《Antioxidants》：Mitochondrial Transplantation Suppresses mtDNA-cGAS/STING-Mediated Innate Immunity by Enhancing PINK1/Parkin-Dependent Mitophagy to Attenuate Keloid Fibrosis
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瘢痕疙瘩以纤维化和慢性炎症为特征，但线粒体功能障碍与瘢痕疙瘩发病之间的关联尚不清楚。本研究考察受损的PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬是否与瘢痕疙瘩中线粒体DNA（mtDNA）介导的天然免疫激活及纤维化相关，并评估线粒体移植作为一种潜在治疗策略的可行性。
瘢痕疙瘩以纤维化和慢性炎症为特征，但线粒体功能障碍与瘢痕疙瘩发病之间的关联尚不清楚。本研究考察受损的PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬是否与瘢痕疙瘩中线粒体DNA（mtDNA）介导的天然免疫激活及纤维化相关，并评估线粒体移植作为一种潜在治疗策略的可行性。研究人员对原代瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）、正常皮肤成纤维细胞（NFs）、脂肪来源干细胞（ADSCs）、人瘢痕疙瘩组织以及免疫缺陷BALB/c裸鼠中的人瘢痕疙瘩异种移植物，采用超微结构、分子和功能学方法进行分析。在蛋白等量剂量下比较新鲜分离的NF来源线粒体（nMito）与ADSC来源线粒体（aMito）。KFs表现出线粒体异常、氧化磷酸化（OXPHOS）受损、活性氧（ROS）增加、mtDNA泄漏及cGAS/STING通路激活。PINK1表达升高、Parkin表达降低和p62累积，符合下游线粒体自噬清除受损。nMito与aMito均伴随线粒体功能改善、线粒体自噬相关标志物改变、胞质mtDNA减少、cGAS/STING信号减弱及成纤维细胞活化受抑，其中aMito在部分终点上变化更显著。在异种移植物中，病灶内给予任一线粒体均改善胶原排布并降低纤维化与炎症信号。综上，这些发现将PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬改变与mtDNA驱动炎症和纤维化联系起来，并支持线粒体移植作为一种基于细胞器的治疗思路。
研究背景方面，瘢痕疙瘩是一种以细胞外基质过度沉积、成纤维细胞异常活化和持续炎症浸润为特征的纤维增生性皮肤病，现有手术、放疗、皮质激素注射等疗效有限且复发率高。线粒体作为代谢与免疫信号中枢，其稳态失衡被认为介于代谢失调与天然免疫激活之间。已有报道提示KFs存在线粒体稳态破坏，且PINK1/Parkin轴在受损线粒体选择性清除中起关键作用，而Parkin在瘢痕疙瘩中表达降低。泄漏至胞质的mtDNA可作为损伤相关分子模式被cGAS识别，激活STING通路，促进NF-κB信号及IL-6、CCL-2、TGF-β1等促炎促纤维化因子分泌。线粒体移植近年被视为恢复线粒体稳态的新策略，但在瘢痕疙瘩中尚未被探索。研究人员因此系统表征KFs中线粒体功能障碍、线粒体自噬受损与mtDNA-cGAS/STING天然免疫激活的关系，并在同等蛋白剂量下比较nMito与aMito的治疗效果，最终在体外细胞、组织标本及裸鼠异种移植物三个层面证明线粒体移植可增强PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬、降低胞质mtDNA、抑制cGAS/STING信号并减轻纤维化，论文发表于《Antioxidants》。
主要关键技术方法包括：从腹部整形获取正常皮肤、吸脂术获取脂肪组织、瘢痕疙瘩切除标本分离原代KFs、NFs及ADSCs，并以流式确认ADSC表型；使用密度梯度离心法从NFs和ADSCs分离高纯度线粒体并以BCA法蛋白归一化；体外以25 μg线粒体蛋白/1×105 KFs剂量移植，体内以40 μg/病灶多点注射于BALB/c裸鼠背侧人瘢痕疙瘩异种移植物；通过透射电镜观察超微结构，Seahorse检测氧耗率（OCR）与胞外酸化率（ECAR），JC-1和DCFH-DA评估膜电位与ROS，digitonin分馏后qPCR定量胞质mtDNA，cGAS免疫沉淀验证mtDNA-cGAS结合，Western blot检测PINK1/Parkin/LC3B/p62/cGAS/STING/TBK1/NF-κB等，ELISA测细胞因子，Transwell间接共培养评估M2巨噬细胞极化，并辅以GSE145725数据集的ssGSEA线粒体自噬评分及aMito处理KFs的bulk RNA-seq。
研究结果部分，3.1节通过TEM、Seahorse、JC-1、ROS检测及GSE145725分析，得出KFs存在线粒体肿胀、嵴断裂、OCR下降、ECAR升高、ΔΨm丧失、ROS增多且数据集中线粒体自噬评分降低、PINK1上调，证实线粒体结构与氧化代谢双重受损。3.2节在组织IHC与细胞WB中显示KFs/PINK1高、Parkin低、p62累积、LC3B-II/I降低，符合PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬缺陷。3.3节借助PicoGreen/MitoTracker成像、胞质mtDNA qPCR、si-PRKN敲低验证、cGAS-IP及H-151抑制实验，证明缺陷自噬致mtDNA泄漏入胞质并结合cGAS，激活STING/TBK1/NF-κB，促进IL-6/CCL-2/TGF-β1分泌及THP-1来源M0巨噬细胞的CD206+ M2极化，H-151或抗IL-6中和抗体可部分逆转。3.4节以MitoTracker标记示踪，证明nMito/aMito可被KFs内化，恢复ΔΨm、降低乳酸与ROS，aMito在膜电位和抗氧化方面优于nMito。3.5节通过mCherry线粒体示踪、TOMM20/LAMP1共定位、WB及胞质mtDNA qPCR，表明移植增强线粒体-溶酶体关联，下调PINK1、上调Parkin与LC3B-II/I、降p62，总mtDNA略增而胞质mtDNA显著减少，柠檬酸合酶活性回升。3.6节WB与ELISA显示cGAS、p-STING/STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB及IL-6/CCL-2/TGF-β1均下降，M2极化受抑，RNA-seq提示aMito关联糖酵解、线粒体自噬、溶酶体生物合成及胞质DNA感知通路下调。3.7节CCK-8、划痕、Transwell迁移侵袭及Col I ELISA表明两种线粒体均抑制KF增殖、迁移、侵袭和胶原分泌，aMito在划痕闭合上略强。3.8节裸鼠异种移植中，mCherry示踪见移植线粒体在病灶内留存≥7天，体重稳定；移植组移植物重量降幅更大，WB见PINK1降、Parkin升、TGF-β1降，H&E与Sirius Red显示胶原排布改善，红橙/黄对绿双折射胶原比降低，IHC示cGAS、p-STING、p-NF-κB免疫活性减弱。
讨论与结论部分，研究人员指出该研究首次将瘢痕疙瘩病理与PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬受损—mtDNA泄漏—cGAS/STING天然免疫激活—成纤维细胞活化及M2巨噬细胞极化这一链条相衔接，并提供线粒体移植作为细胞器水平免疫代谢疗法的临床前概念验证。在同等蛋白剂量下，aMito在恢复膜电位、降低ROS、调控自噬标志物及部分炎症端点上较nMito表现更强，提示供体线粒体代谢兼容性影响疗效。结论明确：线粒体移植通过增强PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬，减少胞质mtDNA蓄积，抑制cGAS/STING介导的天然免疫，从而衰减瘢痕疙瘩成纤维细胞活化与纤维化，是一项具有转化潜力的器官样治疗策略。
