《Nature Communications》：Effect of human urinary microenvironment and fluid flow on antibiotic and phage therapy efficacy against uropathogenic Escherichia coli
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摘要翻译
尿路感染（urinary tract infection，UTI）仍是全球重大健康负担，其频繁复发与不断上升的 Antimicrobial resistance（AMR）正在损害治疗疗效。传统药敏试验常难以预测临床结局，凸显了对更具生理相关性的感
摘要翻译
尿路感染（urinary tract infection，UTI）仍是全球重大健康负担，其频繁复发与不断上升的 Antimicrobial resistance（AMR）正在损害治疗疗效。传统药敏试验常难以预测临床结局，凸显了对更具生理相关性的感染模型的需求。在本研究中，研究人员利用人尿液、三维人尿路上皮微组织模型（3D-UHU）以及一种新型中尺度流体平台（P-FLO）——该平台可将生理相关的壁面剪切应力施加于3D-UHU——探究了微环境复杂性如何影响尿路致病性大肠埃希菌（uropathogenic Escherichia coli，UPEC）对抗生素和噬菌体的反应。硝基呋喃妥因在传统药敏试验中表现出最强的效力，但未能在静态3D-UHU模型中根除感染。噬菌体鸡尾酒（LCPR1）抑制了胞内细菌群落，保留了尿路上皮活力，并诱导了炎性细胞因子和趋化因子分泌。在静态条件下，LCPR1与硝基呋喃妥因联合治疗可清除浮游细菌，并减少胞外及胞内细菌群落，但相较于硝基呋喃妥因单独治疗，并未进一步减少尿路上皮相关细菌负荷。在流动条件下，剪切应力促进了细菌伸长、附着和胞内群落形成，同时尽管药物暴露增加，仍降低了硝基呋喃妥因及联合治疗的疗效。这些发现表明，膀胱微环境深刻影响UPEC感染动态和治疗结局，强调了在抗生素耐药时代需要先进模型来指导治疗策略。
论文解读：尿液微环境与流体剪切力重塑UPEC感染动态及抗菌治疗疗效的机制研究
## 研究背景与问题
尿路感染（urinary tract infection，UTI）每年约有4亿例，是全球最常见的人类感染之一，其中约80%的社区获得性UTI由尿路致病性大肠埃希菌（uropathogenic Escherichia coli，UPEC）引起，并与最高的抗菌药物耐药（antimicrobial resistance，AMR）相关死亡人数相关联，每年约有26万例AMR相关UTI死亡。尽管UTI常被视为易于治疗的感染，但其复发率高达约30%，而控制感染、清除和治疗失败的生物学与生态学过程仅被部分理解。传统体外药敏试验通常在营养丰富且静态的条件下进行，无法还原泌尿道的理化与流体力学复杂性，因此基于最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定的抗菌药物疗效与临床结局相关性较差。此外，小鼠等动物模型在膀胱生理、免疫反应和尿液成分上与人类存在显著差异，抗生素的药代动力学和药效学参数也难以在种间准确转化。近年来组织工程进展提供了人源化模型，如供体来源的膀胱类器官、膀胱芯片及微型膀胱微生理系统，但多数系统缺乏分层尿路上皮、尿液灌注及排尿样动力学等关键特征。研究人员前期开发了静态三维尿耐受人尿路上皮微组织Transwell模型（3D-UHU），可在完全分层分化的尿路上皮和100%人尿液顶端环境中研究UTI。在此背景下，本研究旨在通过逐级复杂化的体外模型，系统评估抗生素硝基呋喃妥因和噬菌体疗法单独及联合用药对UPEC的疗效，并探究尿液成分和流体流动等微环境因素如何影响感染动态与治疗结局。
## 研究内容与总体结论
研究人员以UPEC模式菌株UTI89为主要研究对象，结合临床分离株EC3、EC4、ClinA、无症状菌尿株HM50、共生菌株COM1/COM2及实验室菌株MG1655，在阳离子调节Muller-Hinton肉汤（caMHB）、70%混合人尿液（70% pHU）和100%人尿液（100% pHU）中开展药敏试验，并在静态3D-UHU模型及自研中尺度流体平台P-FLO中评估硝基呋喃妥因、噬菌体鸡尾酒LCPR1及二者联合治疗的效果。结果表明，尿液成分对抗生素MIC/MBC的影响总体温和，但在时间-杀菌试验中，70% pHU环境下根除UTI89所需硝基呋喃妥因浓度较caMHB高4倍；静态3D-UHU中硝基呋喃妥因虽显著降低浮游细菌负荷，却无法清除胞内细菌群落（intracellular bacterial communities，IBCs）；LCPR1单用虽不降低总细菌负荷，但可减少IBCs、减轻尿路上皮细胞毒性并调节炎性细胞因子/趋化因子分泌；联合治疗在静态下根除浮游菌并降低附着/胞内菌负荷，但未超越单用抗生素对尿路上皮相关细菌的清除效果。P-FLO流动实验显示，流体剪切应力在感染早期限制细菌扩增，但随后促进细菌伸长/丝状化、表面附着和IBCs形成，并显著削弱抗生素及噬菌体对浮游菌群的疗效，联合治疗在流动下仅实现约4-log的浮游菌减少而未能完全根除。论文发表于《Nature Communications》。
## 主要关键技术方法
研究人员使用了多种关键技术：(1) 传统及尿液改良药敏试验，包括MIC、最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）和时间-杀菌曲线；(2) 静态3D-UHU模型，采用商业化HBLAK人膀胱上皮细胞分化16–20天形成完全分层尿路上皮，顶端暴露于汇集的健康志愿者人尿液（pHU，10/15位混合性别供体，来自BioIVT或UCL伦理批准的志愿者队列）；(3) P-FLO中尺度流体平台，由3D打印树脂模具翻制聚二甲基硅氧烷（PDMS）插头，适配商用12孔Transwell，通过注射泵施加0.02 mL min?1的充盈相和0.7 mL min?1的排尿相流动，模拟0.017–1.7 Pa壁面剪切应力；(4) 基于共聚焦显微镜和机器学习分割的图像分析流程，包括Ilastik监督式像素分类、自研BactoMeasure3D管线和ZEISS arivis Pro深度学习分割，用于定量细菌长度、表面覆盖率和IBCs；(5) Luminex多因子免疫分析检测细胞因子/趋化因子，LDH释放检测细胞毒性，TEER检测屏障完整性，SEM观察细菌形态。临床UPEC菌株EC3、EC4和ClinA分离自英国皇家自由医院慢性UTI患者的清洁中段尿样本，COM1/COM2分离自健康个体。
## 研究结果
### 在caMHB与人尿液中对UPEC菌株的药敏试验
研究人员首先比较了多种培养基中的细菌生长动力学。100% pHU严重抑制细菌生长，而70% pHU虽生长水平低于caMHB，但倍增时间和曲线下面积与caMHB相近，因此选择70% pHU作为后续生理相关药敏培养基。MIC结果显示，培养基对硝基呋喃妥因活性的影响很小，大多数菌株的MIC为4–16 μg mL?1；除EC3、EC4和ClinA在70% pHU中对头孢氨苄出现更高MIC外，甲氧苄啶、磷霉素、阿莫西林和头孢氨苄的MIC在两种培养基中总体相当。MBC结果同样显示70% pHU的影响温和且具有菌株和药物依赖性。时间-杀菌试验显示，在caMHB和70% pHU中，至少需要2×MIC的硝基呋喃妥因才能根除UTI89，但在尿液中达到根除所需药物浓度较caMHB增加4倍。这表明尿液作为泌尿微环境的关键组分可中等程度但重要地影响硝基呋喃妥因的杀菌动力学，然而单纯尿液成分不足以解释药敏结果与临床结局的失配。
### 静态（无流动）条件下硝基呋喃妥因对人膀胱微组织模型中大肠埃希菌UTI89的作用
在3D-UHU模型中，以临床相关浓度（16×MIC，256 μg mL?1）的硝基呋喃妥因连续两次各处理4小时。治疗显著减少顶端浮游细菌负荷约3–4 log，但对尿路上皮附着/胞内细菌仅减少约2 log。共聚焦成像和覆盖面积分析证实了该结果。硝基呋喃妥因显著降低LDH释放（p<0.0001），保护上皮活力，但感染12小时后已受损的TEER屏障功能未能恢复。在7×MIC（112 μg mL?1）剂量下，首次治疗后浮游菌显著减少，但第二次治疗后出现再生长，且附着/胞内菌群无显著下降。感染后回收细菌的MIC和MBC均未改变，排除了耐药突变产生。上述结果表明，尽管体外药敏显示敏感，高于MIC的抗生素浓度仍无法清除尿路上皮相关细菌，凸显简化体外试验与宿主微环境模拟平台间的差异。
### 静态（无流动）条件下噬菌体鸡尾酒（LCPR1）与硝基呋喃妥因联合治疗UTI89
在液体培养基中，LCPR1对UTI89的生长抑制呈MOI依赖性，且在70% pHU中的抑菌效果弱于标准MHB，噬菌体在尿液环境中的稳定性也部分下降。在静态3D-UHU中，LCPR1（1×10? PFU mL?1）单用未能显著降低浮游或附着/胞内细菌负荷（p=0.0971和p=0.8377），但显著降低了UTI89感染诱导的细胞毒性（p=0.001）。细胞因子分析显示，LCPR1单用诱导TNFα、CXCL2和G-CSF分泌；与UTI89共感染时，LCPR1大幅降低IL-1β分泌，同时增强G-CSF、CXCL2、IL-8（CXCL8）和TNFα的诱导，提示噬菌体可能通过裂解细菌释放配体激活尿路上皮炎症信号，促进中性粒细胞募集团队。联合治疗在顶端浮游 compartment实现完全根除，微组织相关细菌负荷较未处理对照减少约4-log，细菌覆盖面积与硝基呋喃妥因单用相当。噬菌体回收结果显示，联合治疗组微组织内噬菌体滴度低于单用组，与细菌宿主减少相关。
### 抗菌治疗对胞内细菌群落（IBCs）的影响
研究人员开发了基于Arivis分割算法和三维重建的图像分析流程，以肌动蛋白标记的细胞掩膜界定胞内细菌，并结合非通透性E. coli抗体和染色体整合RFP的UTI89菌株进行验证。结果显示，硝基呋喃妥因虽减少附着/胞内compartment的CFU，但并未抑制IBCs形成；LCPR1单用在不改变总CFU的情况下显著减少IBCs；联合治疗同时降低附着/胞内细菌负荷和IBCs丰度，显示两种疗法对胞外和胞内UPEC储库具有互补作用。
### 流体流动在人气膀胱微组织模型中触发UPEC伸长
研究人员设计并验证了P-FLO系统。数值模拟显示排尿相入口附近为高剪切应力（HSS）区域，出口为中间剪切应力（ISS）区域，充盈相剪切应力最低且分布均匀。流动本身不改变未感染模型屏障完整性、微组织厚度及CK20和UPIII分化标志物表达。感染实验中，仅充盈相（低剪切应力）显著增加细菌附着，而排尿/充盈循环减少2和4小时时的浮游及附着细菌CFU，但6小时时两者趋同。流动条件下屏障完整性更好。共聚焦和SEM均观察到UTI89在流动下发生显著伸长/丝状化，而静态条件下罕见。BactoMeasure3D定量显示，流动条件下细菌长度累积分布在2–6小时内逐渐右移，6小时时AUC显著高于静态（p=0.0399），且仅充盈相即可诱导丝状化，说明低剪切应力本身是该表型的触发因素。流动条件下浮游菌的间甲酚紫还原代谢活性显著降低（p=0.029），丝状菌比例增加。对临床分离株EC3和COM2的验证显示EC3同样在流动下丝状化，而COM2不丝状化而是形成聚集体，表明流动驱动的形态和代谢适应具有菌株特异性。
### 流体流动影响3D-UHU尿路上皮微组织模型中大肠埃希菌UTI89的抗菌药物敏感性
在12小时感染后施加8小时含排尿事件的流动治疗。未处理对照在20小时时流动条件使尿路上皮细菌表面覆盖率增加至22%（静态为10%），并增加IBCs比例。硝基呋喃妥因单用使浮游菌减少约3-log、附着/胞内菌减少约3-log，并最大程度降低覆盖面积；但与静态相比，浮游菌的CFU减少幅度显著变小（p=0.0019），提示流动下抗生素疗效下降。LCPR1在流动下未能显著降低附着/胞内CFU，但降低细菌覆盖面积，且部分细菌仅以DAPI信号存在，可能反映噬菌体对质粒荧光的影响。联合治疗在流动下未优于硝基呋喃妥因单用，浮游菌减少约4-log而未达静态时的完全根除，且两条件下差异极显著（p<0.0001）。IBCs定量显示，硝基呋喃妥因降低IBCs丰度，LCPR1在不改变总附着CFU的情况下减少IBCs，联合治疗对胞内细菌群落的减少最为显著。这些结果共同表明，流动条件下机械力和微环境线索促进细菌表面附着与胞内入侵，并削弱针对浮游菌群的抗菌疗效。
## 讨论与结论
讨论部分指出，尽管70% pHU仅对少数菌株的MIC产生跨过EUCAST折点的改变，时间-杀菌试验揭示了尿液环境中硝基呋喃妥因杀菌效力下降，说明固定终点MIC难以捕捉微环境对药效动力学的影响。3D-UHU模型中IBCs在抗生素治疗后持续存在，支持尿路上皮受保护生态位可致细菌存活的假说。LCPR1在尿液环境中活性降低，强调应在感染部位条件下评估噬菌体疗效。噬菌体与抗生素联合虽然未增强总体杀菌活性，但通过分别靶向胞外和胞内生态位实现互补治疗获益。P-FLO系统显示剪切应力通过FimH-甘露糖catch-bond机制增强细菌附着和IBCs形成；丝状化作为适应性反应可能通过降低表面积体积比减缓有害物质扩散并逃避吞噬。流动下细菌代谢活性降低可能解释抗菌药物对浮游菌疗效减弱。研究结论指出，微环境条件深刻影响UPEC感染动态和治疗反应，更生理相关的感染模型对于抗生素耐药时代优化治疗策略至关重要；P-FLO系统作为低成本、可广泛获取的中尺度流体平台，为其他微组织和类器官模型提供了引入流体力学线索的可行方案。
