《Biology》：Mechanism of Action of Hedyotis diffusa Extract in a Rat Model of Acute Lung Injury Based on Transcriptomic Analysis
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目的：本研究建立脂多糖（LPS）诱导的大鼠急性肺损伤（ALI）模型，评估白花蛇舌草水提物（HDWE）干预后的病理损伤、胶原沉积、炎性细胞因子水平及关键基因/蛋白表达。联合超高效液相色谱-四极杆Orbitrap高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRM
目的：本研究建立脂多糖（LPS）诱导的大鼠急性肺损伤（ALI）模型，评估白花蛇舌草水提物（HDWE）干预后的病理损伤、胶原沉积、炎性细胞因子水平及关键基因/蛋白表达。联合超高效液相色谱-四极杆Orbitrap高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）、转录组学与分子模拟，鉴定HDWE生物活性成分，评价其与ALI相关靶点的潜在相互作用，探索HDWE基于多组学的保护机制。方法：36只Sprague–Dawley（SD）大鼠随机分为对照组、ALI组、地塞米松（DXMS）组、HDWE低剂量组（100 mg/kg）、中剂量组（200 mg/kg）和高剂量组（300 mg/kg）。采用苏木精-伊红（H&E）和Masson三色染色评价肺病理与胶原沉积；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-10；转录组学筛选差异表达基因（DEGs）并行基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、受试者工作特征（ROC）及免疫浸润分析；定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测SPHK1、RELA、NFKBIA mRNA；免疫组化评价EDN1、SPHK1、ICAM1、IL-17、PTGS2/COX-2、NF-κB p65（RELA编码）、WTAP、MPO八项枢纽靶点；UHPLC-Q-Orbitrap HRMS表征成分；分子对接分析22个化合物与8个枢纽靶点的结合亲和力，并对5个核心靶点行100 ns分子动力学模拟与分子力学-泊松玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）结合自由能计算。结果：与对照组比，ALI组TNF-α、IL-1β、IL-6分别升高86%、107%、66%，IL-10降低43%，肺胶原沉积增加300%；各剂量HDWE均缓解炎症，中剂量最优（IL-10升52%，IL-6、TNF-α、IL-1β分别降18%、22%、11%）。转录组学鉴定对照组vs ALI组2512个DEGs，ALI组vs HDWE-M组832个特异DEGs，876个重叠DEGs富集于TNF、IL-17、NF-κB通路；八枢纽基因诊断模型AUC=0.969；RELA、SPHK1等与Th1/Th17/中性粒细胞浸润正相关。ALI组SPHK1、RELA、NFKBIA mRNA分别为对照1.30、0.96、0.71倍；HDWE高、低剂量使SPHK1降至0.62、0.57倍，NFKBIA升至1.68、1.58倍，高剂量RELA降至0.43倍。炎性蛋白在ALI组升高、HDWE处理后降低。鉴定22个HDWE成分，16个符合对接标准；鸡屎藤酸（asperulosidic acid）与全部8靶点结合良好，对MPO、IL-17、NF-κB p65、PTGS2/COX-2、SPHK1结合自由能为?14.74、?14.92、?17.58、?23.04、?16.10 kcal/mol。结论：HDWE通过上调NFKBIA、下调SPHK1、RELA及多种炎性蛋白，调控IL-17/NF-κB相关炎症网络发挥LPS-ALI保护作用；asperulosidic acid可能为关键多靶点活性成分。研究受限于LPS单模型且无基因敲除/抑制剂验证，需进一步功能实验确认。
研究背景与立项依据
急性肺损伤（ALI）以肺泡上皮与肺微血管内皮屏障破坏、血管通透性增加、炎性细胞浸润及弥漫性肺水肿为核心特征，持续恶化可发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），临床死亡率高。当前治疗以支持对症为主，缺乏同时靶向炎症级联与内皮屏障的特异性药物。天然植物提取物因多靶点调节与安全性优势成为ALI防治研究热点。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）为茜草科传统中药，富含环烯醚萜苷与黄酮类（如asperulosidic acid、asperuloside、luteolin、quercetin），已有表型研究提示其抗炎、抗氧化及减轻LPS肺损伤潜力，但缺乏转录组水平的机制解析与分子靶点验证。为此，研究人员建立LPS诱导SD大鼠ALI模型，整合体内药效、转录组学、UHPLC-Q-Orbitrap HRMS成分鉴定、分子对接与动力学模拟，系统阐释HDWE保护机制，论文发表于《Biology》。
主要关键技术方法
研究人员选用36只SPF级SD大鼠（雌雄各半，200±20 g）分为6组（对照、ALI、DXMS、HDWE-L/M/H），LPS（5 mg/kg）腹腔注射造模、给药7天取肺与血清；转录组学取对照、ALI、HDWE-M三组各4只肺组织行Illumina NovaSeq测序与DESeq2分析（FDR<0.05，|log2FC|≥1）；联合GEO数据集（GSE3077、GSE40885、GSE5272）行枢纽基因ROC与外周免疫浸润分析；靶蛋白晶体结构取自PDB，用SYBYL行分子对接（T_Score>5为阈值），对5个复合物行GROMACS 100 ns分子动力学与MM/PBSA自由能计算；实验验证辅以H&E/Masson染色、ELISA、qRT-PCR、免疫组化。
研究结果
3.1 肺组织大体观察、病理与纤维化染色：ALI组肺充血、出血、肺泡隔增厚；HDWE各剂量减轻病理损伤，Masson显示胶原阳性面积比ALI组约为对照4倍，HDWE-M降低64.59%。
3.2 血清炎性细胞因子变化：ALI组TNF-α、IL-1β、IL-6升、IL-10降；HDWE-M最优，IL-10升约54%，前三者分别降18%、22%、11%。
3.3 转录组学分析：PCA组间分离清晰；对照vs ALI获2512 DEGs，ALI vs HDWE-M获832特异DEGs，876重叠DEGs；KEGG富集于TNF、IL-17、NF-κB通路，涉及RELA、SPHK1、IL17A、ICAM1、EDN1、PTGS2。
3.4 枢纽基因ROC与免疫浸润：八基因（EDN1、SPHK1、ICAM1、RELA、WTAP、PTGS2、IL17A、NFKBIA）联合诊断模型AUC=0.969；RELA、SPHK1、IL17A、ICAM1、EDN1、PTGS2与Th1/Th17/中性粒细胞浸润显著正相关，与中枢记忆CD8+ T细胞负相关。
3.5 免疫组化评价中性粒细胞浸润与核心蛋白：ALI组MPO阳性（中性粒细胞标记）及EDN1、WTAP、IL-17、PTGS2/COX-2、ICAM1、NF-κB p65蛋白表达升高；HDWE-M/H与DXMS显著下调。
3.6 HDWE化学成分分析：UHPLC-Q-Orbitrap HRMS从104个检出物中筛得22个重叠活性成分（环烯醚萜苷为主）。
3.7 分子对接：16/22化合物达对接阈值；asperulosidic acid与全部8靶点形成氢键（Asn/Glu/Thr/Arg/Gly）与疏水接触（Leu/Val/Trp/Phe）。
3.8 分子动力学与MM/PBSA：MPO、IL-17、NF-κB p65、PTGS2/COX-2、SPHK1五复合物100 ns内RMSD稳定（0.14–0.24 nm）；结合自由能分别为?14.74、?14.92、?17.58、?23.04、?16.10 kcal/mol。
3.9 qRT-PCR：ALI组SPHK1 1.30倍、RELA 0.96倍、NFKBIA 0.71倍；HDWE-H使SPHK1 0.62倍、RELA 0.43倍、NFKBIA 1.68倍；HDWE-L使SPHK1 0.57倍、NFKBIA 1.58倍。
讨论部分总结
研究人员指出，环烯醚萜苷可通过抑制NF-κB/MAPK、下调PTGS2与ICAM1减轻巨噬与内皮炎症，与本研转录组富集趋势一致。HDWE可能通过打断IL-17/NF-κB正反馈、上调NFKBIA（编码IκBα，抑RELA核转位）、下调SPHK1（鞘脂代谢关联炎症）、抑制Th17/中性粒浸润发挥保护；asperulosidic acid为多靶点候选物。局限：无基因敲除/抑制剂验证、单LPS模型、未测PaO2/FiO2与肺顺应性、转录组样本量小、缺Western blot定量。未来需用药理抑制/基因编辑验SPHK1与NFKBIA、纯化单体、用ECIS/TER评屏障、扩至多病因ALI模型。
结论部分翻译
本研究通过药效学、转录组学、液质联用与分子模拟，证实HDWE减轻LPS-ALI大鼠肺损伤、胶原沉积与中性粒浸润，调节炎性因子；DEGs富集于NF-κB/IL-17/TNF通路；HDWE上调NFKBIA、下调SPHK1，提示调控IL-17/NF-κB炎症应答；八枢纽基因诊断AUC=0.969；22个成分中asperulosidic acid经对接/动力学/MM-PBSA证实用多靶点结合潜力，或为HDWE关键活性物。受限于无遗传功能验证、单体ADME评价缺失及单LPS模型，结果为后续单体与机制研究提供基础。
