苜蓿中AP2/ERF家族的全基因组鉴定及其与干旱胁迫下抗氧化调控的关联

《Agronomy》：Genome-Wide Identification of the AP2/ERF Family in Alfalfa and Its Association with Antioxidant Regulation Under Drought Stress

　　

在本研究中，研究人员以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为实验材料，对其基因组中的AP2/ERF转录因子家族成员进行了系统鉴定，并阐明该家族在干旱胁迫下的响应模式及潜在调控网络。共鉴定到756个AP2/ERF基因，并将其划分为4个亚家族：AP2、ERF、DREB和RAV，其中DREB和ERF亚家族表现出显著扩张。进化分析表明，全基因组复制（WGD）/片段重复是该家族扩张的主要驱动力。在梯度干旱处理下，多个AP2/ERF基因显著上调，其中MsERF210的表达随干旱强度增加而持续升高。加权基因共表达网络分析（WGCNA）显示，MsERF210与“谷胱甘肽代谢”、“过氧化物酶体”和“抗坏血酸和醛酸代谢”等抗氧化相关模块高度正相关。进一步分析表明，多个抗氧化基因（如超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽硫转移酶GST、乙醛脱氢酶ALDH和异柠檬酸脱氢酶IDH）在干旱胁迫下显著上调，其启动子区域被预测可被MsERF210结合。生理指标测定表明，干旱胁迫导致H₂O₂和丙二醛（MDA）积累增加，抗坏血酸（AsA）、脱氢抗坏血酸（DHA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量升高，而SOD活性先升高后降低。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证了关键基因的表达趋势，证实了转录组数据的可靠性。综上所述，本研究揭示了紫花苜蓿AP2/ERF家族的进化特征，并鉴定出MsERF210可能通过调控抗氧化防御系统和氧化还原稳态来增强紫花苜蓿对干旱胁迫的适应性。这些发现为培育耐旱紫花苜蓿新品种提供了重要的候选基因资源和理论基础。

干旱胁迫是限制作物生长、发育和产量形成的严重非生物胁迫之一，对农业生产和生态系统稳定构成威胁。植物因固着生长无法逃避干旱，长期进化中形成了包含胁迫信号感知、激素信号转导、转录调控、渗透调节和抗氧化防御在内的复杂调控网络。转录因子（transcription factor, TF）可识别并结合下游靶基因启动子区的特定顺式作用元件，从而调控大量胁迫响应基因的表达，在植物适应干旱中发挥核心作用。AP2/ERF（APETALA2/乙烯响应因子）超家族是植物特有且普遍存在的一类转录因子，参与调控激素信号、渗透物质合成、活性氧（reactive oxygen species, ROS）清除等干旱响应过程。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是重要多年生豆科牧草，但此前其AP2/ERF家族鉴定数量有限、分类和命名标准不一，且该家族是否通过调控抗氧化相关基因模块参与ROS清除和氧化还原稳态维持仍不清楚。为此，研究人员以新疆大叶苜蓿（‘Xinjiang Daye’）为实验材料，系统鉴定了其基因组中的AP2/ERF家族，结合梯度干旱转录组筛选候选基因，通过共表达网络、生理生化测定及qRT-PCR验证揭示了该家族与抗氧化调控的关联。研究鉴定到756个AP2/ERF成员，并发现MsERF210可能通过调控抗氧化防御系统和氧化还原稳态增强紫花苜蓿耐旱性，为培育耐旱新品种提供了候选基因资源和理论基础。该论文发表于《Agronomy》。

在方法上，研究人员使用了来自FigShare数据库的紫花苜蓿基因组和注释文件，以及TAIR和Ensembl Plants数据库的拟南芥和蒺藜苜蓿基因组数据。转录组数据来自课题组前期实验，设四个土壤水分梯度：充足供水（80–85%田间持水量，CK）、轻度干旱（60–65%，D1）、中度干旱（40–45%，D2）和重度干旱（20–25%，D3），每处理6盆，干旱第14天取叶片用于生理指标测定和qRT-PCR验证。主要技术方法包括：用Blastp和Hmmsearch（Pfam PF00847）进行序列搜索，并通过NCBI-CDD和InterPro验证结构域，鉴定AP2/ERF成员；用MAFFT比对和IQ-TREE构建最大似然系统发育树；用TBtools和MCScanX进行共线性和复制类型分析；用FIMO扫描全基因组启动子区转录因子结合位点，并用KofamScan进行KEGG功能注释；用DESeq2鉴定差异表达基因，用WGCNA构建共表达网络；通过qRT-PCR验证关键基因表达；生理指标测定包括MDA、AsA/DHA、GSH/GSSG、SOD活性、H₂O₂和超氧阴离子（O₂^?）含量。

研究结果如下：

3.1 系统发育分析：通过多序列比对和系统发育树构建，研究人员在紫花苜蓿基因组中鉴定到756个AP2/ERF基因。系统发育树显示它们聚成AP2、ERF A、ERF B、ERF C和RAV五个分支；进一步利用MsERF与MtERF构建进化树，将这些成员最终划分为AP2（92个）、ERF（390个）、DREB（267个）和RAV（7个）四个亚家族，其中DREB和ERF亚家族显著扩张。

3.2 结构特征与理化性质分析：基因结构和蛋白结构域分析表明，所有成员均含有AP2结构域。RAV亚家族成员均含B3和AP2结构域，DREB成员仅含一个AP2结构域，部分ERF成员还含额外结构域。多数ERF和DREB成员为单外显子无内含子结构，AP2亚家族成员则普遍含多个外显子和内含子。多数预测蛋白为亲水性且不稳定，说明该家族在进化中产生了结构与功能多样性。

3.3 共线性关系和复制事件：通过四个单倍型基因组间的共线性分析，发现大量同源基因连接，并鉴定到82组四等位基因AP2/ERF；与蒺藜苜蓿的比较发现229个种间共线性