《Cell Stem Cell》：Epi-Allele elicits compensatory expression of the non-targeted allele and prevents haploinsufficiency in dominant genetic diseases
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表观遗传调控可能是发育和疾病发病机制中许多基因不对称等位基因表达的基础。等位基因特异性表观遗传修饰可为由杂合突变引起的显性遗传病提供有效治疗。研究人员开发了一种名为“Epi-Allele”的等位基因特异性表观遗传编辑方法，用于沉默致病等位基因，并意外发现非靶向
表观遗传调控可能是发育和疾病发病机制中许多基因不对称等位基因表达的基础。等位基因特异性表观遗传修饰可为由杂合突变引起的显性遗传病提供有效治疗。研究人员开发了一种名为“Epi-Allele”的等位基因特异性表观遗传编辑方法，用于沉默致病等位基因，并意外发现非靶向等位基因的表达出现升高，而总基因表达保持不变。全基因组筛选显示，这种补偿性等位基因表达是一种普遍现象，提示Epi-Allele方法可避免当前等位基因特异性沉默疗法所诱导的单倍剂量不足（haploinsufficiency）。这一概念通过分别对肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）小鼠模型和HCM患者iPSC来源心肌细胞中的Myh6和MYH7基因进行等位基因特异性表观遗传重塑，改善了心脏表型而得到验证。因此，Epi-Allele为治疗显性遗传病提供了一种无单倍剂量不足的等位基因特异性治疗策略。
**Epi-Allele：通过等位基因补偿性表达避免单倍剂量不足的显性遗传病表观遗传治疗策略**
**一、研究背景与科学问题**
显性遗传病多由杂合突变引起，患者体内同时存在致病等位基因和正常等位基因。选择性沉默致病等位基因是极具吸引力的治疗策略，但现有基于RNA干扰（RNA interference，RNAi）和成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR-Cas9）的等位基因特异性沉默方法虽然展现出治疗潜力，却普遍面临治疗性单倍剂量不足（haploinsufficiency）的风险——即正常等位基因的表达量不足以维持正常的生理功能，可能导致心脏衰竭等严重并发症。此外，针对不同致病突变需要设计不同的治疗策略，难以广泛覆盖携带不同突变的患者群体。因此，亟需开发一种既能高效沉默致病等位基因、又能维持总基因表达水平的新型治疗策略。
**二、研究内容与核心发现**
研究人员开发了一种名为“Epi-Allele”的等位基因特异性表观遗传编辑方法，利用无核酸酶活性的dCas9（dead Cas9）融合表观遗传效应器（如CRISPRoff），在含有非致病性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的等位基因特异性调控区域沉积抑制性DNA甲基化和组蛋白修饰，从而改变染色质状态并沉默致病等位基因。研究发现，Epi-Allele在沉默靶向等位基因的同时，意外地显著上调了非靶向等位基因的表达，使总基因表达水平保持不变，避免了单倍剂量不足。全基因组筛选表明这种补偿性等位基因表达是普遍现象，约53%的成功编辑基因表现出该特征。研究人员进一步在肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）小鼠模型和HCM患者诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-derived cardiomyocytes，iPSC-CMs）中验证了Epi-Allele的治疗效果，并在多组学水平评估了其安全性。该研究发表于《Cell Stem Cell》。
**三、主要技术方法**
研究采用了多种关键技术方法：基于报告细胞系筛选最优等位基因特异性单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）并优化表观遗传编辑器；构建C57BL/6J与DBA/2杂交F1小鼠及全基因组Perturb-seq（结合5′单细胞RNA测序的CRISPR筛选）筛选平台，使用包含1396条sgRNA的慢病毒文库；开发基于DNABERT-2和残差多层感知机（multi-layer perceptron，MLP）的深度学习预测模型；利用双腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）split-intein系统进行体内递送；整合全基因组重亚硫酸盐测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）、切割下靶标与标记（cleavage under targets and tagmentation，CUT&Tag）、染色质转座酶可及性测序（assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing，ATAC-seq）、染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）、单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）等多组学分析；并使用患者来源iPSC-CMs进行验证。样本来源包括C57BL/6J小鼠、DBA/2小鼠、二者杂交F1小鼠、Myh6 R403Q HCM小鼠模型、1例HCM患者尿液上皮细胞重编程的iPSCs及1例健康供体iPSC-CMs。
**四、研究结果**
**（一）等位基因特异性表观遗传沉默后非靶向等位基因的激活升高**
研究人员首先在Myh6基因上验证了Epi-Allele的效果。在C57或DBA/2小鼠来源的心肌细胞中，Epi-Allele仅降低C57等位基因的mRNA和蛋白表达，证实其具有严格的等位基因特异性。在杂合F1小鼠心肌细胞中，Epi-Allele使靶向的C57等位基因表达降低57%，同时使非靶向的DBA等位基因表达升高72%，等位基因比值从0.96变为4.0，但总的Myh6 mRNA和蛋白水平基本不变，这种效应可维持至少14天。比较不同表观遗传编辑器发现，组蛋白修饰主要贡献于初始沉默和补偿，而DNA甲基化可能主要起稳定编辑效果的作用。使用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和CRISPR-Cas9进行等位基因特异性沉默时，均未观察到非靶向等位基因的代偿性上调，表明该现象为表观遗传编辑所特有。在Mybpc3和Apoe基因上也观察到类似的补偿性等位基因表达，提示该现象具有普遍性。
**（二）全基因组筛选发现Epi-Allele诱导的补偿性等位基因表达**
研究人员利用C57/DBA杂合小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）进行全基因组等位基因特异性表观遗传扰动，结合5′单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。在108个可评估基因中，684个sgRNA靶向位点显著降低了靶向等位基因表达（对应85个基因），其中52.9%的基因表现出非靶向等位基因表达升高。在具有等位基因特异性沉默效果的sgRNA中，43%诱导了非靶向等位基因的代偿性上调。这一结果表明等位基因特异性表观遗传沉默频繁引发补偿性等位基因表达，支持Epi-Allele的广泛适用性。
**（三）靶位点表观遗传特征可预测Epi-Allele编辑后的补偿性等位基因表达**
研究人员发现，即使靶向同一基因，不同sgRNA位点产生的效果也不同。非补偿型sgRNA靶位点聚集在转录起始位点（transcription start site，TSS）±1 kb范围内，而补偿型sgRNA靶位点在TSS下游1-2 kb处出现额外聚集。通过深度学习模型预测，独立测试集的准确率达80.2%。特征重要性分析显示，DNA甲基化、ATAC信号、RNA聚合酶II结合、H3K9me3和H3K27me3是预测补偿型sgRNA的关键表观遗传特征。补偿型位点表现出不对称的DNA甲基化和H3K9me3分布，以及富集的ATAC、RNA聚合酶II信号和活性组蛋白修饰标记。该模型使sgRNA设计的成功率从约14%提高到50%。
**（四）Epi-Allele缓解HCM小鼠模型的疾病表型**
研究人员利用携带Myh6基因R403Q突变的HCM小鼠模型（与人类MYH7 p.R403Q变异同源），通过胸腔内注射在P2新生小鼠中进行双AAV递送。在环孢素A（cyclosporine A，CsA）加速HCM发病后，Epi-Allele处理显著降低了心室壁和室间隔厚度，缓解了心室重构，心脏收缩功能从病理性高收缩状态恢复正常且未损伤收缩功能。心电图显示HCM对照组呈现非单相“M”波，而Epi-Allele处理组恢复正常单相波形，R波、P波、Q波振幅和校正QT间期（QTc）均恢复正常。组织学分析显示心肌纤维排列紊乱和心脏纤维化均显著缓解，表型接近野生型水平。
**（五）Epi-Allele治疗后转录组正常化**
体内分析显示，Epi-Allele使致病性Myh6表达降低67%，正常等位基因表达升高39%，致病/正常等位基因表达比从1.01降至0.29，而总Myh6 mRNA和蛋白水平在各组间保持一致。单细胞核RNA测序（snRNA-seq）分析显示，Epi-Allele处理组呈现野生型样细胞组成，心肌细胞和成纤维细胞的表达谱向野生型方向转变，心肌细胞中与心脏收缩、氧化磷酸化、MAPK和HCM通路相关的基因下调，成纤维细胞中生长因子反应和含胶原细胞外基质程序减少，表明Epi-Allele介导的等位基因特异性沉默有效缓解了HCM模型小鼠的转录组改变。
**（六）Epi-Allele全基因组脱靶效应评估**
多组学整合分析显示，Epi-Allele在靶位点引起了预期的等位基因特异性变化——C57等位基因上DNA甲基化和抑制性组蛋白修饰增加，DBA等位基因上活性标记富集——而全基因组范围的DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质可及性总体保持不变。预测的脱靶位点未检测到显著表达变化，主要组织器官的组织学结构保持正常。在多种组学数据集中，除靶向等位基因的特异性变化外，未发现一致的脱靶改变。
**（七）Epi-Allele改善患者来源iPSC-CMs的HCM表型**
研究人员从1例携带MYH7 c.1208G>A p.R403Q杂合突变的HCM患者和1例健康供体中获得iPSCs并分化为心肌细胞。患者与健康供体共享MYH7调控区的非致病性SNP rs2069540。在健康供体iPSC-CMs中，4条等位基因特异性sgRNA均能降低靶向等位基因并升高非靶向等位基因的表达，无论致病突变位于哪个等位基因。在患者iPSC-CMs中，Epi-Allele在靶向等位基因上增加DNA甲基化，在非靶向等位基因上降低DNA甲基化，细胞表达谱向野生型状态转变，钙响应、氧代谢、NF-κB信号和凋亡相关通路下调。处理后的细胞肌原纤维排列恢复正常，病理性肥大逆转，氧消耗率部分正常化。与仅能覆盖0.82%患者的碱基编辑相比，靶向rs2069540的Epi-Allele理论上可覆盖近50%的MYH7突变患者。
**（八）Epi-Allele治疗相关的等位基因表观遗传修饰重塑**
在F1心肌细胞中，Epi-Allele靶向Myh6 C57等位基因后，C57等位基因上DNA甲基化增加，DBA等位基因上DNA甲基化减少。组蛋白修饰分析显示C57等位基因上抑制性标记H3K9me3显著升高，活性标记减少，而DBA等位基因上活性标记增加、H3K9me3减少。ATAC-seq分析显示致病等位基因染色质可及性显著降低，正常等位基因显著升高，而整体可及性基本不变。进一步分析发现与Myh6相关的两个主要转录因子（transcription factor，TF）Gata4和Nkx2-5，其表达水平未变，但ChIP-seq显示其在C57等位基因上的结合减少，在DBA等位基因上的结合增加，总结合量基本不变，提示TF在等位基因间发生了重新分布。
**（九）TF占据重分布介导补偿性非靶向等位基因表达**
同时敲低Gata4和Nkx2-5并不影响Epi-Allele对靶向等位基因的抑制，但几乎完全消除了非靶向等位基因的代偿性上调。利用Cas9等位基因特异性删除C57 Myh6等位基因上TF结合启动子区域后，DBA等位基因表达增加，而编码区切割无此效果，表明补偿效应与TF结合区域被破坏有关，而非仅由转录输出减少或Cas9介导的DNA损伤引起。该删除导致Nkx2-5在靶向等位基因上结合减少、非靶向等位基因上结合增加，并伴随非靶向等位基因启动子DNA甲基化降低、H3K27ac增加和染色质可及性增强。过表达Gata4和Nkx2-5使TF结合位点饱和后，Epi-Allele不再增加DBA等位基因表达，排除自主染色质激活的可能性。免疫共沉淀联合质谱（co-immunoprecipitation/mass spectrometry，coIP/MS）分析发现Gata4和Nkx2-5的互作蛋白显著重叠，富含EP300、Smyd1等组蛋白修饰因子以及Actl6a等BAF复合物相关蛋白，为TF占据改变与染色质重塑之间的关联提供了候选调控因子。
**五、讨论与结论**
研究人员发现等位基因特异性表观遗传沉默引起的非靶向等位基因补偿是一种普遍现象，与局部表观遗传特征相关，并建立了高吞吐量检测等位基因表达变化的平台及sgRNA设计预测模型。Epi-Allele在沉默效率上可与现有等位基因特异性疗法相比拟，但通过非靶向等位基因的代偿性上调维持了总基因表达，避免了单倍剂量不足。针对靶向位点周围TF的重分布，研究人员提出了一个工作假说：从靶向等位基因释放的TF优先重新结合到同源等位基因上邻近的调控位点，因为TF结合位点在生理条件下未被完全占据，解离的TF可优先在附近重新结合，且同源等位基因共享相似的顺式调控结构并可能在空间上邻近。TF占据改变与染色质重塑之间可能相互促进。碱基编辑受编辑窗口和突变类型限制，且MYH7存在大量点突变，难以覆盖所有变异；而Epi-Allele靶向启动子区域的非致病性SNP，单个编辑器即可治疗携带不同致病突变的患者。81.4%的单基因遗传病基因含有至少一个常见SNP，提示Epi-Allele对多种显性遗传病具有较高的治疗潜力。该策略还可应用于功能缺失性疾病，通过靶向致病等位基因同时增加正常等位基因表达以恢复功能性蛋白，并降低基因替换疗法相关的非生理性过表达风险，对剂量敏感基因尤为重要。研究局限性包括受测序限制的全基因组筛选基因数有限、未直接监测TF在等位基因间的直接移动、体内实验仅使用雄性小鼠及iPSC-CM研究的供体人口统计学信息有限等。总体而言，Epi-Allele提供了一种无单倍剂量不足风险的等位基因特异性治疗策略，为显性遗传病的治疗开辟了新途径。
