巴塔哥尼亚产Torulaspora delbrueckii菌株的表型多样性及其在苹果酒酿造中的发酵潜力

《Fermentation》：Phenotypic Diversity and Fermentative Potential of Patagonian Torulaspora delbrueckii Strains for Cider Production

　　

Torulaspora delbrueckii（T. delbrueckii）是一种颇具前景的非酿酒酵母（non-Saccharomyces），可用于饮料多样化，但其在苹果酒生产中的多样性与应用仍鲜有探索。本研究对采自葡萄酒与苹果酒相关环境的巴塔哥尼亚T. delbrueckii分离株进行了表征，并评估了其在苹果汁（apple must）中的发酵潜力。线粒体DNA限制性片段长度多态性（mtDNA-RFLP）分析显示，线粒体谱型随分离来源不同而存在差异；生理表征揭示不同来源分离株在温度、亚硫酸盐及乙醇响应上存在差异。与葡萄酒分离株相比，苹果酒分离株普遍表现出更高的高温耐受性、较低的亚硫酸盐耐受性，以及在乙醇胁迫下更短的滞后期。11株代表性菌株完成了苹果汁微发酵。与商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）菌株相比，T. delbrueckii产生了更高浓度的甘油和赤藓糖醇，同时达到相当或更高的乙醇水平。两株对比鲜明的菌株进一步在与S. cerevisiae的顺序混合发酵中受评。NPCC1340增强了甘油和赤藓糖醇生成，而NPCC1608提高了苹果酸和琥珀酸含量，同时保持低乙酸水平。在混合发酵中，苹果酒保留了各T. delbrueckii菌株的特征代谢谱，而S. cerevisiae改善了发酵性能，产生居中的发酵动力学。这些发现揭示了巴塔哥尼亚T. delbrueckii菌株间的表型多样性，并提示与其分离来源相关的差异，凸显了其作为发酵剂（starter cultures）生产具有独特化学特性苹果酒的潜力。

研究背景方面，非酿酒酵母因代谢多样性能重塑饮料香气、酸度与口感，常与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）顺序或同时接种以兼顾特色与发酵完成度。阿根廷北巴塔哥尼亚占全国苹果酒产量约70%–75%，传统依赖甜点苹果与葡萄酒商业发酵剂，产品差异化有限。先前区域生物勘探多聚焦酿酒酵母属，偶有扩展至Pichia kudriavzevii等非酿酒酵母，但Torulaspora delbrueckii（T. delbrueckii）这一在葡萄酒中成熟应用、可降挥发酸并增甘油与甘露蛋白的物种，在苹果酒中的多样性与菌株级潜力仍不清楚，且生态来源是否关联技术表型存疑。为此，研究人员从北巴塔哥尼亚葡萄酒与苹果酒环境分离21株T. delbrueckii，整合遗传、生理、纯种与顺序混合发酵评价，探究种内多样性及苹果酒适配性。

主要关键技术方法包括：样本队列来源于阿根廷里奥内格罗省葡萄酒厂与苹果酒厂周边约50 km范围，含15株葡萄酒相关（葡萄表面、发酵葡萄汁）与6株苹果酒相关（发酵苹果/梨汁、果面）环境分离株，保存于北巴塔哥尼亚培养物保藏中心（NPCC）；遗传多样性采用线粒体DNA限制性片段长度多态性（mtDNA-RFLP，HinfI酶切）分析；表型表征涵盖8、13、25、35、37 °C斑点生长、亚硫酸氢钠梯度耐受、3%–10%（v/v）乙醇胁迫下96孔板光密度（OD₆₃₀）生长动力学（修正Gompertz模型拟合）；发酵评价包括12.5 °Brix Granny Smith苹果汁纯种微发酵（20 °C，监测°Brix与CO₂失重）及顺序混合发酵（T. delbrueckii先接1×10⁶ cells mL^?1，48 h后同浓度接商业S. cerevisiae），高效液相色谱（HPLC）定量乙醇、甘油、赤藓糖醇、有机酸等，WL培养基区分活菌并mtDNA-RFLP确证，主成分分析（PCA）与单因素方差分析（ANOVA）处理数据。

研究结果部分，3.1节种内表征中mtDNA-RFLP获6种谱型（A–F），葡萄酒株涵盖A–E五型且小谱型B–E特异关联酒罐面、红葡萄面、马尔贝克发酵汁等，苹果酒株几乎全为F型（仅Perry株NPCC1845为A型），表明葡萄酒线系保留更多祖先线粒体多样性。3.2节表型表征中，温度上所有株25 °C最佳、8与37 °C不生长，热耐受指数（TTI=35 °C分?13 °C分）显示苹果酒F型多偏高温、葡萄酒A型多偏低温，NPCC1340（红葡萄面C型）最耐冷；亚硫酸盐耐受指数（STI）显示苹果酒株均仅耐≤1 mM Na₂S₂O₅，葡萄酒株可达4 mM且B/C型最高，证实来源关联强于线粒体型；乙醇胁迫下相对最大比生长率（μ_max）与滞后期（λ）解耦，NPCC1342耐乙醇速率最优但滞后期长，F型苹果酒株λ普遍短。3.3节苹果汁微发酵中11株均19天内完成、残糖<2 g/L，乙醇5.42%–5.90%（v/v）无来源差异；苹果酒株CO₂滞后（11.4–16.8 h）显著短于葡萄酒株（13.8–27.2 h）；所有T. delbrueckii株甘油、赤藓糖醇、苹果酸均显著高于商业S. cerevisiae，NPCC1340赤藓糖醇最高，NPCC1608苹果酸与NPCC1341并列最高且乙酸极低。3.4节选NPCC1340（葡萄酒C型、耐冷耐硫、高赤藓糖醇）与NPCC1608（苹果酒F型、耐冷、短滞后、高苹果酸低乙酸）作互补组合，无杀伤活性利于混菌兼容。3.5节顺序混合发酵中T. delbrueckii全程占活菌约90%、S. cerevisiae约10%，未反超；NPCC1608混菌苹果酸、琥珀酸最高且乙酸最低，NPCC1340混菌赤藓糖醇最高、甘油较纯S. cerevisiae高约50%；PCA显示混菌化学轮廓贴近对应纯T. delbrueckii株但动力学被S. cerevisiae改善，证明非酿酒酵母代谢印记不被掩盖。

讨论部分总结指出，葡萄酒株线粒体多样性高反映葡萄/葡萄酒线系弱专业化保留祖先多样，苹果酒群是否分化种群尚不确定；表型与线粒体型非严格对应，温度偏倚可能源于与共生酿酒酵母属（S. uvarum偏冷、S. cerevisiae偏热）的生态位划分；亚硫酸盐耐受呈最清晰来源关联，暗示葡萄酒实践趋同选择；乙醇下μ_max与λ独立，葡萄酒株关联适应后速率、苹果酒株关联快速进入生长。发酵化学中多元醇为种级稳健贡献，但甘油量与有机酸谱需菌株级筛选，低挥发酸非T. delbrueckii固有属性。顺序接种致T. delbrueckii优先效应持续主导，混菌苹果酒保留菌株特征而非趋同，印证苹果酒酸化方向异于Pichia混菌。结论部分译为：巴塔哥尼亚T. delbrueckii分离株展现显著种内遗传与表型多样性，来源关联亚硫酸盐耐受、适应行为与部分温度响应，但整体发酵力与代谢物浓度以菌株级变异为主；所有T. delbrueckii株在苹果汁中产更多甘油、赤藓糖醇与苹果酸，顺序混菌中S. cerevisiae改善动力学而NPCC1340与NPCC1608保留特异代谢印记且T. delbrueckii数量主导；两株可作区域发酵剂候选以生产差异化巴塔哥尼亚苹果酒，中试与感官验证待行。论文发表于《Fermentation》。