《Cell Stem Cell》：Endothelialized callus organoids drive rapid regeneration of critical-size segmental long bone defects
编辑推荐：
大块骨缺损仍是重大临床挑战，因为现有治疗方法无法有效再生缺损并恢复功能。为重现早期骨折骨痂的细胞复杂性，研究人员通过将骨膜来源的骨骼祖细胞与内皮细胞共培养，构建了人内皮化骨痂类器官（human endothelialized callus organoids,
大块骨缺损仍是重大临床挑战，因为现有治疗方法无法有效再生缺损并恢复功能。为重现早期骨折骨痂的细胞复杂性，研究人员通过将骨膜来源的骨骼祖细胞与内皮细胞共培养，构建了人内皮化骨痂类器官（human endothelialized callus organoids, hECOs）。该共培养引发细胞自组装，形成具有空间组织的类骨痂结构。内皮细胞促进骨骼祖细胞扩增、细胞外基质成熟以及向肥大软骨进展，这些是软骨内成骨（endochondral ossification）的标志性特征。多组学分析鉴定了内皮细胞介导的与骨骼成熟、基质重塑和血管生成相关的再生程序激活。经短暂体外分化后，hECOs的宏观尺度聚集体支持免疫缺陷小鼠临界尺寸胫骨缺损的快速宿主血管化和再生。供体来源细胞积极参与早期再生，但在重塑过程中逐渐被替换，这与hECOs作为引导宿主介导骨再生的瞬时生物模板一致。
大块骨缺损是临床重大挑战。临界尺寸缺损通常由高能量创伤或肿瘤切除引起，定义为节段性骨干间隙≥2 cm或>50%骨直径，且9-12个月不愈合。全球不愈合发生率为1.9%–4.9%，每年至少330万新病例。现有治疗如自体骨移植、同种异体骨、牵张成骨和重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2, BMP-2）均存在供区并发症、整合不良或安全性问题。长骨缺损修复依赖于骨折骨痂的软骨内成骨（endochondral ossification），即形成软骨模板，随后血管化、矿化并重塑为成熟骨。骨膜中的骨骼祖细胞（如人骨膜来源细胞，human periosteum-derived cells, hPDCs）是骨痂形成的关键，而内皮细胞（endothelial cells, ECs）通过细胞间通讯协调这一过程。为重现这种细胞复杂性，研究人员构建了人内皮化骨痂类器官（human endothelialized callus organoids, hECOs），将hPDCs与ECs共培养，并系统评估其体外分化机制和体内再生能力。该研究发表在《Cell Stem Cell》。
研究人员将hPDCs与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）或人真皮微血管内皮细胞（human dermal microvascular endothelial cells, MVECs）按25%或50%比例共培养，在AggreWell微孔板中自组装形成类器官，分化7或14天。采用组织学染色、免疫荧光、活/死染色、RT-qPCR、单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）、Vizgen MERSCOPE空间转录组学、蛋白质组学和分泌组学分析。体内实验包括皮下异位植入和5 mm临界尺寸胫骨缺损原位模型。hPDCs来自6名健康供体（5女1男，年龄20–32岁）；HUVECs和MVECs购自Lonza。
**内皮化骨痂类器官加速软骨分化**。通过组织学染色和RT-qPCR，研究人员发现hECOs较对照hCOs更早表达肥大软骨标志物COL10A1和IHH，且成骨标志物SP7下调，表明ECs将分化轨迹转向软骨内成骨而非直接成骨途径。
**hECs促进类器官内ECM重塑**。三维成像显示ECs在分化第3天起自组织至类器官核心并形成血管样网络，周围为致密胶原基质。增殖细胞（Ki67+）数量增加且主要分布于外周，但仅存在于hPDCs中；ECs在早期发生时间依赖性凋亡。内皮化类器官的胶原纤维增厚，胶原I和II沉积增加，表明ECM结构发生定性重塑。
**snRNA-seq和空间转录组揭示软骨细胞亚群及层级互作**。无监督聚类和基因本体分析鉴定出软骨祖细胞（cartilage progenitor cells, CPCs）、两类效应软骨细胞（EffCs-Cho和EffCs-Oss）、前肥大和肥大软骨细胞（pre-HTCs和HTCs）以及五个调控软骨细胞群体（RegCs）。将类器官转录组映射到已发表的人类骨骼祖细胞图谱，发现与天然骨折骨痂的相似性达61%–65%。M50组在14天时呈现最成熟的肥大软骨表型，并高表达促存活基因BCL2和MCL1。细胞通讯分析揭示PERIOSTIN、THBS、NOTCH、PDGF、BMP、FGF等信号轴协调类器官发育。
**内皮化骨痂类器官聚集体加速异位骨形成**。将6天或13天分化类器官融合成宏观聚集体并皮下植入4周，7天分化的高内皮化组（H50和M50）即出现矿化组织，而对照组仅含纤维组织。14天分化的H50和M50聚集体形成具有皮质骨、小梁骨和骨髓腔的成熟骨，基质（纤维）面积<5%；对照组骨面积仅约5%，基质约25%。
**内皮化骨痂类器官聚集体加速宿主血管化**。免疫荧光和抗人线粒体染色显示，H50和M50组外植体血管数量和血管化面积显著增加（M50血管化面积5.1%±2.4%），且供体来源血管在4周时被宿主血管完全替代，表明快速血管重塑。
**内皮化骨痂类器官聚集体修复临界尺寸胫骨缺损**。在5 mm节段性缺损模型中，M50组在4周时3/4缺损完全桥接，8周时完全恢复皮质骨和骨髓结构，而对照组持续不愈合。组织学确认M50组骨缺损区域脂肪细胞密度接近天然骨髓。
**植入类器官聚集体在愈合过程中的时间重塑**。免疫荧光显示供体细胞比例从2周的30%–46%降至8周的0.04%–3.5%，主要下降发生在2至4周之间；胶原X阳性面积随血管化增加而减少，表明内皮化类器官作为瞬时模板引导宿主介导的骨再生。
**内皮化骨痂类器官具有独特发育轨迹和分泌组谱**。蛋白质组和分泌组学分析显示，M50组富集基底膜蛋白（COL4A1、COL4A2、NID2）和促血管生成及矿化相关蛋白（SPP1、PHOSPHO1、CLEC3A），而对照组保留较高COL3A1。STRING网络分析显示内皮化组激活THBS1/PTGS2为中心的协调网络，并增强LOX等ECM交联调节因子，促血管生成分泌谱增强。
讨论部分指出，hECs通过两种互补机制驱动再生：一是加速ECM成熟和骨软骨分化，二是增强促血管生成分泌谱，从而模拟骨折愈合中的血管-骨骼耦联。hECO聚集体作为外源性无支架自组装结构，作为瞬时发育模板引导宿主介导的骨修复，其制造时间与临床分期重建（如Masquelet技术）的间隔相匹配，具有转化潜力。研究结论为：内皮化骨痂类器官整合了内皮细胞和骨骼祖细胞，在发育启发的组织架构中促进协调的基质成熟、血管生成信号和宿主介导的临界尺寸骨缺损再生。该工作为利用内源性再生机制而非替代它们的发育模板工程提供了框架。局限性包括供体细胞随时间减少的机制未明、NOTCH和PDGF信号的具体作用待验证、植入物最大尺寸有限，以及仅在免疫缺陷小鼠模型中验证，未来需在免疫正常和大型动物模型中进一步评估。
