《Virology》：HA1-T138A and HA1-Q226L substitutions in H3N2 canine influenza virus contribute to binding to human-type α2,6-linked sialic acid receptors
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摘要：H3N2犬流感A型病毒（IAV）起源于H3N2禽流感A型病毒，已在北美和亚洲引起疫情暴发。尽管尚未有H3N2犬流感病毒传播至人类的报道，但了解受体嗜性变化的分子基础对于病毒监测和人畜共患风险评估具有重要意义。禽类样IAV若要跨种传播至人类，其病毒表面的血
摘要：H3N2犬流感A型病毒（IAV）起源于H3N2禽流感A型病毒，已在北美和亚洲引起疫情暴发。尽管尚未有H3N2犬流感病毒传播至人类的报道，但了解受体嗜性变化的分子基础对于病毒监测和人畜共患风险评估具有重要意义。禽类样IAV若要跨种传播至人类，其病毒表面的血凝素（HA）糖蛋白必须获得突变，使其能够结合α2,6连接唾液酸（SA）——人类流感病毒的主要受体。尽管H3N2犬流感病毒优先结合α2,3连接SA（禽类病毒的主要受体），但病毒在犬体内复制过程中反复出现的突变可能导致HA发生替换，从而获得对α2,6连接SA的结合亲和力。在本研究中，研究人员将条件复制的H3N2犬流感病毒在敲除α2,3连接SA的MDCK细胞（该细胞主要表达α2,6连接SA，即人型细胞）中连续传代，以鉴定受体结合域中的突变。随后，研究人员利用反向遗传学构建了携带单个突变的重组病毒，并评估了它们在人型细胞中的生长特性。HA1-T138A和HA1-Q226L替换显著增强了病毒在这些细胞中的复制能力。此外，固相糖结合测定表明，这些突变使病毒对α2,6连接SA的结合能力提高至与α2,3连接SA相当的水平。综上所述，这些发现表明H3N2犬流感病毒具有获得突变从而高效结合α2,6连接SA的潜力。该研究提示，HA1-T138A和HA1-Q226L替换可能在H3N2犬流感病毒适应表达人型受体的细胞过程中发挥关键作用。
**H3N2犬流感病毒人型受体适应性突变的分子机制研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
H3N2犬流感A型病毒（IAV）于2004至2005年间首次在中国和韩国被检出，系统发育分析表明其由亚洲禽流感病毒演化而来。此后，该病毒在泰国、美国、加拿大等多个国家引发犬群暴发疫情，并出现犬传猫的跨种传播事件。值得注意的是，2010年韩国从犬体内分离到一株H3N2犬流感病毒与人源H1N1pdm09流感病毒的重配病毒H3N1，提示伴侣动物可能像猪一样充当产生具有大流行潜力病毒的中间宿主。
流感病毒的宿主嗜性主要由血凝素（HA）蛋白识别宿主细胞表面唾液酸（SA）受体的类型所决定。人流感病毒优先结合以α2,6键连接半乳糖的SA（人型受体），而禽流感病毒偏好结合α2,3连接SA（禽型受体）。H3N2犬流感病毒以犬呼吸道上皮细胞表面的α2,3连接SA为受体，理论上若要有效感染人类，必须获得结合α2,6连接SA的能力。尽管迄今尚无H3N2犬流感病毒感染人类的报道，但伴侣犬与人类接触密切，一旦病毒获得人型受体结合能力，便可能经犬传播至人类，进而获得在人际间传播的能力，演化成大流行病毒。
此前研究人员已建立“人型”细胞系用于评估流感病毒的受体嗜性变化：利用CRISPR/Cas9系统敲除MDCK细胞中六个β-半乳糖苷酶α2,3-唾液酸转移酶（ST3Gal-1至-6），获得缺乏禽型受体的人型细胞；同时敲除两个α2,6-唾液酸转移酶（ST6Gal-1和-2）获得禽型细胞，以及同时敲除两类转移酶的双敲除（DKO）细胞。本研究的科学问题在于：H3N2犬流感病毒是否能够通过突变获得在人型受体细胞中高效复制的能力？哪些关键氨基酸替换介导了这种受体嗜性转变？
**二、主要技术方法**
研究人员为评估H3N2犬流感病毒的人型受体适应潜力，采用了以下关键技术体系：首先，基于生物安全考量构建了聚合酶碱性蛋白2（PB2）基因缺失的条件复制型重组病毒（rWTΔPB2），该病毒只能在稳定表达PB2蛋白的细胞系中复制；其次，利用反向遗传学系统拯救携带HA突变的各类重组病毒；第三，将条件复制病毒在人型/PB2细胞中连续传代10代以筛选适应性突变；第四，通过序列分析鉴定突变位点；第五，采用固相糖结合测定法（以合成生物素化3?-唾液乳糖胺聚合物3?SLN和6?-唾液乳糖胺聚合物6?SLN为配体）评估受体结合特异性；第六，通过生长动力学测定（空斑试验）比较各重组病毒在不同PB2表达细胞系中的复制能力。病毒株A/canine/Madison/5/2015（H3N2）由东京大学河冈义裕博士惠赠，人胚肾HEK293T细胞购自RIKEN细胞库，MDCK细胞购自ATCC。
**三、主要研究结果**
**1. 构建PB2缺失的H3N2犬流感病毒（3.1 Generation of PB2-knockout H3N2 canine IAV）**
研究人员利用反向遗传学构建了以Venus荧光蛋白基因替换部分PB2基因片段的重组病毒rWTΔPB2，并在四种PB2表达细胞系中评估其生长特性。结果显示，rWTΔPB2在MDCK/PB2和禽型/PB2细胞中高效复制，而在人型/PB2和DKO/PB2细胞中复制受限，证实H3N2犬流感病毒优先利用α2,3连接SA作为受体。
**2. 人型/PB2细胞适应病毒的筛选（3.2 Selection of human-type/PB2 cell-adapted viruses）**
将rWTΔPB2在人型/PB2细胞中连续传代至第10代，获得三个独立适应病毒株P10-1、P10-2和P10-3。三株病毒在感染后24小时的滴度较亲本rWTΔPB2提高超过1000倍，确认病毒已成功适应人型细胞。
**3. 适应病毒的突变鉴定（3.3 Mutations in the human-type/PB2 cell-adapted viruses）**
对适应株的HA和NA基因进行测序，发现P10-1携带HA1-T138A、HA1-Q226L、HA1-K299R、NA-I28F和NA-Y36H；P10-2携带HA1-T138A、HA1-Q226L、HA2-E114K和NA-Y36H；P10-3携带HA1-T138A、HA1-Q226L和HA2-K58R。结构模拟显示，HA1第138和226位氨基酸残基位于受体结合位点，而HA1-299位及HA2-58、114位位于茎部区域；NA第28和36位位于跨膜结构域。
**4. 携带HA突变的重组病毒复制特性（3.4 Replication of recombinant viruses possessing HA mutations）**
携带各适应株全部HA突变的重组病毒（rHA1-T138A/Q226L/K299R、rHA1-T138A/Q226L/HA2-E114K、rHA1-T138A/Q226L/HA2-K58R）均在人型/PB2细胞中表现出较野生型提高超过1000倍的滴度，表明HA突变是适应人型细胞的关键决定因素。单突变分析显示，rHA1-Q226L的复制能力显著强于野生型，rHA1-T138A和rHA1-K299R仅显示中等程度增强，而rHA2-E114K和rHA2-K58R与野生型相当。双突变rHA1-T138A/Q226L较野生型提高超过100倍，且优于任一单突变，表明两突变具有协同效应。在禽型/PB2细胞中，rHA1-T138A和rHA1-Q226L的滴度较野生型下降约10倍，提示这些突变以牺牲禽型受体结合为代价。
**5. HA突变导致的受体结合偏好改变（3.5 Changes in receptor-binding preference by HA mutations）**
固相糖结合测定表明，rWTΔPB2仅特异性结合3?SLN（α2,3连接SA类似物），而rHA1-T138A、rHA1-Q226L及rHA1-T138A/Q226L均能以剂量依赖方式同时结合3?SLN和6?SLN（α2,6连接SA类似物），这与仅结合6?SLN的对照病毒（模拟人流感病毒的H4N5-HA1-Q226L突变株）有所不同。该结果直接证明HA1-T138A和HA1-Q226L赋予了病毒结合α2,6连接SA的能力。
**四、讨论与结论**
本研究表明，禽源H3N2犬流感病毒原本依赖α2,3连接SA受体，但通过在人型细胞中连续传代，仅需少数HA突变即可获得结合人型α2,6连接SA的能力。其中HA1-Q226L是公认的赋予禽流感病毒人型受体特异性的关键替换，而HA1-T138A也曾在H7禽流感病毒中被报道可增强α2,6-SA结合。数据库分析显示，已流行的H3N2犬流感病毒株大多携带HA1-A138，提示自然流行的病毒可能已具备一定程度的人型受体结合倾向；但几乎所有野外分离株仍保留HA1-Q226，HA1-Q226L尚未在自然分离株中出现。此外，犬呼吸道同时也表达α2,6连接SA，且已发现犬可感染人源H1N1pdm09及猪源H1N1病毒并发生重配，提示犬可能作为流感病毒的“混合容器”。虽然HA1-T138A和HA1-Q226L尚未在野外H3N2犬流感病毒中检出，但若此类变种通过自然感染或重配出现，则可能对人类公共卫生构成潜在威胁。该研究为评估伴侣动物中循环流感病毒的人畜共患风险提供了重要的分子证据。
