N）到解折叠态（U）的转变。一些研究表明，HEWL的二级和三级结构在高达64 °C时保持高度稳定，解折叠以两态过程进行，没有任何可观测的中间结构[9]。然而，其他研究强调，这一机制高度依赖于蛋白质水合层的稳定性。在42–47 °C左右，水合水开始丧失其独特的稳定性质，引发水分子氢键网络的瓦解[10], [11]。这诱导出一个明显的、亚稳的变性前阶段。在此阶段，溶剂不再充当保护介质[5], [11]，导致溶菌酶三级结构的重排和溶剂可及性的增加，而二级结构则完全保持完整[10]。

随着温度进一步升高，该过程仍处于热可逆区域，该区域延伸至约69–72 °C。在此范围内，水合水氢键网络的渐进式减弱改变了溶剂动力学，引发蛋白质结构的解折叠[5], [11]。超过此阈值后，变性变得不可逆[5], [9], [11]。加热至77 °C以上会触发剧烈的螺旋-片层转变以及蛋白质聚集的起始[5]。最终，在此温度之上，天然蛋白质的氢键网络被完全破坏，水合水与生物分子表面有效解偶联。这些水分子失去了所有稳定性质，本质上成为自由水，其行为完全像本体水[11], [12]。

天然溶菌酶的水合壳已被广泛表征。蛋白质表面附近的水密度比本体水高约10%–15%[13], [14]。然而，报告的第一水合层水分子数因所采用方法和对水合水的定义不同而差异显著[3], [15]：拉曼光谱表明为158 ± 8个分子[16]，介电光谱给出165 ± 15个分子[17]，太赫兹吸收估算约为173 ± 40个分子[18]。相比之下，吸附量热测定显示出显著更高的数值，达到约420个水分子[19]。此外，正如Burakowski和Gliński所全面综述的，分子动力学模拟和体积测量等方法可以产生更广泛的结构水合数谱，其中一些溶菌酶的数值超过600个分子[20]。

在热变性过程中对蛋白质水合壳的实验研究通常是在宽温度梯度下进行，将水合水与完全相同温度下的纯本体水进行比较。例如，Bellavia等人[16]利用这种方法研究了溶菌酶高达90 °C的水合层。他们的结果表明，在25 °C的天然态下，水合水的氢键网络相比完全相同温度下的本体水仅有轻微畸变。然而，在90 °C的完全变性态下，与该温度本体水的偏差显著增强；水合层经历深刻的四面体结构丧失，分子间氢键相对于相应纯溶剂减弱。因此，天然态和变性态蛋白质的水合壳是通过间接比较室温下相对于本体水观测到的偏差幅度与高温下观测到的偏差幅度来比较的[15], [16]。

然而，这种非等温比较存在得出错误结论的重大风险。提高温度本质上会破坏整个系统的水-水相互作用，改变水合层和本体水参考态。因此，对比两种温度下的差异幅度，本质上会将解折叠生物分子的结构影响与纯热降解溶剂效应纠缠在一起。为了严格分离蛋白质对水合网络的构象效应，绝对需要在等温条件下评估两种状态。虽然在计算模拟中常规实现[21], [22]，但将此精确温度方法转化为实验环境仍是一项挑战。

在本工作中，我们利用傅里叶变换红外（FTIR）光谱研究了溶菌酶热变性（25–85 °C）过程中水合壳的演化。基于我们之前的研究，我们利用半重水（HDO）的O–D伸缩振动作为溶剂结构和能量状态的高灵敏探针。这一策略成功规避了H2O光谱固有的复杂分子间和分子内耦合，提供了更窄且界定明确的谱带。随后，差光谱方法的应用便于提取直接受蛋白质影响的水分子的谱形。关键在于，评估这些分离的谱形使我们能够在完全相同温度（85 °C）下直接比较天然态和变性态溶菌酶的水合层，从而分离出水结构上的纯构象效应。表征水合水随温度变化的结构和能量性质，是全面理解蛋白质热变性机制的关键一步。

分段片段
化学品与溶液
鸡蛋清溶菌酶（HEWL，三重结晶，纯度通常≥95%，酶活性约70,000单位/毫克，Fluka，Steinheim，德国）按原样使用。通过称量定量的蛋白质溶于去离子水（κ<0.01μScm?1），制备质量摩尔浓度为m≈0.008 molkg?1的储备液。由于样品中水的高摩尔浓度（约50 moldm?3）与蛋白质（最高约0.008 moldm?3）相比，任何引入的残余结晶水都会…

温度对溶菌酶水合壳结构和能量性质的影响
在25至85 °C的温度范围内研究了溶菌酶水合壳的温度诱导变化。HEWL在水溶液中的热变性温度通常在约72至78 °C之间[28], [30], [31], [32], [33], [34], [35]，具体取决于实验条件。因此，所选85 °C的上限温度确保了蛋白质的完全变性。这一宽温度窗口使我们能够连续地…

结论
在本研究中，我们使用FTIR光谱，辅以HDO差光谱方法，研究了溶菌酶热变性（25–85 °C）过程中水合壳的演化。该方法使我们能够全面表征直接包围蛋白质的水分子的结构和能量性质，证明了热变性过程从根本上改变了水合层的性质。

作为函数的水合壳分析…

CRediT作者贡献声明
Aneta Panuszko：概念化、方法论、软件、验证、形式化分析、调查、资源、数据整理、撰写-初稿、撰写-审校与编辑、可视化、监督、项目管理。Maja Kosmal：调查、撰写-初稿。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

致谢
作者感谢Piotr Bru?dziak博士提供的宝贵建议、有益讨论以及对本稿件的审阅。

Aneta Panuszko | Maja Kosmal
物理化学系，化工学院，格但斯克科技大学，Narutowicza 11/12，格但斯克，80-233，波兰