牛血中色氨酸和血清素的储存与高效液相色谱荧光检测测定方法

《Veterinary and Animal Science》：Methods for storage and determination of tryptophan and serotonin in bovine blood by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection

　　

色氨酸（Tryptophan，TRP）和血清素（serotonin，5-HT）样品的保存和定量具有挑战性。即使在?80°C下储存，色氨酸和血清素也不稳定。研究人员开发了一种灵敏的高效液相色谱-荧光检测（high-performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FLD）方法用于血清素的定量。甲醇能有效保存血液样品中的色氨酸和血清素。

高效液相色谱荧光检测法测定牛血中色氨酸和血清素的方法学及保存策略研究解读

色氨酸（Tryptophan，TRP）和血清素（serotonin，5-HT）是生物体内重要的生物活性分子。5-HT作为一种生物源性单胺类神经递质，由必需氨基酸TRP合成，参与调节生殖功能、应激反应、摄食行为、昼夜节律、运动活动、免疫及炎症过程等多种生理和行为活动。由于血液中TRP和5-HT浓度较低，其测定通常依赖精密色谱仪器，常需衍生化、电化学检测或质谱联用。荧光检测器相对经济且能提供良好结果，但针对不同血液组分的HPLC-FLD方法报道甚少。此外，5-HT极不稳定，易受生化氧化、光照、pH和温度变化影响，而血小板储存了循环中大部分5-HT，凝血过程会使其释放，因此血块形成及血液组分分离过程会显著影响分析结果。基于上述问题，研究人员旨在开发一种快速、准确的方法，用于不同血液组分中TRP和5-HT的储存与同时定量。该研究成果发表于《Veterinary and Animal Science》。

研究人员采用高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD），色谱柱为Shim-pack GIST PFPP柱（3 μm，2.1×150 mm），流动相为50 mM磷酸钾缓冲液与甲醇的混合体系（80:20，v/v，pH 3.5），等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温35 °C，进样量20 μL，荧光检测激发波长278 nm、发射波长338 nm。样品前处理采用高氯酸去蛋白、KOH中和、稀释过滤。方法验证遵循ICH M10指南。样本来源于6头泌乳荷斯坦奶牛（用于方法验证和稳定性评价）和6头14月龄荷斯坦公牛（用于血液组分比较）。稳定性研究中，在血清中添加多种保存剂，分别于4 °C短期储存和?20 °C/?80 °C长期储存，并使用SAS MIXED过程进行统计分析。

色谱方法优化结果：研究人员通过比较不同流动相pH（3.5、4.0、4.5）和甲醇比例（15%、20%、25%）对保留时间、峰面积和分离度的影响，发现pH从4.5降至3.5使5-HT峰面积增加1.9%、保留时间缩短30.8%，TRP峰面积仅小幅下降；甲醇比例增至25%时分离度降至2以下且系统压力接近柱极限。最终确定20%甲醇、80%磷酸钾缓冲液（pH 3.5）为最佳条件，此时TRP与5-HT分离度大于2，分析时间短且峰形良好。

色谱方法验证结果：TRP在11.7~1500 nM、5-HT在12.7~1622 nM浓度范围内线性关系良好，校准曲线相关系数均为0.999。TRP的检测限（LLOD）和定量限（LLOQ）分别为2.58 nM和8.60 nM，5-HT的LLOD和LLOQ分别为0.78 nM和2.60 nM，灵敏度优于文献报道的同类荧光检测方法。批内精密度TRP为2.20%、5-HT为2.36%，批间精密度分别为4.43%和4.96%，均低于5%的可接受阈值。残留分析显示TRP和5-HT的残留量分别仅为LLOD的9.17%和13.3%，对分析无显著影响。加标回收实验中，TRP平均准确度为105.2%，5-HT为99.4%，表明基质干扰低、方法准确度高。

储存条件与样品稳定性结果：在4 °C储存4天的短期实验中，对照组以及单独添加高氯酸、EDTA、偏亚硫酸钠等处理均出现TRP或5-HT的显著降解；而EDTA+高氯酸组合和15%或30%甲醇能够有效防止TRP降解，其中EDTA+高氯酸和30%甲醇也能维持5-HT浓度稳定。在?20 °C和?80 °C长期储存56天实验中，未加保存剂的对照样品在7天内即出现TRP和5-HT浓度显著下降，?20 °C下降解更快；EDTA+高氯酸虽减缓5-HT损失，但未能阻止显著变化；而添加30%甲醇的样品无论储存于?20 °C还是?80 °C，TRP和5-HT浓度在56天内均保持稳定。此外，三轮冻融循环导致TRP下降至基线值的93%、5-HT下降至95%，提示冻融循环不适用于这些化合物的测定。

不同血液组分中5-HT和TRP浓度结果：TRP浓度在不同血液组分间差异较小，血清和全血中的TRP浓度比肝素血浆和EDTA血浆约高7%（P<0.05）。5-HT浓度在所有血液组分间均存在显著差异（P<0.05），血清中最高（9.51 μM），EDTA血浆为1.73 μM，全血为1.19 μM，肝素血浆最低（0.19 μM）。血清5-HT代表总循环池（游离部分加凝血时血小板释放部分），血浆5-HT代表游离循环浓度；不同抗凝剂通过不同机制影响血小板活化，进而导致5-HT释放差异，但抗凝剂本身不产生分析干扰。

讨论部分指出，甲醇通过使蛋白质变性并沉淀氧化酶，在不使用强酸的情况下有效保护TRP和5-HT；EDTA与高氯酸联用通过金属离子螯合和酶灭活的协同机制在短期储存中发挥作用。不同血液组分中5-HT浓度的巨大差异提示，在解释和比较不同研究结果时必须考虑所选择的血液组分。研究结论为：所提出的HPLC-FLD方法灵敏可靠，可同时定量血样中的TRP和5-HT。尽管两种分析物即使在冷冻储存下也不稳定，但添加30%甲醇可在?20 °C和?80 °C下至少56天内有效保存TRP和5-HT，确保长期储存期间样品稳定性。然而，不推荐冻融循环用于测定这些化合物。TRP浓度在不同血液部分间相似，而5-HT水平显示相当大的变异性，血清中浓度较高。未来研究应探索不同血液部分中5-HT浓度与其相关生物学反应之间的关系。