开发一种含有重组鹅细小病毒VP2中和表位区域的疫苗，并结合IL-2和FliC作为佐剂，以增强免疫反应并提高对病毒侵袭的防护能力

《The Veterinary Journal》：Development of a Recombinant Goose Parvovirus VP2 Neutralizing Epitope-Containing Region Vaccine Adjuvanted with IL-2 and FliC for Enhanced Immune Responses and Protection Against Challenge

　　**摘要**
鹅瘟（GP），由鹅细小病毒（GPV）引起，是一种高度传染性和致命性的病毒性疾病。疫苗接种对于疾病预防至关重要；然而，传统的减毒和灭活疫苗存在多种局限性。基于特定抗原区域的基因工程疫苗代表了一种有前景的替代策略。本研究旨在鉴定GPV VP2蛋白中的中和表位含区域，并开发有效的重组疫苗。将GPV VP2蛋白分为11个重叠片段，并使用锚定在周质中的表达（APEx）细菌展示系统结合流式细胞术（FCM）进行抗原区域筛选。进一步应用GPV VP2特异性单域抗体（VHHs）来鉴定含有中和表位的区域。鉴定出六个含有中和表位的区域，并将它们连接起来构建VP2M重组抗原。VP、VP2M、白细胞介素-2（IL-2）和鞭毛蛋白（FliC）基因被插入原核和真核表达载体中以生成蛋白质和DNA疫苗。三日龄的雏鹅被随机分配到15个实验组进行免疫。通过测量抗GPV抗体水平、IgG、IgM和IgA的产生、IFN-γ水平、免疫相关基因表达、脾细胞增殖、中和活性以及对GPV挑战的保护效果来评估免疫反应。结果表明，含有中和表位区域的疫苗比对照疫苗诱导了更强的免疫反应。接种疫苗的组别表现出更高的抗GPV抗体水平、IgG、IgM和IgA的产生、IFN-γ水平、免疫相关基因表达和脾细胞增殖。在GPV挑战后，基于VP2M的疫苗显著降低了法布里丘斯囊、脾脏、胸腺和肠道组织中的病毒基因组拷贝数，并且半定量评分显示组织病理损伤减少。此外，不含佐剂的疫苗的保护效果超过50%，而含有IL-2和FliC佐剂的组合疫苗的保护效果达到90%。总之，本研究鉴定了GPV VP2中的新中和表位含区域，为开发安全有效的重组疫苗提供了潜在策略。

**引言**
鹅瘟（GP），由鹅细小病毒（GPV）引起，是一种高度传染性和致命性的病毒性疾病（Huo et al., 2023, Siedlecka et al., 2025）。该疾病主要影响3-20天的雏鹅和鸭苗，感染后易感动物的死亡率可高达100%（Bian et al., 2019, Ning et al., 2017）。疫苗接种仍然是预防GP的主要策略；然而，尽管传统减毒疫苗具有很高的免疫原性，但可能存在残余毒力和恢复毒力的风险（Plotkin, 2005）。灭活疫苗的安全性有所提高，但通常免疫诱导较慢且保护作用持续时间有限（Stauffer et al., 2006）。基因工程疫苗具有安全性增强、抗原特异性提高和抗原设计灵活等优点，使其成为预防GP的有希望的替代品（Moyle and Toth, 2013）。然而，至今尚未有基因工程疫苗被广泛用于GP的控制。GPV基因组编码三种结构蛋白VP1、VP2和VP3，这些蛋白参与病毒组装、宿主相互作用和致病性（Lu et al., 2025）。其中，VP2被认为是主要的免疫原性成分，是诱导中和抗体反应的重要靶标，使其成为GPV疫苗开发的有希望的候选抗原（Chen et al., 2012, Liu et al., 2017）。然而，传统抗原诱导的免疫反应可能不足以提供足够的保护。因此，鉴定功能性抗原区域对于改善疫苗设计至关重要。基于含有中和表位区域的疫苗在基因工程疫苗平台上是一种有前景的策略。先前的研究已在GPV VP3蛋白中鉴定出含有中和表位的区域（Li et al., 2015）。由于VP3是通过VP2的蛋白水解切裂产生的，VP2也可能包含与中和抗体识别相关的其他抗原区域。因此，鉴定GPV VP2蛋白中的新中和表位含区域可能为开发安全有效的GP疫苗提供新的靶标。

**抗原区域鉴定和表位分布的技术**
用于抗原区域鉴定和表位映射的技术包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、肽扫描以及噬菌体、细菌和酵母展示方法（De Leon et al., 2024）。细菌展示技术，也称为细胞表面展示技术，涉及将外源基因与细菌膜脂蛋白的信号肽NlpA融合。随着NlpA穿过膜，它会逐渐降解，留下六个成熟的氨基酸锚定在细菌内膜上，从而在细菌表面展示共表达的蛋白质（John et al., 2025, Ledsgaard et al., 2022）。流式细胞术结合细菌表面展示技术通过荧光信号检测抗原-抗体相互作用，实现高通量筛选并克服了传统方法的局限性（Guo et al., 2014）。在本研究中，使用APEx技术来鉴定GPV VP2蛋白中的中和表位含区域。将VP2蛋白分为11个重叠片段，在APEx系统中表达。使用已在我们实验室筛选过中和活性的GPV VP2特异性单域抗体（VHHs）来鉴定这些片段中的中和表位含区域。虽然基于含有中和表位区域的疫苗通常比传统疫苗更安全，但它们通常包含的免疫原性成分较少。因此，在某些情况下，这些疫苗诱导的抗体反应和免疫细胞激活可能相对有限。为了获得足够的免疫保护，可能需要重复接种或添加适当的佐剂来增强疫苗诱导的免疫反应（Moyle and Toth, 2013, O’Hagan and De Gregorio, 2009, Perrie et al., 2008）。因此，选择能够有效增强体液和细胞免疫反应的佐剂对于开发改进的抗病毒疫苗至关重要。疫苗佐剂可根据其作用机制分为两大类。第一类“输送系统”作为抗原载体，包括铝盐（明矾）、乳剂（如MF59）、脂质体、纳米/微粒和基于聚合物的输送系统。这些平台有助于将抗原递送到抗原呈递细胞（APCs）并通过在接种部位诱导局部炎症反应来促进先天免疫激活。第二类“免疫增强剂”主要包括病原体相关分子模式（PAMPs），它们通过模式识别受体（PRRs）直接激活先天免疫反应（Apostolico et al., 2016, Kumar et al., 2011, Pulendran et al., 2021）。鞭毛蛋白（FliC）是细菌鞭毛的主要结构成分，被宿主细胞上表达的Toll样受体5（TLR5）识别（Boardman et al., 2023）。近年来，FliC被广泛研究作为各种疫苗和免疫治疗策略的潜在佐剂成分（Hedayat et al., 2012, Rhee et al., 2012, Zhao et al., 2019）。当与抗原共同给予时，FliC可以通过TLR5信号通路激活先天免疫途径，从而增强抗原的免疫原性，促进抗原呈递，并促进抗原特异性适应性免疫反应的发展。此外，据报道FliC介导的免疫激活有助于增强抗体产生和细胞免疫反应（Behrouz et al., 2016, Chaung et al., 2012, Lai et al., 2015, Nguyen et al., 2013, Oh et al., 2014）。当FliC以混合物形式给予时，它可诱导针对抗原和FliC本身的Th2型细胞免疫反应（Flores-Langarica et al., 2015）。白细胞介素-2（IL-2）是一种重要的细胞因子，参与T细胞增殖、淋巴细胞激活和细胞因子产生，特别是通过调节细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞（Raker et al., 2020）。作为一种免疫增强分子，IL-2作为疫苗佐剂候选物受到了广泛关注。与传统化学佐剂相比，IL-2提供了一种生物活性策略来调节疫苗诱导的免疫反应，并已在增强对病毒、细菌和寄生虫感染的免疫力方面显示出潜力。此外，IL-2可以影响疫苗诱导的免疫反应的强度和特性，使其成为基因工程疫苗平台的有希望的成分（Zhang et al., 2011）。在本研究中，使用细菌展示技术（APEx系统）结合FCM将VP2蛋白分为11个重叠片段。这些片段用我们实验室先前生成的GPV VP2特异性VHH抗体进行筛选以鉴定含有中和表位的区域。然后将鉴定出的中和表位含区域用于设计重组多区域疫苗抗原，为开发有效且安全的重组疫苗奠定了基础。此外，为了解决基于有限抗原区域的疫苗通常观察到的相对较弱的免疫原性问题，还加入了FliC和IL-2作为佐剂。这种策略旨在克服现有疫苗的局限性，为GP的预防和控制提供了新方法。

**材料**
我们实验室维持了质粒pCold-VP2（GenBank登录号KC996729.1）、pApex-VP2D、pET-27b和pcDNA3.4，以及鹅瘟病毒的毒力株H和减毒株GD。BHK-21（幼仓鼠肾细胞系）和鹅胚成纤维细胞（GEF）也用于GPV繁殖、中和试验及相关实验。

**伦理批准和参与同意**
作者确认遵守了期刊作者指南页面上规定的伦理政策，并获得了适当的伦理审查委员会批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》的建议进行。该协议获得了东北农业大学研究所机构审查委员会的批准。

**资金支持**
本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）[项目编号32172892]和黑龙江省科技创新基地奖励项目[项目编号JD24B009]的财政支持。

**作者贡献声明**
王静明：软件。吴青：撰写-初稿、研究、数据管理、概念化。高瑜：软件。李嘉欣：软件、方法学。任桂平：资金获取、概念化。李新宇：软件。金玉罕：软件。吴迪：软件。白琳：可视化。刘志然：软件、方法学。夏淑静：可视化。张琳：可视化。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报道的工作。

**参考文献**
（略）

**校对：