《Virology》：Single-cell transcriptomic landscape of avian influenza H9N2 virus infection in human and chicken cells
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禽流感病毒（AIV）自然在候鸟中循环，但偶尔可感染其他物种，包括家禽及多种哺乳动物和人类。尽管高致病性AIV已知可感染人类，低致病性AIV尤其是H7N9与H9N2亚型亦曾引起人感染并持续构成人畜共患风险。研究人员利用单细胞转录组学考察了人（A549）与鸡（DF
禽流感病毒（AIV）自然在候鸟中循环，但偶尔可感染其他物种，包括家禽及多种哺乳动物和人类。尽管高致病性AIV已知可感染人类，低致病性AIV尤其是H7N9与H9N2亚型亦曾引起人感染并持续构成人畜共患风险。研究人员利用单细胞转录组学考察了人（A549）与鸡（DF-1）细胞在感染人畜共患H9N2病毒24小时后（hpi）的转录响应，发现两细胞系响应显著不同。二肽基肽酶-4（DPP4）与羧肽酶Q（CPQ）基因在感染DF-1细胞中表达显著高于A549细胞，提示其可能参与病毒复制。在A549细胞中过表达CPQ与DPP4后，相较于空载体转染野生型细胞感染H9N2病毒，病毒复制显著增强。差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）显示，在A549与DF-1中高表达H9N2病毒基因的细胞簇内脂质代谢通路下调，表明宿主脂质代谢与H9N2复制存在潜在联系。上述结果揭示了A549与DF-1对H9N2感染的转录响应，并鉴定出与病毒复制相关的候选宿主因子与通路，为后续采用生理相关模型研究H9N2感染细胞决定因素奠定基础。
研究背景方面，甲型流感病毒（Influenza A virus）属正黏病毒科α流感病毒属，含8条单链RNA节段，按表面糖蛋白血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）抗原性分为19种HA和11种NA亚型，野鸟为其自然储存库。低致病性禽流感（LPAI）H9N2自1990年代中期起在亚洲与中东家禽中持续流行，人感染病例少且症状轻，无明确人传人证据，但从鸟类向哺乳动物溢出受病毒遗传特征、细胞易感性与宿主因子互作限制。标准批量RNA测序（bulk RNA-seq）仅提供样本平均表达，而10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq）可在单个细胞水平分辨感染与未感染细胞的宿主响应并同步定位宿主与病毒转录本，但AIV感染在单细胞分辨率下跨细胞类型的转录景观及其与复制效率关系仍不清楚。该研究即在此背景下，假设H9N2感染诱导人与鸡细胞类型依赖的特异转录谱，并可能揭示与病毒复制相关的候选宿主因子与通路。
研究人员以人肺腺癌上皮细胞A549与鸡胚成纤维细胞DF-1为模型，用LPAI A/chicken/Egypt/S12568C/2016（H9N2）病毒以感染复数（MOI）0.01感染，24 hpi取样，开展10x Genomics scRNA-seq，并在A549中过表达DPP4与CPQ验证功能。论文发表于《Virology》。
主要关键技术方法概括如下：样本为人A549与鸡DF-1细胞系（源自德国Friedrich-Loeffler-Institut，CCLV-RIE 1035与1029），病毒为埃及分离H9N2株；采用10x Chromium单细胞3′建库与Illumina NovaSeq测序；计算分析用Cell Ranger比对至整合病毒序列的自定义人与鸡参考基因组，Seurat进行质控、聚类与差异表达（Wilcoxon检验），DoubleFinder去除双细胞，按病毒基因UMI数划分Infected（<8）、Highly-infected（=8）、Bystander（=0）与Uninfected簇；通路分析用fgsea基于Reactome与Gene Ontology预排序列表；功能验证采用pcDNA3.1(+)转DPP4/CPQ至A549，qRT-PCR定量上清Matrix基因病毒滴度。
研究结果部分，3.1节“不同聚类模式及DF-1细胞流感病毒基因水平高于A549”通过对5243未感染与2503感染A549细胞、6317未感染与3773感染DF-1细胞质控后聚类，发现A549分4簇（Infected 1955、Highly-infected 266、Bystander 38、Uninfected 3324），DF-1分3簇（Infected 2285、Highly-infected 1010、Uninfected 4886，Bystander仅3细胞未成簇）；小提琴图显示A549 Highly-infected簇病毒基因（尤其fluNP、fluM、fluNS）表达高于DF-1同簇，但DF-1中Highly-infected比例更高，提示H9N2在禽源细胞进展更深。敏感性分析比较8/8与7/8病毒基因细胞，证实全8基因表达才代表高效感染态。
3.2节“感染细胞GSEA揭示A549上调干扰素应答而DF-1未见”显示，A549感染簇上调干扰素信号、IFN-α/β信号、干扰素刺激基因（ISG）抗病毒机制与细胞因子信号，下调发育生物学、类固醇代谢与神经系统发育；DF-1仅脂质代谢等两通路显著下调，且脂质代谢下调归一化富集分数（NES）更低（下调更强），该通路在A549亦下调但程度较轻。
3.3节“A549与DF-1各簇差异表达基因显著异质”经Wilcoxon秩和检验，A549 Infected与Bystander均上调ISG15、MX1、IFIT1、IFI6，呈旁分泌免疫激活；DF-1 Infected上调非经典抗病毒基因DPP4与CPQ，DF-1中DPP4、CPQ较A549高2–3倍，两物种感染簇无重叠上下调基因。
3.4节“NS节段表达状态与干扰素应答相关”指出NS1拮抗干扰素，但数据显示A549中NS阳性细胞IFI6、IFIT1、ISG15高于NS阴性；DF-1中NS阳性细胞IFI6亦特异性升高，表明NS表达与干扰素应答上行相关。
3.5节“CPQ过表达增强A549中禽流感复制”将人CPQ、DPP4转入A549，qRT-PCR显示CPQ过表达使病毒RNA升约3倍，DPP4升幅较小（其mRNA表达低于CPQ），证实CPQ为促病毒宿主因子候选。
讨论部分总结：研究给出H9N2感染A549与DF-1的单细胞转录视图，DF-1 Highly-infected比例更高印证病毒禽适应但具人畜共患潜力；A549免疫通路主导、DF-1代谢与DPP4/CPQ主导，差异受细胞系谱系与单时间点（24 hpi）限制。DPP4既往报道为H1N1限制因子，本研中H9N2下过表达反促复制，或因表达量低或HA亚型互作不同。CPQ促复制机制未明。结论译文如下：本研究采用10x scRNA-seq比较A549与DF-1对H9N2感染的转录景观并鉴定与复制相关细胞因子。两细胞系依病毒基因表达分簇，A549见四类群、DF-1见三类群，DF-1高效感染细胞比例更高表明禽源细胞支持更高效复制。通路分析示A549上调干扰素与ISG、DF-1下调脂质代谢；DF-1特异上调DPP4与CPQ。A549中过表达CPQ与DPP4增强H9N2复制，CPQ效应更显著。结果揭示两模型间感染响应差异及候选宿主因子，限于单时间点与细胞系，后续需原代细胞、多时点与人适应病毒对照以明确机制。
