利用规模化磁力光谱技术与常规生物物理方法比较对SAM-I核糖开关配体结合的单分子水平解析

《RNA Biology》：Single-molecule insights into SAM-I riboswitch ligand binding using scaled magnetic force spectroscopy with comparison to conventional biophysical methods

　　

生物物理方法广泛用于药物发现，其中表面等离子共振（SPR）和等温滴定量热（ITC）是最常用的技术之一。然而，这类基于群体或整体的方法无法提供单分子分辨率或结构与机制层面的见解，因此研究人员不得不依赖一系列互补技术。本研究中，研究人员使用了一种可规模化磁力光谱（MFS）仪器系统，该系统能够并行分析数百个单分子并获取动态构象见解。以S-腺苷甲硫氨酸-I（SAM-I）核糖开关为模型系统，研究人员证明了MFS可结合已发表的晶体结构来表征RNA结构。随后，研究人员将MFS与SPR和ITC在测量两种亲和力差异显著的配体（SAM和SAH）在高、低镁离子浓度下的结合亲和力时的表现进行了比较。MFS给出的结合亲和力与SPR和ITC相近，但与ITC更为一致。研究人员进一步展示了MFS在研究SAM-I分子动力学以及SAM和S-腺苷高半胱氨酸（SAH）结合机制方面的强大能力。通过将RNA长时间置于恒定力下，研究人员观察到SAM和SAH结合对SAM-I构象动力学的影响不同，表明这两种配体具有不同的稳定化机制。

**核糖开关配体结合的单分子研究：规模化磁力光谱与常规方法的比较**

核糖开关（riboswitch）是一类位于细菌信使RNA 5′非翻译区的结构化非编码RNA元件，可直接感应特定小分子或离子并发生构象变化，从而调控下游基因表达。随着抗生素耐药性和多重耐药问题的加剧，核糖开关被视为新型抗菌药物靶点。SAM-I核糖开关属于其中重要家族，通过负反馈机制调控甲硫氨酸相关基因表达。其适配体结构包含P1–P4四个螺旋及连接区，在镁离子（Mg²⁺）参与下可形成配体结合口袋。然而，常规生物物理方法如表面等离子共振（SPR）和等温滴定量热（ITC）属于批量方法，无法提供单分子分辨率和构象动态信息，因此需要具有高时空分辨率的技术手段。本研究旨在利用可并行分析数百个单分子的规模化磁力光谱（MFS）平台，结合已发表的晶体结构，深入解析SAM-I核糖开关与配体结合的过程和机制，并与SPR、ITC进行系统比较，评估其在RNA药物发现中的应用价值。该研究论文发表于《RNA Biology》。

研究人员使用的主要技术方法包括：MFS、SPR和ITC。RNA样品序列来源于枯草芽孢杆菌yitJ SAM-I核糖开关，包含天然型和稳定型两种适配体。MFS通过将RNA连接于表面和磁珠之间，施加可控磁力并记录磁珠垂直位置，采用力斜坡、阶跃力和恒定力三种模式获取单分子动力学数据，并以隐马尔可夫模型（HMM）进行状态分析。ITC和SPR分别用于检测结合热变化和结合响应，作为对照方法。

**SAM-I RNA动力学研究**：通过MFS力斜坡实验发现，天然型适配体通常在一步内解折叠，而在1 mM Mg²⁺下有时无法正确重新折叠；稳定型适配体则表现为两步解折叠且每轮力循环后均能重新折叠。解折叠尺寸分布显示明显的结构异质性，最常见事件对应P2/P3茎的展开。高Mg²⁺浓度稳定了整个RNA结构，但对P2/P3茎的稳定作用强于P1/P4茎。

**利用MFS估算配体结合亲和力**：力斜坡实验显示，SAM配体结合使解折叠力浓度依赖性升高，并诱导出现与P1/P4茎展开相关的新解折叠事件。拟合得到SAM对天然型适配体在1 mM和10 mM Mg²⁺下的解离常数（K_d）分别约为100 nM和90 nM；对稳定型适配体则分别约为0.54 μM和0.054 μM。弱结合配体S-腺苷高半胱氨酸（SAH）在低镁时无明显效应，但在10 mM Mg²⁺下与天然型和稳定型结合，K_d分别约为15.4 μM和0.83 μM；非结合对照Ribocil-C无影响。

**使用SPR和ITC比较结合亲和力**：在1 mM Mg²⁺下，SPR和ITC均检测到SAM的高亲和结合，K_d值与MFS处于同一纳摩尔范围。MFS所得K_d与ITC更接近，而SPR值偏低约3–6倍。在10 mM Mg²⁺下，SPR因高镁条件失效，而ITC测得SAM对天然型适配体的K_d约7.3 nM，与文献报道一致。ITC同样检测到SAH在高镁下的弱结合，与MFS结果相互印证。

**SAM结合对SAM-I构象动力学的影响**：阶跃力实验显示天然SAM-I适配体存在两个连续转变，分别对应P1/P4和P2/P3的逐级解折叠。SAM配体显著稳定低力转变（P1/P4）。恒定力实验进一步表明，SAM诱导出现长寿命折叠态，其寿命随SAM浓度增加而延长，而短寿命折叠态和部分解折叠态寿命基本不变；高Mg²⁺浓度增强了这一效应。

**MFS结果提示SAH通过替代机制稳定SAM-I适配体**：SAH在阶跃力实验中同样稳定低力转变，但不产生SAM那样的长寿命稳定折叠态。恒定力实验显示，SAH使折叠态寿命连续增加，且寿命显著短于SAM诱导的折叠态，提示SAH与SAM通过不同的构象机制稳定RNA结构。高Mg²⁺是SAH产生可检测稳定作用的必要条件。

讨论部分指出，三种方法测得的SAM结合K_d