《Molecules》：Fermentation as a Lever to Enhance Legume Proteins: From Antinutritional Factors to Improved Quality
摘要
凭借其高营养价值、功能性蛋白以及较低的环境影响，豆类蛋白已成为动物蛋白的可持续替代品。然而，其更广泛的利用受到抗营养因子（ANFs）的制约，这些因子会对蛋白质消化率、矿物质生物利用率及技术功能特性产生不利影响。发酵已成为克服这些限制的一种有前景的方法。通过微生物和酶促活动，发酵能够降低抗营养因子（ANFs）、修饰蛋白质结构并促进蛋白水解，从而生成可能改善消化率、生物利用率及功能特性的肽段和游离氨基酸。本综述批判性地探讨了发酵对豆类蛋白的影响，重点关注抗营养因子（ANFs）的降低、蛋白质降解与结构修饰、蛋白水解及其对营养和技术功能特性的影响。特别关注了蛋白质水解和肽段生成，以及发酵的局限性和潜在权衡，包括过度蛋白水解、理想功能特性的丧失、不良感官变化、菌株与底物间的变异性以及加工时间延长。本综述还讨论了将发酵豆类蛋白纳入相关食品体系的问题，重点强调其功能表现和应用潜力。最后，指出了当前的知识空白和未来研究重点，以支持开发可控发酵策略，从而生产营养改善、功能定制且工业上可行的豆类蛋白配料。
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引言
豆类蛋白富含蛋白质，具有卓越的营养品质、功能多样性和较低的环境足迹，已成为动物蛋白的主要可持续替代品。尽管其营养潜力巨大，但豆类蛋白的广泛应用仍受限于抗营养因子（ANFs）的存在。豆类含有植酸盐、单宁、蛋白酶抑制剂、凝集素及其他生物活性化合物，这些物质会损害蛋白质消化率、降低矿物质生物利用率并限制营养利用，从而降低其在食品体系中的功能表现和应用。在功能性方面，这些化合物可能与蛋白质和矿物质形成网络，降低酶可及性，并限制豆类食品的营养品质。为提升豆类蛋白品质，已建立了多种物理、化学和酶法。然而，生物学方法，尤其是发酵，作为提升豆类营养价值及食品应用潜力的可持续策略，已获得越来越多的关注。发酵涉及微生物的代谢活动，其产生多种酶促过程，可修饰豆类成分，如植酸降解、蛋白酶和单宁。这些酶促活动有助于降低抗营养因子、改善蛋白质可及性并生成生物活性化合物。
除降低抗营养因子外，发酵还在豆类蛋白中引发复杂的生化转化。事实上，微生物蛋白水解诱导蛋白质水解，随后释放肽段和游离氨基酸，这可能恢复消化率并生成生物活性肽。此外，发酵可以调整蛋白质结构、分子相互作用和技术功能特性（如溶解性、乳化性、起泡性和凝胶性），从而增加发酵豆类蛋白在功能性食品和植物基替代品中的潜在应用。发酵的效果在很大程度上取决于多种因素，如豆类品种、微生物菌株、发酵条件和加工参数。因此，选择合适的微生物和优化发酵过程对于在营养品质、感官特性和技术效率方面实现一致的提升至关重要。工业实施还必须面对有关工艺标准化、发酵时间、能耗、下游加工和质量控制的问题。
尽管以往的综述已详细考察了豆类发酵，特别是其对抗营养因子降低、消化率、营养品质和一般功能性的影响，但本综述采用了更加以蛋白质为中心和结构-功能导向的视角。它考察了菌株特异性蛋白水解和分子修饰如何改变蛋白质组成和结构，以及这些转化如何影响溶解性、乳化性、起泡性、凝胶性、消化率和感官特性。
重要的是，本综述超越了经常报道的益处，批判性地探讨了发酵的局限性和权衡，包括过度蛋白水解、理想蛋白质功能性的丧失以及菌株和底物间的结果变异性。它还考虑了加工和工业挑战，如发酵时间过长、工艺标准化和放大困难，以及潜在的不良感官效应。此外，它将上述变化与实际食品体系应用联系起来，讨论了如何将发酵豆类或其蛋白配料纳入植物基食品和其他配方中，以实现目标营养、技术功能和感官特性。
因此，本综述的主要新颖之处在于将抗营养因子缓解、蛋白质结构修饰、结构-功能关系、发酵局限性、感官权衡、可扩展性和食品应用整合到一个统一的机制和应用导向框架中，而非仅将发酵视为改善营养品质的策略。
因此，本综述旨在全面概述发酵在改善豆类蛋白中的作用。它重点关注抗营养因子的降低、蛋白质降解和修饰、蛋白质消化率和生物利用率的提升、功能特性的增强以及食品体系中的应用。此外，还讨论了将发酵与新兴加工技术相结合以开发高品质、营养丰富且可持续的豆类蛋白配料的潜力。
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文献综述方法
2.1. 文献检索与筛选
使用Web of Science（WoS）核心合集进行了广泛的文献检索。检索覆盖了从数据库建立至2026年8月可获得的出版物，重点关注发酵对豆类蛋白品质、抗营养因子、消化率、功能性和食品应用的影响。检索策略使用布尔运算符组合了以下关键术语：（“豆类蛋白”或“豆基蛋白”）和（“发酵”或“发酵的”）和（“蛋白质品质”或“消化率”或“功能性”）和（“抗营养因子”或“抗营养因子”）和（“食品应用”或“食品体系”）。在适当情况下，从选定出版物的参考文献列表中确定了其他相关参考文献。
当研究调查了豆类底物的发酵并报告了对蛋白质品质、消化率、功能性、抗营养因子或食品应用的相关影响时，该研究被视为符合条件。纳入了以英文发表且可获取全文的原创研究文章和相关综述论文。排除了与豆类发酵无关、缺乏相关信息或无法获取全文的研究。
文献筛选涉及标题、摘要和全文的依次筛选。在标题筛选期间，明确排除无关出版物。随后评估摘要与豆类蛋白、发酵、蛋白质品质、抗营养因子和食品体系的相关性。然后根据预定义的资格标准评估潜在相关出版物的全文。对选定的文献进行批判性评估和综合，以提供对当前知识、技术应用和研究空白的综合概述。由于这是一篇叙述性综述，未遵循正式的系统性或范围性综述方案。
参考文献使用EndNote X7?（Thomson Reuters，多伦多，安大略省，加拿大）进行管理。
2.2. 数据提取
系统地从符合条件的出版物中提取信息并由作者进行交叉核对。提取的数据包括第一作者、出版年份、豆类品种、发酵类型和条件、对蛋白质品质和消化率的影响、抗营养因子的变化、功能特性以及食品体系应用。随后对提取的信息进行批判性评估和综合，以确定主要发现、趋势、局限性和研究空白。
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豆类蛋白中的抗营养因子
3.1. 抗营养因子的分类
豆类蛋白中常见的抗营养因子包括植酸盐、单宁、蛋白酶抑制剂、凝集素和皂苷。文献中出现了两种反复出现的抗营养因子分类框架：按组成分类和按热稳定性分类。凝集素和蛋白酶抑制剂本质上是蛋白质，而非蛋白质类抗营养因子包括植酸盐、单宁、皂苷和生物碱。在热分类学方面，蛋白酶抑制剂和凝集素是热不稳定的，而植酸盐、单宁和皂苷是热稳定的抗营养因子。理解抗营养因子的分类有助于优化豆类加工，以生产更具生物可及性的豆类食品营养素。豆类种子中的抗营养因子通过湿化学和生物测定方法的组合进行测量。然而，最常见的方法是分光光度法测定植酸盐、单宁和皂苷，而酶抑制测定用于胰蛋白酶抑制剂，血凝集或蛋白质组学方法常用于凝集素。
3.2. 主要豆类中抗营养因子的存在情况
不同豆类品种、栽培品种、环境条件、农艺实践、种子成熟度和采后储存之间，抗营养因子的浓度和组成差异显著。这种变异性影响豆类的营养品质和加工干预措施。因此，了解大豆和菜豆等主要食用豆类中抗营养因子的分布，对于选择合适的加工技术以最大化营养素生物利用率，同时保留有益的植物化学物质至关重要。在许多研究中，大豆经常表现出高凝集素、植酸和皂苷含量。在加拿大豆类中，生大豆的凝集素（692.8 HU/mg）、植酸（22.91 mg/g）和草酸盐含量最高。此外，Gu等人报道大豆品种在胰蛋白酶抑制剂和凝集素含量上存在差异。大豆提取物还含有特别高的大豆皂苷I，比扁豆、豌豆和菜豆高4-6倍。另一种广泛消费的豆类是鹰嘴豆，通常含有单宁、植酸、胰蛋白酶抑制剂、皂苷和棉子糖家族寡糖（RFOs）。鹰嘴豆品种的单宁含量为0.07-0.22%，胰蛋白酶抑制剂含量为9-31 mg/g。不同品种的植酸范围为4.74-20.40 mg/g，并已鉴定出低抗营养因子基因型。此外，卡布里鹰嘴豆还含有单宁（0.24-0.60 g TAE/100 g）、植酸（17.61-29.72 mg/100 g）和棉子糖家族寡糖（1.33-3.06 g/100 g）。
菜豆或普通菜豆通常含有高植酸盐、胰蛋白酶抑制剂和凝集素。在鹰嘴豆、扁豆、蚕豆和菜豆中，菜豆的植酸盐和胰蛋白酶抑制剂活性最高。此外，普通菜豆地方品种的胰蛋白酶抑制剂水平为21.8-138.5 TIU/g，受基因型和地点影响。普通菜豆地方品种中观察到的广泛范围进一步表明，豆类间的比较应考虑基因型，而非仅依赖物种水平差异。在蚕豆和普通菜豆的比较中，普通菜豆的胰蛋白酶抑制剂活性更高。蚕豆中存在凝集素、胰蛋白酶抑制剂、皂苷、植酸盐、蚕豆嘧啶葡糖苷和伴蚕豆嘧啶葡糖苷。在瑞典蚕豆品种中，凝集素范围为0.8-3.2 HU/mg，胰蛋白酶抑制剂为1.2-23.1 TIU/mg，皂苷为18-109 μg/g，植酸盐为112-1281 mg/100 g，蚕豆嘧啶葡糖苷为403-7014 μg/g，伴蚕豆嘧啶葡糖苷为35.5-3121 μg/g。
Gultekin Subasi等人报道，皂苷水平因豌豆品种而异，且与面粉相比，蛋白质分离导致所有测试品种的皂苷富集约两倍。扁豆中存在植酸盐、单宁和草酸盐。此外，观察到豇豆品种间的抗营养因子存在差异，尽管它们集中在白蛋白和球蛋白组分中。
不同豆类的抗营养因子谱差异显著，这凸显了需要针对特定豆类制定加工策略，以降低抗营养因子并改善营养和技术功能特性。
3.3. 干扰蛋白质消化率和矿物质生物利用率的机制
豆类被公认为蛋白质、铁、锌、钙、镁和其他必需微量营养素的优质来源，但由于消化过程中抗营养因子与大分子之间的复杂理化相互作用，这些营养素的生物可及性常常受到限制。多种因素影响这些相互作用的程度，包括抗营养因子的种类和浓度、蛋白质的结构特征、加工技术以及消化道的生理条件。因此，评估豆类的营养价值需要同时进行成分评估和营养素生物利用率知识。植酸盐螯合二价矿物质（铁、锌、钙和镁）并形成不溶性植酸盐-矿物质复合物。此外，它们与蛋白质和消化酶结合，导致蛋白质溶解度降低和蛋白水解抑制。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂（丝氨酸蛋白酶）通过形成蛋白质-蛋白质相互作用来阻碍酶活性。因此，通过蛋白酶抑制剂的N-或C-末端和暴露环阻断酶的活性位点来抑制酶作用。胰蛋白酶抑制剂强烈抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，导致膳食蛋白质的消化和吸收减少。
豆类中存在的凝集素与肠上皮细胞上的碳水化合物受体结合，并非特异性地干扰分泌、营养素吸收和粘膜功能。单宁与蛋白质和矿物质元素形成复合物，使其无法被吸收和利用。此类相互作用可降低蛋白质消化率和矿物质可及性，并可能因此导致营养素生物利用率降低。而皂苷与蛋白质形成复合物并阻止蛋白质消化。
3.4. 抗营养因子的健康影响
据报道，抗营养因子具有积极和消极的健康影响。因此，不能简单地将抗营养因子标记为豆类中存在的“有害”化合物。它们最好被理解为剂量依赖性生物活性化合物，在高水平或生食时可能损害营养，但在较低水平或加工后也可能带来健康益处。
植酸盐通常通过结合金属来降低矿物质吸收，但据报道其也具有抗氧化和可能的抗癌作用。研究发现，补充植酸可减少结肠和乳腺细胞增殖。类似地，单宁可以结合蛋白质和矿物质并降低消化率，但也具有抗氧化和抗炎活性。高水平的膳食胰蛋白酶抑制剂可导致蛋白质和氨基酸消化率大幅降低。凝集素和蛋白酶抑制剂的降血脂和抗肿瘤特性也已得到证实。皂苷会导致营养素吸收减少和腹胀，但也据报道具有降低胆固醇和其他生物活性特性。
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发酵对抗营养因子的影响
发酵是一种有效且可持续的生物加工方法，通过降低抗营养因子来改善豆类的营养品质。与降解热不稳定化合物的热处理不同，发酵过程中微生物代谢活动产生一系列水解酶，可降解多种抗营养因子并改善消化率。这些变化的程度取决于豆类品种和栽培品种、微生物和菌株、发酵类型、底物特性和制备方法，以及加工条件，如温度、pH、发酵时间、水分含量和氧气可用性。此外，这些因素可以相互作用，决定豆类基质内微生物生长、酶活性和抗营养因子的可及性。因此，应根据目标抗营养因子和底物特性优化发酵条件，而不是假设不同豆类和发酵体系具有统一响应。
4.1. 植酸盐的降低（植酸酶活性）
植酸盐是植酸（PA，肌醇1,2,3,4,5,6-六磷酸二氢酯，IP6）储存形式的盐。发酵是通过利用植酸酶降低植酸盐的重要生物学方法。因此，植酸被水解为无机磷酸盐和肌醇磷酸衍生物。用少孢根霉发酵大豆、豇豆和地豆分别导致植酸降低30.7%、32.6%和29.1%。在一项研究中，浸泡和发芽后进行植物乳杆菌299v发酵，使玉米粉中的植酸盐降低了85.6%，而单独发酵导致植酸盐降低65.3%。此外，据报道共培养发酵改善了植酸降低效果。这些研究间植酸降低程度的差异表明，发酵效果强烈依赖于加工体系。用少孢根霉发酵大豆、豇豆和地豆观察到的相对相似的降低效果可能反映了使用相同微生物，而浸泡和发芽先于发酵时观察到的显著更大降低效果可能与这些预处理和发酵的联合效应有关。共培养发酵观察到的更高降低效果进一步表明，微生物组成和相关的植酸酶活性可以影响植酸降解。此外，发酵过程中植酸降解的程度特别受微生物或菌株及其植酸酶活性的影响，而pH、温度、发酵时间和底物制备影响酶活性和植酸盐对微生物或内源性植酸酶的可及性。
4.2. 单宁和多酚的降解
发酵可降解豆类中的单宁并修饰多酚。单宁的降解产物可能有助于发酵后总酚含量的增加。在蚕豆酸面团发酵过程中，缩合单宁减少了30-50%。而总酚和抗氧化活性增加，暗示微生物酯酶活性和酸化在酚类释放中的作用。黄扁豆和红扁豆、白豆和黑豆、鹰嘴豆和豌豆谷物的糊化面粉用植物乳杆菌MRS1和短乳杆菌MRS4进行发酵，与单独发酵相比，植酸、单宁和棉子糖的降解得到改善。对于单宁，降低程度取决于微生物菌株及其酶能力，以及发酵持续时间、pH和底物特性。因此，总酚含量的变化不应必然被解释为单宁降解的直接证据，因为发酵也可能改变酚类化合物的可提取性和化学形式。
4.3. 发酵对蛋白酶抑制剂的灭活
胰蛋白酶抑制剂被认为是主要豆类（包括大豆、鹰嘴豆、菜豆、蚕豆、豌豆、豇豆、黑豆和扁豆）中的主要蛋白酶抑制剂。乳酸菌（LAB）可产生胞外和胞内蛋白酶，在发酵过程中促进蛋白水解，也可能有助于降解或结构修饰蛋白质类胰蛋白酶抑制剂。此外，发酵过程中的酸化可进一步改变理化环境，并可能影响蛋白酶抑制剂的稳定性或活性。因此，胰蛋白酶抑制剂活性的降低可能取决于微生物或菌株、发酵条件和豆类基质特性。用植物乳杆菌DPPMAB24W发酵地中海蚕豆，胰蛋白酶抑制剂降低66.67%至89.65%。此外，与盐水作为发酵介质相比，使用乳清发酵的豆类表现出更优的品质特征，包括抑制剂活性下降更多、外观更鲜艳和更好的感官可接受性。有趣的是，大豆、青豌豆和扁豆面粉经超声处理（2-4分钟）后用植物乳杆菌发酵，胰蛋白酶抑制剂也显著降低。这些研究间的差异表明，胰蛋白酶抑制剂活性的降低受发酵体系和预处理的影响。蚕豆中报道的降低效果是使用确定的植物乳杆菌菌株获得的，而乳清与盐水相比观察到的更大降低效果表明发酵介质也会影响抑制剂灭活。类似地，大豆、青豌豆和扁豆发酵前使用的额外超声预处理表明，面粉基质的破坏可能影响蛋白质类抑制剂对微生物或酶作用的可及性。然而，由于豆类品种、微生物菌株、底物形式和发酵条件不同，这些研究间的直接定量比较应谨慎进行。除降低蛋白酶抑制剂活性外，发酵可能通过微生物蛋白水解、蛋白质-蛋白质相互作用的变化以及蛋白质-抗营养因子相互作用的改变来修饰蛋白质结构。这些变化可影响肽键对消化酶的可及性，并因此影响蛋白质消化率。然而，这些变化的方向和程度取决于豆类基质、微生物和发酵条件。
4.4. 凝集素和其他化合物的解毒
凝集素由于其热不稳定性，通常通过烹饪和发酵降低到更安全的消费水平。使用嗜热链球菌14085和婴儿双歧杆菌14603在37°C下乳酸发酵24小时，降低了豆乳中的皂苷和植酸盐。图1说明了发酵在豆类抗营养因子中的作用。在发酵过程中，微生物酶通过植酸水解、多酚分解、蛋白酶抑制剂降解和解毒过程降解或灭活这些化合物。这些转化可降低抗营养因子的潜在抑制作用，并可能改善营养素可及性和蛋白质消化率；然而，抗营养因子含量或活性的降低本身并不能确定营养素生物利用率的提高。证明矿物质生物利用率改善需要矿物质可及性、吸收或其他验证性营养结果的适当证据。
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发酵过程中的蛋白质降解和修饰
5.1. 蛋白水解机制和关键酶
蛋白水解是豆类发酵过程中发生的最重要生化反应之一。这种蛋白质降解源于内源性种子蛋白酶和微生物蛋白水解酶的协同活性，它们催化豆类蛋白的水解和抗营养化合物的降解。在豆类中，主要储存蛋白（7S豌豆球蛋白和11S豆球蛋白）占总蛋白组分的近70-80%，代表发酵过程中微生物蛋白水解酶的主要底物。这些蛋白酶在储存蛋白转化中起关键作用，将其切割成更小的肽段和游离氨基酸（FAAs），这些产物易于被微生物同化，并改善底物的营养品质。此外，已确定蛋白水解不仅增强蛋白质消化率，还产生具有有趣生物活性的肽段。同样重要的是要注意，蛋白水解机制因发酵微生物而异。事实上，乳酸菌（LAB）（如植物乳杆菌、干酪乳杆菌和戊糖片球菌）具有特定的蛋白水解系统，包括细胞包膜蛋白酶（CEPs）（由PrtP、PrtH、PrtR或PrtS基因编码）、肽转运系统（寡肽通透酶“Opp”、二肽通透酶“Dpp”和二/三肽转运蛋白“DtpT”）以及广泛的胞内肽酶，如氨肽酶（PepN、PepC和PepA）、内肽酶（PepO和PepF）、二肽酶（PepD和PepV）、三肽酶（PepT）和脯氨酸特异性肽酶（PepX、PepP和PepQ）。为了更全面地理解这一机制，可以强调胞外CEPs首先将完整储存蛋白水解为寡肽，随后被转运到微生物细胞中，胞内肽酶在其中生成微生物生长所需的短肽和FAAs。
在豆类碱性发酵中，如用于生产一些典型豆类发酵食品（如日本的纳豆、印度和尼泊尔的kinema、泰国的thua nao和西非的dawadawa），经常使用芽孢杆菌属物种，特别是枯草芽孢杆菌，其蛋白水解活性强于乳酸菌。已知这种微生物分泌多种胞外酶，如碱性丝氨酸蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）、中性金属蛋白酶和谷氨酰内肽酶，能够将球蛋白快速水解为低分子量肽段。
此外，真菌发酵，如涉及少孢根霉的天培（传统印度尼西亚大豆发酵食品）生产，通过分泌酸性和中性蛋白酶以及氨肽酶和羧肽酶，对蛋白质水解有显著贡献。
除微生物酶外，内源性豆类蛋白酶在发酵过程中保持活性。事实上，酸化、水合和细胞壁破坏促进液泡蛋白酶（主要是半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶）的激活，在微生物蛋白酶占主导地位之前导致储存蛋白的部分降解。实际上，发酵微生物产生的有机酸降低了底物的pH，为内源性和微生物酶活性创造了有利条件，同时抑制了不良微生物。因此，可以认为植物和微生物酶的联合活性导致强协同蛋白水解过程。
此外，已确定蛋白水解受发酵参数的影响，如pH、温度、发酵持续时间、水分含量、氧气可用性和微生物。在此背景下，酸性发酵有利于乳酸菌肽酶在酸性条件（pH 4.0-5.5）下的活性，而碱性发酵促进芽孢杆菌属物种在pH值高于7.0时产生胞外蛋白酶。温度也调节酶合成，最佳蛋白水解活性通常在30°C至40°C之间，取决于微生物物种。关于发酵时间，据报道其增加强烈增强水解程度。此外，适当的水分含量和氧气可用性（厌氧或微需氧条件）通过促进微生物生长、底物可及性和酶扩散在增强蛋白水解方面发挥关键作用。最后，选择高效起始培养物和优化发酵参数通常比自发发酵产生更可重复的蛋白水解模式，从而有助于改善发酵豆类食品的营养、技术和感官品质。因此，理解这些酶促机制对于设计最大化蛋白质品质同时产生有用蛋白质变化和产生促进健康的生物活性肽的发酵策略至关重要。
5.2. 蛋白质结构和分子量分布的变化
发酵诱导豆类蛋白结构的深度修饰，影响其转化、分子量分布、分子相互作用和溶解性。这些转化由酶促蛋白水解、酸化和理化变化以及整个发酵过程中发生的微生物代谢驱动。它们有助于将致密的储存蛋白转化为更小、更易消化的蛋白质片段，具有改善的营养价值谱和技术功能特性。事实上，豆类储存蛋白表现出高度有序的二级、三级和四级结构，由氢键、疏水相互作用、静电力和分子间二硫键稳定，例如豆球蛋白的情况。这些结构特征赋予显著的稳定性，但也限制了胃肠消化过程中的酶可及性。在发酵过程中，微生物蛋白酶逐步切割肽键，导致天然蛋白质结构的部分或显著展开。此外，与pH降低相关的乳酸发酵可通过破坏静电相互作用和促进蛋白质溶胀来破坏蛋白质结构，从而有助于暴露埋藏的切割位点给蛋白水解酶。在这方面，多种技术证实了蛋白质构象特征的这些变化。实际上，使用圆二色性（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和荧光光谱的光谱分析已证明，发酵过程中α-螺旋含量减少，β-折叠结构、无规卷曲和柔性肽区域相对增加。这些结构重排增加了分子柔性和表面疏水性，但促进了酶可及性和水渗透到蛋白质基质中。此外，分子间聚集体的破坏减少了空间位阻，从而改善了蛋白质对胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰酶等消化酶的敏感性。
另一方面，据报道发酵最重要的后果之一是蛋白质分子量的重新分布。事实上，SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）显示高分子量球蛋白亚基（通常在40至70 kDa范围内）逐渐消失或减弱，同时积累低于10-15 kDa的低分子量肽段。此外，LC-MS（液相色谱-质谱联用）技术证实，广泛蛋白水解将肽群转向由2至20个氨基酸残基组成的较短序列。这种分子量降低与蛋白质消化率、氨基酸生物可及性和生物活性肽释放的增强正相关。
此外，结构修饰的程度强烈依赖于发酵微生物。事实上，乳酸菌由于其胞内肽酶系统通常诱导适度和选择性水解，而枯草芽孢杆菌产生大量胞外碱性蛋白酶和金属蛋白酶，能够将储存蛋白广泛降解为可溶性肽段和FAAs。类似地，涉及真菌（特别是少孢根霉）的发酵通过分泌酸性和中性蛋白酶促进蛋白质基质的显著降解，导致蛋白质分子量显著降低和消化率提高。因此，碱性发酵（使用芽孢杆菌属）通常表现出比酸性发酵（乳酸菌和真菌）更高的蛋白质水解程度，尽管后者通常保留更好的感官特性。
除蛋白水解降解外，发酵还修饰控制蛋白质功能性的分子间相互作用。值得注意的是，部分水解减少蛋白质聚集，同时增加分子流动性，导致溶解性、乳化能力、起泡性和持水性增强。接近等电点的酸化最初降低蛋白质溶解度；然而，持续酶促水解产生具有更大亲水性和改善水分散性的更小肽段。这些理化变化对于开发创新植物基乳制品替代品、蛋白饮料、发酵豆类配料和具有高功能性能的肉类类似物特别有价值。
此外，先进蛋白质组学分析揭示，发酵过程中的蛋白质结构重塑是高度选择性的而非随机的。值得注意的是，蛋白酶优先水解暴露的肽区域，同时保留更抗性的结构域直到发酵后期。因此，中间肽段在进一步水解之前短暂积累，取决于发酵持续时间和微生物酶活性。这种动态重塑产生异质性肽谱，最终决定发酵豆类的营养和生物学特性。
总体而言，发酵过程中豆类蛋白的结构重组是改善蛋白质品质的基本机制。将致密球状蛋白逐步转化为小且结构灵活的肽段被认为提供多种益处：（i）增强消化率，（ii）增加氨基酸可用性，（iii）改善功能特性，以及（iv）为生成促进健康的生物活性肽创造分子前体。因此，理解蛋白质结构变化与分子量分布之间的关系对于优化发酵过程以生产用于未来功能性食品应用的高品质植物蛋白配料至关重要。
5.3. 肽段和游离氨基酸（FAAs）的释放
肽段和FAAs的释放构成豆类发酵最重要的生化后果之一，代表微生物和内源性蛋白水解活动的直接结果。随着储存蛋白被逐步水解，复杂的球状结构被转化为寡肽、二/三肽和单个氨基酸，产生高度动态的肽谱（如疏水残基、芳香族氨基酸和含脯氨酸基序等），不仅作为微生物生长的必需营养素，还作为发酵豆类营养、生物学和感官特性的关键贡献者。肽段和FAA积累水平取决于蛋白水解程度、发酵条件、微生物菌株和豆类蛋白基质的固有组成。特别是，谷氨酸含量的积累在此背景下值得注意，因为它有助于发酵豆制品（如天培、纳豆、kinema和dawadawa）的特征鲜味。类似地，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸浓度升高在改善口感和整体风味方面发挥重要作用。如上所述，蛋白水解微生物表现出高度协调的酶系统，逐步将蛋白质降解为更小的分子。具体而言，胞外蛋白酶首先将储存蛋白分解为中间肽段，随后通过ATP结合盒（ABC）肽转运蛋白转运到微生物细胞中。然后，这些肽段经历胞内肽酶的进一步水解，导致支持微生物代谢和蛋白质生物合成的FAAs释放。然而，重要的是，并非所有肽段都被完全降解；相当比例在发酵底物中积累，并有助于其改善的营养和生理功能性。此外，据报道发酵显著增加了必需氨基酸（EAAs）的浓度，如赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸，这些在植物性饮食中经常受限。
关于肽段和FAA释放的微生物能力，它们因物种而异。更准确地说，乳酸菌由于其适度的蛋白水解通常产生多样的肽混合物，特点是胞内肽酶系统占主导，而芽孢杆菌属物种（特别是枯草芽孢杆菌）通过分泌大量胞外碱性蛋白酶，从广泛蛋白质水解中产生高水平的可溶性肽段、氨基氮和FAAs。
5.4. 生物活性肽的形成
豆类发酵最有价值的生物学结果之一是生物活性肽的生成。这些是特定的蛋白质片段，表现出超出其营养作用的生物活性和生理效应。此外，它们被加密在天然储存蛋白的一级序列中，在通过食品加工、微生物发酵或胃肠消化过程中的酶促水解释放之前保持生物学非活性。在这方面，重要的是，发酵已被描述为能够释放这些功能性肽段的最有效和可持续的生物过程之一，具有多样且有趣的生物活性。
生物活性肽的形成主要由微生物蛋白水解系统的特异性驱动。事实上，在发酵过程中，各种蛋白酶逐步将豆类蛋白水解为不同的较短寡肽，这些寡肽可能表现出生物活性，取决于其氨基酸序列、分子大小、疏水性和结构构象。
另一个值得注意的方面是，在豆类发酵衍生的生物活性肽所归因的生物学特性中，抗氧化活性已被最广泛研究。这种活性强烈归因于含有疏水性氨基酸、含硫氨基酸（如甲硫氨酸和半胱氨酸）、芳香族残基（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）和组氨酸残基的肽段，这些残基能够稳定活性氧（ROS）。在此，已证明发酵显著增加豆类蛋白水解物的抗氧化能力，从而有助于减少与慢性疾病相关的氧化应激。另一主要类别包括血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽，因其潜在抗高血压作用而受到广泛关注，为传统药物提供了有前景的替代方案。事实上，ACE催化血管紧张素I转化为血管紧张素II，这是一种参与血压调节的强效血管收缩剂。发酵过程中释放的短肽可以竞争性抑制ACE活性，减少血管紧张素II形成，从而促进血管舒张。然后，C-末端含有疏水性氨基酸或脯氨酸残基的肽段通常表现出最高的抑制效力。据报道，发酵豆类、大豆、豌豆、鹰嘴豆和扁豆蛋白均含有通过微生物蛋白水解产生的ACE抑制肽。因此，这些通过发酵产生的肽段可能具有潜在抗高血压作用；然而，它们直接发挥临床相关血压降低的能力仍有待在适当的动物模型和最终严格控制的人体干预研究中体内证实。
近期研究还强调了发酵豆类肽段抑制二肽基肽酶IV（DPP-IV）的能力，该酶参与肠促胰岛素激素（如胰高血糖素样肽-1（GLP-1））的降解。观察到的DPP-IV抑制活性表明，这些肽段可能干扰与葡萄糖稳态相关的酶途径。机制上，抑制DPP-IV可能有助于维持内源性肠促胰岛素活性，从而可能延长GLP-1介导的葡萄糖依赖性胰岛素分泌刺激，并改善餐后血糖调节，表明与膳食调节血糖反应具有潜在相关性。此外，已观察到几种发酵衍生肽段表现出α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，从而有助于调节餐后葡萄糖反应。因此，所有这些生理效应应被视为其潜在抗糖尿病相关性的指示，不能直接从体外测定推断或作为改善血糖控制或治疗2型糖尿病疗效的证据，因为体内生物活性取决于多种因素（肽段稳定性、肽段浓度、与食物的相互作用、到达分子靶点的能力等）。因此，需要进一步的体内研究来确定这些体外发现是否转化为临床相关效应。
此外，豆类蛋白发酵过程中产生的众多肽段表现出抗菌、免疫调节和心脏代谢特性。抗菌活性可以通过富含赖氨酸和精氨酸的阳离子肽段与带负电的微生物膜相互作用来解释，这增加了膜通透性并最终导致微生物细胞死亡。对于一些生物活性肽段的免疫调节作用，可与其调节先天性和适应性免疫反应的能力相关联，通过调节细胞因子分泌、巨噬细胞活化和炎症信号通路。然后，已证明抗炎肽段抑制核因子-κB（NF-κB）的激活，减少促炎介质的产生，并在细胞模型中减轻氧化损伤。因此，需要进一步的人体临床试验来确认这些生物学效应。
发酵衍生肽段的生物活性取决于几个结构决定因素（如肽段长度）、氨基酸组成、电荷分布、疏水性和对胃肠消化的抗性。一般来说，小肽段，特别是二肽和三肽，表现出最大的生物利用率，因为它们可以抵抗消化降解并通过肽转运蛋白1（PEPT1）穿过肠上皮转运。然而，并非所有发酵过程中产生的肽段都能完整到达体循环；许多在胃肠道内发挥局部作用或在消化过程中被进一步切割成更小的活性片段。因此，评估肽段生物活性需要将肽组学表征与模拟胃肠消化和细胞或体内验证相结合。尽管支持发酵衍生肽段促进健康特性的证据日益增多，但仍需解决若干挑战。实际上，除了减少对体外实验依赖的体内人体研究的令人鼓舞的结果外，微生物菌株选择、底物组成和加工参数强烈影响肽谱，突显了旨在产生可重复和高效生物活性肽段的标准化发酵方案的必要性。未来结合受控发酵、先进技术和基于人体的临床验证的研究无疑将加强发酵豆类作为天然生物活性肽段可持续来源的作用，用于预防和管理非传染性疾病。
5.5. 降解与营养增强之间的平衡
发酵过程中的蛋白质降解代表一个高度动态的过程，其中蛋白水解程度最终决定发酵是导致营养改善还是不良品质恶化。这就是为什么控制发酵构成一种微妙的策略，以维持或增强豆类蛋白的营养价值。首先，适度蛋白质水解一直与蛋白质营养品质的显著改善相关。为支持这一点，Adebo等人、Du等人和Carbonaro等人认识到，部分蛋白水解破坏豆类储存蛋白的致密四级结构，增加其对消化酶的可及性，从而增强蛋白质消化率。同时，发酵降低抗营养化合物（如胰蛋白酶抑制剂、单宁、凝集素和植酸盐）的浓度，这些化合物否则会损害蛋白质消化和矿物质生物可及性。因此，蛋白质展开、酶促水解和抗营养因子降解的联合效应显著促进生物活性肽生成，并改善氨基酸利用和蛋白质生物可及性。
其他研究证明，通过受控蛋白水解改善蛋白质品质可以通过营养指数评估，如发酵某些豆类（大豆、鹰嘴豆、扁豆和豌豆）后体外蛋白质消化率（IVPD）、可消化必需氨基酸评分（DIAAS）和蛋白质消化率校正氨基酸评分（PDCAAS）的增加。这些观察到的增强不仅源于改善的酶可及性，还源于蛋白质-多酚和蛋白质-植酸盐复合物的部分降解，这些复合物否则限制胃肠消化。因此，很明显发酵有助于更有效地利用FAAs和EAAs，这对肌肉蛋白质合成和代谢健康很重要。另一方面，据报道受控蛋白水解在改善豆类蛋白的技术功能特性方面也发挥核心作用，使其更适合各种食品应用。事实上，豆类蛋白水解可以增加分子柔性、表面疏水性和蛋白质溶解度，导致乳化、起泡、持水和凝胶能力增强，这对于开发新颖和更可持续的食品配方（如高蛋白功能性食品、植物基乳制品替代品、发酵饮料和肉类类似物）很有价值。虽然蛋白质降解对于提供营养优势（如生成生物活性肽、增加氨基酸生物可及性、增强消化率和降低抗营养因子）至关重要，但过度水解可以产生太小而无法稳定乳液或泡沫并形成内聚凝胶网络的肽群，从而降低功能特性、加工性能和产品稳定性。此外，不受控制的蛋白水解可能通过促进发酵豆类食品的不良感官属性（在风味、质地和口感方面）对蛋白质品质产生负面影响。例如，几项研究表明，储存蛋白的广泛降解导致FAAs和疏水性氨基酸（如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和酪氨酸）的过度积累，这可能造成苦味和不良风味特征。此外，微生物过度氨基酸分解代谢（源于其用作生长氮源和碳源）可能（i）产生氨、生物胺、含硫挥发性化合物和支链醛，（ii）可能降低某些EAAs的可用性，（iii）降低蛋白质组分的生物学价值，以及（iv）如果发酵时间过长且未充分控制，损害感官可接受性和食品安全。因此，豆类发酵的营养成功高度依赖于在受控蛋白水解和通过保留蛋白质完整性进行营养增强之间实现最佳平衡。该平衡受多种发酵加工变量的影响，如上详述，包括微生物菌株选择、接种物浓度、温度、pH、水分和氧气可用性、底物组成和发酵时间。事实上，表现出适度但高度特异性蛋白水解系统的起始培养物通常比自发发酵产生更理想的营养结果（如前所述），自发发酵通常在微生物演替和蛋白酶表达方面表现出更大变异性。因此，将精选乳酸菌与特定芽孢杆菌或真菌物种相结合的混合起始培养物最近引起了相当大的兴趣，因为它们能够实现互补酶活性，实现高效肽段生产，同时最小化过度蛋白质降解和不良代谢物形成。
此外，根据预定营养目标调节蛋白水解活性可能代表食品生物技术中优化豆类蛋白发酵过程的有前景进展。事实上，结合基因组学、蛋白质组学、肽组学、代谢组学和生物系统的综合方法可以允许深入表征
