《Veterinary Parasitology》：Virulence analysis of successively passaged scuticociliate strains and preparation and evaluation of whole-parasite vaccines from revitalized strains
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•成功恢复了长期体外传代盾纤毛虫的生物活力。•蛋白质组学鉴定出163种与盾纤毛虫毒力相关的差异表达蛋白。•由复壮菌株制备的盾纤毛虫疫苗显示出显著的免疫保护效果。引言盾纤毛虫是纤毛动物门（Ciliophora）中的一个重要类群，属于寡膜纲（Oligohymenophorea）、
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成功恢复了长期体外传代盾纤毛虫的生物活力。
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蛋白质组学鉴定出163种与盾纤毛虫毒力相关的差异表达蛋白。
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由复壮菌株制备的盾纤毛虫疫苗显示出显著的免疫保护效果。
引言
盾纤毛虫是纤毛动物门（Ciliophora）中的一个重要类群，属于寡膜纲（Oligohymenophorea）、盾纤目（Scuticociliatida）和盾纤科（Philasteridae）。目前已鉴定出超过100种盾纤毛虫，表现出显著的生态适应性和多样性（Lin, 2010）。作为一种典型的兼性寄生虫原虫，盾纤毛虫可在海洋环境中自由生活，也可在环境条件变化或宿主免疫力下降时转变为组织寄生形式。它们侵入宿主的皮肤、鳃和肌肉等组织，以宿主细胞和组织碎片为食，从而引起病理性损伤（Song和Wang, 1993）。盾纤毛虫呈泪滴状（15-50 μm），前端尖细，后端圆钝。其体表覆盖纤毛，用于运动和感觉探测，较长的尾毛有助于游泳和定向，赋予其较强的运动能力（Song等, 2000）。研究表明，盾纤毛虫在20℃、盐度30‰和pH 7.2条件下生长最佳，表明其对温度、盐度和pH值高度敏感，并能良好适应中温、中盐和中性环境（Zhang等, 2008, Bu, 1997）。鱼类感染盾纤毛虫后会出现非特异性症状——运动能力下降、食欲减退、黏液分泌过多、皮肤变色和白点形成，严重时进展为充血、溃疡以及继发性细菌或真菌感染（Sun和Zhang, 1994）。在现代海水养殖中，高密度养殖和水质恶化等问题日益普遍，为盾纤毛虫病的大规模暴发提供了有利条件，显著增加了养殖群体大规模感染和死亡的风险。因此，加强对盾纤毛虫的识别、监测和防控措施已成为保障海水养殖业健康可持续发展的重要环节。
随着功能基因组学和分子寄生虫学的发展，鱼类寄生虫的毒力因子逐渐成为研究的核心焦点。毒力因子是寄生虫来源的分子，能够介导组织侵袭、免疫逃逸和宿主代谢操控。多组学整合（转录组学、蛋白质组学和分泌组学）的兴起加速了其发现，这些方法通过比较感染与非感染状态来精确定位致病性相关调控因子。例如，单吸虫（Monogenean）蛋白酶（如来自Dactylogyrus和Gyrodactylus的蛋白酶）可降解黏液屏障和炎症因子（Tian等, 2018）；异尖线虫（Anisakis）分泌糖蛋白以抑制IL-6和TNF-α，建立免疫沉默（Nutman, 2015）；锥虫则利用变异表面糖蛋白（VSG）转换来逃避体液免疫（Kim和Cross, 2011）。除了鉴定之外，基于分泌组的预测结合信号肽筛选可以提名候选蛋白，随后通过RNA干扰、CRISPR/Cas9或转基因表达进行功能验证——这些技术已成功用于表征微孢子虫和黏孢子虫的毒力基因（Hewitson等, 2009, Tritten等, 2021）。
此前的实验室研究已成功建立了盾纤毛虫的体外纯化培养、冷冻保存和复苏方法（Li等, 2023, Li等, 2024）。该团队已完成来自红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的盾纤毛虫免疫原性抗原的筛选，开发并评价了亚单位疫苗，成功构建了原核表达系统以表达和纯化SDP35重组蛋白，并制备了特异性多克隆抗体。全细胞盾纤毛虫疫苗已证明可有效预防疾病暴发（Wang等, 2025）。然而，研究发现长期体外传代后的盾纤毛虫无法直接感染宿主生物。关于菌株复壮技术以及长期体外传代对毒力影响的研究尚未开展。因此，研究寄生虫毒力的变异对于开发高效新型盾纤毛虫疫苗以及探究相关致病免疫机制至关重要。
摘要片段
实验动物与饲养
实验纤毛虫菌株分离自患病大菱鲆体表，通过形态学和分子生物学方法鉴定为Pseudocohnilembus persalinus。这些盾纤毛虫随后在20℃恒温培养箱中进行传代培养，每21天传代一次。实验所用的连续传代菌株为第130代。实验所用大菱鲆购自大连天正实业。
连续传代菌株与复壮菌株盾纤毛虫种群密度的比较
如图1A所示，在相同培养条件下，从第2天到第7天，P. persalinus复壮菌株的种群密度显著高于连续传代菌株。在对数生长期，P. persalinus复壮菌株的种群密度比连续传代菌株高出81,900 ind/mL。
3.1.2. 连续传代P. persalinus菌株与
讨论
盾纤毛虫是一类广泛分布于水体环境中的原生动物，长期连续传代培养可能导致菌株毒力降低，但其生物学特性可通过复壮得以恢复。本研究中，在实验室条件下进行了P. persalinus的复壮培养，并对复壮菌株与连续传代菌株之间的差异进行了比较分析。种群密度的差异
结论
本研究系统探讨了体外传代P. persalinus致病力减弱的机制及其免疫防控策略。利用同一菌株重新感染鱼类宿主以恢复其活力，显著增强了P. persalinus的群体增殖能力、抗氧化水平以及冷冻保存后的复苏活性。蛋白质组学结果表明，差异表达蛋白主要富集于关键代谢
伦理声明
本研究所有实验动物方案均经大连海洋大学实验动物伦理委员会审查并批准（批准函编号51，日期2023年8月6日）。这些方案遵循国际公认的动物福利和伦理准则，并符合中国及辽宁省关于实验动物管理的相关法律、法规和政策。
CRediT作者贡献声明
吴炳辰：软件。孙青梅：监督指导。王荣友：方法论。王晓航：可视化。高鹏宇：调查研究。李瑞军：资金获取，概念设计。赵耕通：原创写作，形式分析，数据整理。倪新鹏：概念设计。傲雅琪：调查研究。孟晓宇：项目管理。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文报道工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本工作受国家重点研发计划（2023YFC2812102）和农业部现代农业产业技术体系专项基金（CARS-46）资助。
赵耕通|倪新鹏|傲雅琪|孟晓宇|吴炳辰|孙青梅|王荣友|王晓航|高鹏宇|李瑞军
