维生素D可缓解氧化应激和内质网应激，并在体内和体外保护心脏组织免受细胞凋亡

《Steroids》：Vitamin D mitigates oxidative and endoplasmic reticulum stress and protects cardiac tissue from apoptotic cell death in vivo and in vitro

　　

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  维生素D充足、不足和缺乏的大鼠模型以及大鼠心肌成纤维细胞系（H9C2）被用于本研究。
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  维生素D缺乏或不足升高心脏氧化应激并破坏Nrf2信号传导，增加内质网应激和自噬，并导致大鼠心脏细胞凋亡。
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  H9C2细胞中的维生素D预处理恢复了氧化还原平衡，降低了内质网应激和自噬标志物。
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  心肌成纤维细胞的维生素D预处理可保护细胞免受氧化应激诱导的凋亡。
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  4PBA是内质网应激的特异性抑制剂，增强了抗氧化状态，减少了自噬，并保护H9C2细胞免受凋亡性细胞死亡。

引言

维生素D因其经典作用，即在钙稳态和骨骼代谢中的作用而广为人知。然而，新兴研究表明其在多种非钙代谢组织（包括心血管系统）[1]，[2]中具有更广泛的重要性。维生素D受体（VDR）在心血管系统的多种细胞类型中表达，其中许多细胞表达1α-羟化酶，能够将25-羟基维生素D₃（25(OH)D₃）转化为其生物活性形式骨化三醇（1,25(OH)?D₃）[1]，[2]。这表明维生素D在心脏组织中具有重要的自分泌/旁分泌功能。临床前、流行病学和临床研究表明，VDR激活降低与心血管疾病（CVD）风险增加有关[3]。使用维生素D或VDR激动剂（VDRAs）的干预试验表明对高血压、内皮功能障碍、血管钙化和心脏肥大具有保护作用[3]，[4]，[5]。然而，维生素D改善心血管预后的分子机制仍不完全清楚。

我们最近报道的研究表明，大鼠维生素D缺乏（VDD）和不足导致大鼠心脏萎缩性重塑，其特征是蛋白质降解和合成速率改变[6]。这些蛋白稳态改变伴随着线粒体生物合成减少和AMPK显著激活，提示VDD期间心脏氧化磷酸化受损[6]。线粒体功能障碍和氧化磷酸化受损导致活性氧（ROS）积累，当中和机制失效时导致氧化应激[7]。ROS升高破坏心肌钙处理，促进心律失常发生并激活肥大和凋亡信号通路，促成心脏重塑[8]，[9]，[10]。

氧化应激的缓解主要通过激活Nrf2（核因子E2相关因子2）介导，这是一种调节抗氧化基因表达的转录因子[11]。在基础条件下，Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）的Kelch结构域结合，滞留在细胞质中，后者介导Nrf2蛋白的泛素化和降解。氧化应激修饰KEAP1的关键半胱氨酸残基，释放Nrf2并使其能够核转位。Nrf2与包括小Maf蛋白在内的转录因子形成异源二聚体，并结合抗氧化反应元件[AREs]，诱导细胞保护性抗氧化基因的转录[11]。Nrf2活性不足会增加氧化损伤易感性，越来越多的证据表明Nrf2信号传导对于维持心血管稳态至关重要[12]，[13]。生物分子的氧化损伤导致未折叠或错误折叠的蛋白在内质网（ER）腔中积累，导致内质网应激（ERS），进而激活未折叠蛋白反应（UPR）；这是一种由PERK、IRE1和ATF6信号通路介导的适应性机制，其中葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BiP）作为中心调节因子[14]，[15]。虽然初始具有保护性，但持续的内质网应激促进凋亡信号传导，确立了氧化应激作为连接氧化还原失衡与细胞死亡的上游触发因素。

心脏功能的维持取决于ROS/活性氮物种（RNS）产生与抗氧化防御机制之间的平衡[16]。在动物和人体研究中，维生素D已被证明可通过增强谷胱甘肽水平和超氧化物歧化酶活性来减少氧化应激[17]，[18]。从机制上讲，维生素D激活Nrf2信号传导并促进其核转位，从而增强抗氧化基因表达[19]，[20]。新兴研究进一步表明，维生素D改善压力负荷诱导的心脏功能障碍并减少心肌细胞凋亡[21]。尽管如此，维生素D调节氧化应激、内质网应激和Nrf2信号传导之间的机制联系仍然不清楚。

基于我们早期研究证实的VDD诱导的心脏萎缩和以剪切caspase-3表达为标志的凋亡通路激活[6]，我们研究了维生素D缺乏是否通过上游细胞应激反应促进心脏凋亡。我们重点关注氧化应激和亚硝化应激作为破坏细胞稳态、激活内质网应激并最终促进心肌细胞死亡的启动事件。因此，在实验大鼠的心肌组织中对凋亡信号传导、氧化和亚硝化应激标志物、抗氧化防御、Nrf2信号传导和内质网应激通路进行了评估。此外，我们假设VDD诱导的氧化应激驱动内质网应激并改变细胞降解通路，共同导致心肌细胞丧失，而维生素D治疗可减轻这些反应。考虑到内质网应激、自噬和凋亡在决定细胞命运中的密切相互作用，我们检查了氧化应激诱导的内质网应激是否与改变自噬活性有关，从而影响凋亡信号传导。为了检验这一假设，采用体外H9C2大鼠心肌成纤维细胞模型。细胞暴露于氧化应激中，分析氧化应激标志物以及内质网应激、自噬和凋亡通路，以阐明它们的相互作用并评估维生素D的保护作用。

章节片段

化学品、试剂和抗体

除另有说明外，所有化学品和试剂均购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。制备动物饲料所需的成分购自MP Biomedicals, Inc.（美国）和Loba Chem（印度）。GAPDH（cat # 5174S）、CHOP（cat # 2895S）、BIP（cat # 3177 T）、BAX（cat # 2772S）抗体购自Cell Signaling Inc.（美国）。ATF6（cat # A0202）、BIM（cat # A15771）、BCL2（cat # A0208）、HMOX1（cat # A1346）、NQO1（cat # A1518）抗体购自

维生素D缺乏和不足改变了血清维生素D相关参数

血清25(OH)D₃水平是维生素D状态的生物标志物，与对照（NVD）组相比，VDD组的25(OH)D₃水平显著降低（p < 0.01）。LVD组表现出中间的25(OH)D₃水平，显著低于NVD组（表1）[6]。与NVD组相比，LVD组和VDD组的甲状旁腺激素（PTH）血清水平均显著升高（p < 0.01）（表1）。血清钙水平略有但显著下降（

讨论

在本研究中，我们检验了我们的假设：a）VDD和不足通过损害心脏氧化还原平衡触发一系列应激级联反应，这可能引发ERS反应最终导致细胞凋亡，b）心肌成纤维细胞的VD预处理可能保护细胞免受这些损害并防止细胞损伤。我们的工作提供了关于VDD和不足通过分子通路对心脏健康影响的新颖且具有临床意义的见解，主要聚焦于氧化

支持来源

本研究由印度医学研究委员会、印度政府资助，grant#[F.N.5/9/1449/2022-Nut]，资助给AI。

CRediT作者贡献声明

Athira Anilkumar Sudharma：调查、数据整理、正式分析、撰写—初稿。Shabna Aboo：调查、撰写—审阅和编辑。Ayesha Ismail：概念化、资金获取、项目管理、监督、撰写—审阅和编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文中报告的工作。

致谢

本研究由印度医学研究委员会[ICMR]、印度政府的研究基金#[F.N.5/9/1449/2022-Nut]资助给AI。AAS被授予印度科学与工业研究委员会[CSIR]、印度政府的科研奖学金[F.N.09/484(0057)/2019-EMR-I]。我们衷心感谢Sara Peleg博士对手稿的建设性反馈。

Athira Anilkumar Sudharma|Shabna Aboo|Ayesha Ismail