改造胰岛素信号肽以保护人胰腺β细胞免受自身免疫破坏

《Cell Reports》：Engineering the insulin signal peptide to protect human pancreatic beta cells from autoimmune destruction

　　

在1型糖尿病（T1D）中，破坏β细胞的自身反应性T细胞主要靶向胰岛素信号肽片段。HLA敲除β细胞曾被提出用于产生低免疫细胞，但该策略具有显著的致瘤风险。研究人员另辟蹊径，假设修饰胰岛素信号肽可产生既能逃避免疫识别又能维持胰岛素功能的β细胞。研究人员建立了缺乏内源性胰岛素（insulin, INS）的人β细胞系，并用来自不同激素（包括嗜铬粒蛋白A（chromogranin-A, CHGA））的信号肽所携带的胰岛素进行互补。研究人员评估了胰岛素的合成、加工、分泌、活性及免疫逃逸能力。嗜铬粒蛋白A信号肽替换能够指导胰岛素的表达、成熟和分泌，维持生理性的胰岛素原/胰岛素（proinsulin/insulin, PI/INS）比例。分泌的胰岛素保持功能活性。关键的是，表达带有嗜铬粒蛋白A信号肽的胰岛素的β细胞能够逃避免自身反应性T细胞的识别和杀伤，且不诱导内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激，也不损害细胞身份。该方法可能为系统性免疫抑制提供一种靶向替代方案，可用于通过工程化内源性胰岛素信号肽的干细胞衍生疗法。

1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）中，胰腺β细胞被自身反应性CD8⁺ T细胞破坏，这些T细胞识别HLA I类分子（HLA class I, HLA-I）呈递的β细胞特异性抗原，其中胰岛素（insulin, INS）信号肽（signal peptide, SP）来源的片段是主要的免疫原。现有干细胞衍生β细胞替代疗法面临免疫排斥，需系统性免疫抑制；通过敲除HLA产生低免疫细胞虽可隐身，但存在残留未分化细胞致瘤风险。因此，研究人员提出在不消除免疫监视的前提下，通过修饰INS信号肽（SP_INS）来逃避免疫识别，同时保留胰岛素功能。

研究人员利用CRISPR-Cas9技术删除了人β细胞系ECN90和EndoC-BH1的内源INS启动子及5′编码区，构建INS敲除（INS-KO）模型。随后构建了不同信号肽替换的INS嵌合体，包括嗜铬粒蛋白A（chromogranin-A, CHGA）、胰高血糖素（glucagon, GCG）、三重突变SP（SP_MUT）及远缘鱼类（barfin flounder）信号肽（SP_Xeno），并以慢病毒载体转导INS-KO细胞。通过ELISA、Western blot、流式细胞术、免疫荧光、RT-qPCR、RNA-seq、Incucyte活细胞成像杀伤实验等手段，系统评估了信号肽替换对INS表达、加工、分泌、功能及免疫逃逸的影响。

主要技术方法包括：CRISPR-Cas9介导的INS基因敲除与单细胞克隆；慢病毒载体介导的信号肽-INS嵌合体表达；ELISA检测INS和胰岛素原（proinsulin, PI）分泌及含量；Western blot检测AKT磷酸化评估INS受体激活；流式细胞术检测Jurkat报告T细胞NFAT-GFP激活；RT-qPCR检测β细胞身份基因和ER应激基因；RNA-seq分析转录组；3D球体与原代CD8⁺ T细胞共培养杀伤实验（Incucyte活细胞成像）。细胞模型包括人β细胞系ECN90、EndoC-BH1、EndoC-BH1-A2（均来自Scharfmann实验室），HepG2肝癌细胞系，Jurkat报告细胞（表达PPI_15-24反应性TCR 1E6），以及经1E6 TCR慢病毒转导的原代CD8⁺ T细胞。

**INS-KO β细胞模型的生成与验证**：通过CRISPR-Cas9编辑ECN90细胞，筛选出纯合双等位基因KO克隆。这些克隆在mRNA和蛋白水平完全丧失INS表达，不能激活PPI_15-24反应性TCR Jurkat报告细胞。RNA-seq显示除INS外转录组改变有限，但PCSK1、GAD2、SCD5、MAFA下调，PCSK2、UCN3上调。

**信号肽修饰不干扰INS表达**：将不同SP构建体转染INS-KO ECN90细胞，免疫染色和流式细胞术显示SP_CHGA-INS表达最高，SP_INS次之，SP_MUT、SP_GCG和SP_Xeno也支持表达，但水平较低；SignalP 6.0预测各SP与INS片段交界处可有效切割。这说明SP替换不影响INS合成。

**SP_CHGA和SP_MUT INS具有功能**：在INS-KO EndoC-BH1细胞中稳定表达后，SP_CHGA-INS的mRNA水平最高，蛋白水平与SP_INS相当；PI/INS比例与SP_INS相似，而SP_MUT较高，提示SP_MUT加工受损。葡萄糖和KCl刺激可诱导INS分泌，且INS与CHGA在颗粒中共定位，表明INS被正确储存于分泌颗粒。分泌的INS能诱导HepG2细胞AKT磷酸化，证明INS具有功能活性。

**SP_CHGA或SP_MUT不改变β细胞身份，也不诱导ER应激**：RT-PCR检测显示PDX1、NKX6.1、PCSK1、SLC30A8等β细胞身份基因表达无变化；ER应激基因CHOP、BIP、s-XBP1基础表达也无差异，排除错误折叠造成的应激。

**SP_CHGA-INS具有免疫逃逸并保护β细胞**：与PPI_15-24反应性Jurkat报告T细胞共培养时，SP_CHGA-INS细胞不激活T细胞，SP_MUT部分激活，SP_INS完全激活。在3D球体杀伤实验中，SP_CHGA-INS和INS-KO球体在细胞毒性CD8⁺ T细胞存在下存活，而WT和SP_INS球体被破坏。共培养后炎症因子（CXCL10、IRF1、STAT1、CD274、NLRC5）在SP_CHGA-INS中无明显上调。

讨论部分指出，SP_INS片段（如PPI_15-24）是T1D中HLA-I呈递的优势表位，通过替换为CHGA信号肽可以避免该抗原表位的呈递，同时保留β细胞的免疫检查点，避免HLA-KO带来的肿瘤风险。CHGA在多种非靶向细胞中表达，提示其免疫原性较低。该策略需进一步在体内模型中验证其对多克隆自身免疫T细胞库的保护效果。研究结论：研究人员证明人β细胞可以工程化高效产生由含有SP_CHGA的PPI衍生的功能性胰岛素，从而逃避PPI_15-24识别CD8⁺ T细胞的破坏。该研究发表在《Cell Reports》，为自体干细胞衍生β细胞移植中的自身免疫复发提供了一种靶向抗原工程策略。