用于细胞内 ATP 成像的光激活四面体 DNA 纳米结构

《Analytica Chimica Acta》：Photoactivated Tetrahedral DNA Nanostructure for Intracellular Imaging of ATP

　　

摘要

背景

三磷酸腺苷（ATP）不仅是生物体中最直接的能源，还作为信号分子调节各种生物途径。因此，准确检测和细胞内成像对疾病诊断具有重要意义。然而，现有的 ATP 检测和成像方法普遍面临敏感性相对较低和时空精度有限等挑战。本工作开发了一种光活化四面体 DNA 纳米结构（PTDN），用于 ATP 的灵敏检测和精确细胞内成像。

结果

在 PTDN 递送进入细胞后，紫外线（UV）照射切断 H1 上的光裂解连接子，激活 PTDN。细胞内的 ATP 结合到 S4 上的适配序列，释放 T 链并触发 H1、H2 和 H3 之间的催化发夹组装（CHA），恢复荧光信号。此过程释放的 T 链持续触发 CHA 反应，形成 TDN 介导的 DNA 纳米网络。开发的 PTDN 系统通过空间限域效应实现了显著的信号放大，用于 ATP 检测的检出限（LOD）低至 0.41 nM。结合外源光激活策略，实现了 MCF-7 和 HeLa 细胞的精确细胞内成像。此外，该系统对 ATP 表现出优异的选择性，并已成功应用于细胞裂解液的实际样品检测。

意义

本工作同时克服了 ATP 检测和原位细胞成像中敏感性低和时空精度有限的挑战。这种外源光活化的 DNA 纳米网络为生物标志物的灵敏准确监测和成像提供了一个有前景的荧光平台，并有望扩展到其他信号分子的检测。

引言

三磷酸腺苷（ATP）由腺嘌呤、核糖和三个磷酸基团组成 [1]。它不仅是最直接的能源，还作为信号分子调节各种生物途径 [2]，[3]。细胞内的 ATP 水平维持在 1～10 mM 的水平 [4]。异常的细胞内 ATP 水平与多种疾病相关，如恶性肿瘤、炎症相关疾病、心血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森病等 [5]，[6]，[7]。研究发现，肿瘤细胞内的 ATP 水平可高出正常细胞的 1.2～5 倍。在某些疾病（如缺血）和药物治疗可能导致细胞损伤并将 ATP 浓度降低至 μM 水平，甚至完全耗竭 [8]，[9]。与用于 ATP 检测的高效液相色谱 [10]、质谱 [11] 和电化学方法 [12] 相比，荧光光谱法因其响应快、操作简便且适用于生物成像而在 ATP 分析中受到特别关注 [13]，[14]。然而，传统的均相荧光检测从根本上受限于反应物在溶液中的自由扩散和随机碰撞。这种对随机碰撞的依赖不仅延长了动力学响应时间，还导致固有的局部分析物浓度低，从而降低了信噪比和检出限（LOD）。因此，增加局部探针浓度和加速反应速率对于提高 ATP 检测的敏感性至关重要。

与之形成鲜明对比的是，DNA 纳米机器具有独特的空间限域效应，通过几何约束促进反应物的聚集及其方向性分子排列，并通过邻近效应加速反应动力学。这些协同效应赋予了超灵敏的检测和成像能力，展示了纳米结构平台相较于传统均相系统的优越性。在各种纳米机器中，四面体 DNA 纳米结构（TDN）具有优异的生物相容性、良好的细胞膜通透性和刚性结构，因此被广泛用作有效的探针载体，为反应物的聚集提供空间限域效应。此外，它还可以作为支架携带多个信号放大模块 [15]，[16]。例如，Yuan 等人开发了一种四面体共轭梯状 DNA 结构，用于同时超灵敏检测和高效共定位成像两种 miRNA [17]。Huang 等人将功能化 DNA 四面体纳米结构与级联放大方法相结合，实现了 let-7a 的高灵敏度检测 [18]。然而，这些基于 TDN 作为放大支架的探针通常采用“始终激活”的设计，无法在特定的空间区域和特定的时间点成像目标。过早激活会影响检测准确性，导致信噪比低和功能有限。因此，开发一种“智能开关”以实现原位信号放大和高精度成像尤为重要，通过精确的时空控制来实现。

光具有高时空可控性，使其成为控制 DNA 探针激活的理想外部刺激。基于这一特性，光化学调节通常将光响应基团修饰到核酸分子上，以实现 DNA 探针的光控激活 [19]，[20]，[21]。在各种光响应基团中，光裂解连接子（PC-linker）由于其可自由选择的修饰位点、温和高效的光响应条件以及与 DNA 探针的良好相容性而具有显著优势 [22]。目前，PC-linker 已成功应用于各种 DNA 探针的光控激活，为高时空精度成像提供了一种重要方法 [23]，[24]。因此，基于 PC-linker 的外源光激活策略与 TDN 介导的纳米结构的结合无疑为 ATP 的同时高时空精度成像和高灵敏检测提供了一种强大的技术。然而，目前几乎没有相关报道。

在本工作中，开发了一种用于活细胞中 ATP 高灵敏检测和高时空精确成像的光活化四面体 DNA 纳米结构（PTDN）。首先，四条单链 DNA（S1、S2、Cy5 标记的 S3 和 S4）自组装形成四面体 DNA 纳米结构（TDN）。然后，编码有 PC-linker 的发夹 H1、H2、BHQ2 标记的 H3 和 T 链分别通过与 S1、S2、S3 和 S4 的碱基互补配对组装在 TDN 的四个顶点上，从而形成 PTDN（图 1A）。H3 和 S3 的邻近导致 S3 上 Cy5 的荧光信号被猝灭，这是由于 H3 上的 Cy5 和 BHQ2 之间的荧光共振能量转移（FRET）。在将 PTDN 递送至细胞后，外源紫外线（UV）照射触发标记在 H1 上的 PC-linker 的光解，从而激活 PTDN。随后，细胞内的 ATP 结合到 S4 上的适配序列，释放 T 链并启动 H1、H2 和 H3 之间的催化发夹组装（CHA）反应。结果，标记有 Cy5 的 S3 远离标记有 BHQ2 的 H3，Cy5 的荧光信号得以恢复。同时，在此过程中释放的 T 链将激活新一轮的 CHA 反应。CHA 反应的持续发生将促使 DNA 纳米网络结构的形成，产生显著增强的荧光信号。由于 TDN 介导的 DNA 纳米网络与外源光激活策略的巧妙结合，PTDN 不仅通过空间限域效应实现了显著的信号放大，还通过紫外线照射激活实现了特定时间和地点的 ATP 成像，从而为灵敏和时空精确的生物标志物成像提供了一个强大的工具。

章节摘要

材料与仪器

特定实验所需的材料和仪器列在补充材料中，所使用的核酸序列见附表 S1。

PTDN 的构建

所有发夹（25 μL，10 μM）在 95 °C 下退火 10 分钟，然后逐渐冷却至室温后使用。PTDN 的组装分为两步进行。首先，将等量的单链 S1（2.0 μL，10 μM）、S2（2.0 μL，10 μM）、S3（2.0 μL，10 μM）和 S4（2.0 μL，10 μM）加入到 Mg²⁺-TE 缓冲液中

光活化四面体 DNA 纳米机器用于 ATP 细胞内成像的原理

图 1 描述了 PTDN 的构建以及 PTDN 用于 ATP 细胞内成像的具体机制。首先，四条单链 DNA（S1、S2、Cy5 标记的 S3 和 S4）自组装形成 TDN。然后，编码有 PC-linker 的发夹 H1、H2、BHQ2 标记的 H3 和 T 链分别通过与 S1、S2、S3 和 S4 的碱基互补配对组装在 TDN 的四个顶点上，从而形成 PTDN（图 1A）。H3 和 S3 的邻近导致荧光被猝灭

结论

本研究结合了 TDN 介导的纳米网络和外源光激活技术，构建了一个用于 ATP 检测和细胞内 ATP 成像的荧光平台。TDN 的空间限域效应可以浓缩反应物并加速反应动力学，从而实现对 ATP 的高灵敏检测。同时，基于 PC-linker 的外源紫外线照射可以在特定时间和地点激活探针，实现高时空精度成像

CRediT 作者贡献声明

陈世红：撰写 - 审稿与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取。阮一凡：撰写 - 审稿与编辑，资金获取。谭海平：撰写 - 原稿，监督，数据整理，构思。何诗宇：撰写 - 审稿与编辑，撰写 - 原稿，调查，形式分析，数据整理，构思。袁若：监督，资源。赵金文：监督，项目管理

利益冲突声明

作者声明他们不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响了本论文中报告的工作。

数据可用性

数据将应要求提供

利益冲突声明

? 作者声明他们不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响了本论文中报告的工作。

致谢

本工作得到 中国国家自然科学基金（22376171，22304140 和 21775122）、重庆市自然科学基金（CSTB2025NSCQ-GPX0525 和 CSTB2022NSCQ-MSX0586）以及 四川省科学技术厅（2026NSFSC0888）的支持。

何诗宇|谭海平|赵金文|袁若|阮一凡|陈世红

教育部西南大学发光分析与分子传感重点实验室，西南大学化学化工学院，中国重庆 400715