## 中文标题 KRAS突变富集的嗜酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）促进结直肠肿瘤发生

《Cell Host & Microbe》：Bacteroides acidifaciens enriched by KRAS mutation promotes colorectal tumorigenesis

　　

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是一种受肿瘤微生物组和宿主遗传学影响的多因素疾病，尤其是激活KRAS以刺激RAF-MEK-细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）增殖级联反应的突变。然而，宿主遗传学与肿瘤微生物组之间的相互作用仍不清楚。在本研究中，研究人员分析了来自KRAS突变型CRC患者和肠道特异性致癌KRAS^G12D小鼠的瘤内微生物组，揭示KRAS重塑微生物群落，富集可预测KRAS突变型CRC患者不良预后的嗜酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）。通过使用具有或不具有突变KRAS的同源（isogenic）CRC细胞和小鼠，研究人员证明B. acidifaciens促进KRAS突变型CRC细胞和肠道特异性KRAS^G12D小鼠的恶性表型，但对野生型对应物无此作用。B. acidifaciens的SusF蛋白结合并稳定ARHGEF2，从而促进活化KRAS及RAF-MEK-ERK信号传导。在KRAS突变型CRC细胞中敲除SusF或敲除ARHGEF2可消除B. acidifaciens的促肿瘤效应。这些观察结果为靶向突变KRAS驱动的B. acidifaciens以减轻导致肿瘤发生的前馈信号传导提供了策略。

## 论文解读

### 研究背景

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，是一种涉及宿主遗传与表观遗传改变以及饮食、生活方式和肠道菌群失调等环境因素复杂交互的多因素疾病。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）是CRC中最主要的驱动突变基因，约45%的CRC患者携带该突变，且该突变不仅促进CRC进展，还驱动对表皮生长因子受体（EGFR）治疗的耐药。过去十年中，肠道菌群失调已被认为是CRC的重要标志之一，表现为致病共生菌（pathobionts）富集伴随益生菌耗竭。然而，尽管大量研究揭示了肠道致病菌在CRC发展中的促肿瘤功能，但关于其在宿主体细胞突变背景下的作用鲜有探索。临床队列数据表明肠道菌群组成与CRC分子特征及共识分子亚型（CMS）密切相关，瘤内微生物组的异质性也与KRAS突变等宿主分子特征相关联。新近研究提示致癌突变不仅是肿瘤进展的遗传驱动因素，还关键性地调控包括肿瘤相关菌群在内的肿瘤微环境。因此，宿主遗传突变与肠道菌群失调之间的双向交互作用如何协同促进CRC加速发展，其因果关系亟待阐明。

### 研究内容与意义

研究人员对KRAS突变型CRC患者及肠道特异性KRAS^G12D突变小鼠与其野生型对照的黏膜微生物组进行了比较分析，鉴定出肠道共生菌嗜酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens）为KRAS突变患者和小鼠中富集程度最高的候选菌种。通过同源（isogenic）CRC细胞系（含或不含致癌KRAS突变）及小鼠模型，研究人员证实B. acidifaciens选择性赋予KRAS突变型CRC细胞促增殖功能，而对同源KRAS野生型细胞无影响；B. acidifaciens灌胃在肠道特异性KRAS^G12D小鼠结肠中发挥显著的促肿瘤活性，而对野生型小鼠CRC发展无影响。机制研究表明，B. acidifaciens对KRAS突变型CRC细胞的选择性由其表面蛋白SusF介导，该蛋白激活Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子2（ARHGEF2）依赖的KRAS信号通路。该研究揭示了基因突变与瘤内微生物组改变之间形成正反馈循环共同促进结直肠肿瘤发生的机制，为靶向KRAS突变型CRC的微生物-宿主交互界面提供了潜在治疗策略。该论文发表于《Cell Host》。

### 主要技术方法

研究采用以下关键技术：（1）16S rRNA基因测序（含PacBio平台全长16S rRNA-seq）分析微生物群落组成；（2）荧光原位杂交（FISH）和qPCR验证B. acidifaciens丰度；（3）同源CRC细胞系（DLD1/DKS8、HCT116/HKE3）及小鼠CRC类器官模型；（4）小鼠模型包括BALB/C裸鼠皮下异种移植、NSG小鼠原位移植及氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导肿瘤模型；（5）RNA测序、活性KRAS pulldown、生物素pulldown联合质谱、GST pulldown、免疫共沉淀、微量热泳动（MST）及Duolink邻近连接实验；（6）CRISPR/Cas9基因敲除及B. acidifaciens SusF基因缺失突变株构建。样本队列包括队列I（n=138，来自中山医院、厦门大学及河北医科大学第四附属医院）、队列II（n=199，香港中文大学组织芯片队列）、队列III（n=27，香港中文大学）及TCGA/TCMA公共数据库外部验证队列。

### 研究结果

#### B. acidifaciens是KRAS突变型CRC患者及肠道特异性KRAS突变小鼠中富集程度最高的菌种

通过16S rRNA测序分析138例具有KRAS突变状态的CRC组织样本（队列I），差异丰度分析显示Bacteroides属在KRAS突变型CRC中富集最显著。利用肠道特异性KRAS^G12D/+Villin-Cre小鼠及条件性KRAS^G12D/+Cdx2-CreERT2小鼠，发现突变KRAS激活1个月后粪便中B. acidifaciens丰度即显著升高（p<0.001）。FISH和qPCR分别在队列II（n=199）和队列III（n=27）中验证了KRAS突变型CRC肿瘤中B. acidifaciens上调。TCGA/TCMA外部验证显示52.9%的KRAS突变型CRC患者B. acidifaciens阳性（野生型为42.8%），且高丰度与KRAS突变型CRC患者不良生存显著相关（p=0.01），而KRAS野生型中无此关联。

#### B. acidifaciens选择性促进KRAS突变型CRC细胞及类器官的体外生长

在DLD1（KRAS^G13D）与同源KRAS野生型DKS8、HCT116（KRAS^G13D）与HKE3细胞中，活菌或巴氏灭活B. acidifaciens（MOI=500–1000）选择性促进KRAS突变型细胞增殖并诱导集落形成，对野生型无影响。条件培养基及transwell共培养实验表明其表面分子介导该促增殖效应。B. acidifaciens还促进Apc^Min/+Kras^G12D/+类器官及人源KRAS突变型类器官（PDO-74）的生长，上调增殖标志物增殖细胞核抗原（PCNA）并下调凋亡标志物cleaved-PARP。

#### B. acidifaciens加速KRAS突变型CRC异种移植瘤生长及肠道特异性KRAS突变小鼠的结肠肿瘤发生

在BALB/C裸鼠皮下DLD1和HCT116异种移植模型中，活菌或巴氏灭活B. acidifaciens瘤内注射均显著促进肿瘤生长（p<0.0001）。在NSG小鼠原位移植模型中，B. acidifaciens灌胃（10⁸ CFU/只）显著增加DLD1和HCT116肿瘤体积及重量（p<0.0001）。在AOM/DSS诱导的肠道特异性Kras^G12D/+小鼠中，B. acidifaciens灌胃显著增加肿瘤数量和负荷（p<0.0001），提高高级别异型增生和腺癌比例；而KRAS野生型同窝小鼠中B. acidifaciens未能加速CRC生长。

#### B. acidifaciens在KRAS突变型CRC中诱导KRAS-MEK-ERK信号过度激活

RNA-seq及KEGG/GO富集分析显示RAS信号通路和RAS GEFs RAS GTP交换为B. acidifaciens在KRAS突变型CRC细胞中上调的最显著通路。活性KRAS pulldown实验证实B. acidifaciens增强DLD1和HCT116细胞中活性KRAS水平，而对DKS8和HKE3无效应。B. acidifaciens选择性激活KRAS突变型CRC细胞中p-BRAF、p-c-RAF、p-MEK、p-ERK、p-p90核糖体S6激酶（RSK）和p-蛋白激酶B（AKT）。体内实验一致显示B. acidifaciens在Kras^G12D/+小鼠肿瘤中激活MAPK信号，而野生型小鼠无此效应。

#### B. acidifaciens通过表面蛋白SusF黏附于KRAS突变型CRC细胞

扫描电镜和透射电镜显示B. acidifaciens选择性附着于DLD1和HCT116细胞表面并可侵入细胞内，而DKS8和HKE3细胞无此现象。蛋白酶K和高温处理消除其促增殖效应，表明细菌蛋白组分参与该过程。生物素pulldown联合定量质谱鉴定出B. acidifaciens外膜蛋白SusF为选择性结合KRAS突变型CRC细胞的主要候选蛋白。GST pulldown和质谱分析确定宿主细胞ARHGEF2为SusF的结合伙伴，免疫共沉淀验证了二者的直接蛋白-蛋白相互作用，微量热泳动（MST）实验证实其高亲和力结合（K_d=10 nM）。

#### SusF对B. acidifaciens在KRAS突变型CRC中的促肿瘤作用至关重要

重组SusF剂量依赖性地促进DLD1和HCT116细胞增殖及Apc^Min/+Kras^G12D/+类器官生长，并在KRAS突变型细胞中诱导活性KRAS及下游MAPK信号激活。构建SusF缺失突变株（B. acidifaciensΔSusF）后，其促进Kras^G12D/+小鼠AOM/DSS诱导肿瘤发生的能力完全丧失，但突变株仍保持活力、仅结肠定植能力降低。抗SusF抗体中和可消除B. acidifaciens的促增殖和信号激活效应，提示靶向SusF是可行策略。

#### ARHGEF2介导B. acidifaciens SusF促进KRAS突变型CRC生长的效应

ARHGEF2在KRAS突变型CRC细胞（DLD1、HCT116）中较野生型对应细胞过表达，B. acidifaciens或重组SusF通过抑制泛素-蛋白酶体降解途径（而非自噬途径）增强ARHGEF2蛋白稳定性，且不改变其mRNA水平。交联质谱和分子对接鉴定出SusF与ARHGEF2的结合位点邻近Lys-230和Lys-235。Duolink邻近连接实验证实SusF与ARHGEF2在KRAS突变型CRC细胞膜上共定位。ARHGEF2敲除完全废除B. acidifaciens和SusF介导的细胞增殖促进、MAPK信号激活及体内异种移植瘤生长促进作用。

### 讨论与结论

讨论部分指出，本研究通过人类CRC队列与小鼠模型的系统性比较分析，发现KRAS突变重塑结肠黏膜微生物群落，选择性富集B. acidifaciens，该菌在KRAS激活后1个月即在条件性小鼠中显著富集，提示其可能作为"驱动菌"发挥促肿瘤功能。B. acidifaciens作为一种已知保护代谢疾病和肝脏疾病的肠道共生菌，此前与癌症无已知关联，本研究揭示了其KRAS突变特异性的促癌新功能。该菌的促肿瘤作用严格依赖宿主肿瘤细胞中突变KRAS的存在，机制上通过SusF-ARHGEF2轴实现：B. acidifaciens表面蛋白SusF与KRAS突变型CRC细胞中过表达的ARHGEF2结合并抑制其泛素化降解，从而稳定ARHGEF2蛋白，激活KRAS-Raf-MEK-ERK级联，形成突变KRAS-B. acidifaciens正反馈环路。SusF-ARHGEF2轴代表了阻断KRAS突变型CRC进展的潜在治疗靶点。

研究结论部分翻译如下：综上所述，本研究证明突变KRAS促进结肠黏膜微生物失调，且KRAS突变富集的B. acidifaciens是一种以依赖突变KRAS方式促进CRC的KRAS突变特异性致癌细菌。B. acidifaciens表面黏附素SusF与KRAS突变型CRC表达的ARHGEF2结合，导致宿主致癌KRAS-RAF-MAPK信号异常激活，特异性驱动KRAS突变型CRC发展。最后，KRAS突变型CRC中B. acidifaciens的高丰度可能是预测不良疾病预后的因子。本研究结果提示了靶向B. acidifaciens以减轻KRAS突变型CRC肿瘤发生的未来策略。