RT-RPA联合CRISPR/Cas12a单管双模式检测赤羽病毒

《Animals and Zoonoses》：RT-RPA combined with CRISPR/Cas12a one-tube dual mode for detection of Akabane virus

　　

研究人员首次通过整合反转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）与CRISPR/Cas12a，建立了一种用于检测赤羽病毒（AKAV）的单管检测体系。该体系可在50 min内于37 ℃完成反应，通过荧光读出或侧流层析试纸条（LFS）实现可视化检测。AKAV为单股负链RNA病毒，其S基因较L、M基因更保守，故选作靶标。单管设计中，管底为RT-RPA预混液（10 μL），管盖为CRISPR/Cas12a检测混合液（10 μL）；先37 ℃扩增20 min，离心合并后继续37 ℃切割30 min。荧光模式采用FAM-BHQ1 ssDNA报告分子，LFS模式采用FAM-Biotin ssDNA报告分子。灵敏度达1 copy/μL，特异性测试中对口蹄疫病毒、猪圆环病毒2/3/4型、古典猪瘟病毒、塞内卡谷病毒、轮状病毒、肠道病毒71型均无交叉反应。30份奶牛肛门拭子临床样本中检出6份阳性，与RT-qPCR结果100%一致（kappa=1.00）。该单管双模式平台为AKAV的快速、准确及现场可部署诊断提供了新工具。

研究背景方面，赤羽病毒（Akabane virus, AKAV）属单股负链RNA病毒，经蚊、库蠓等吸血节肢动物传播，致牛、羊、山羊等出现流产、早产、死胎及先天性无脑等繁殖障碍，在日本、澳大利亚、东亚、中东及非洲均有分布，近期中国部分地区血清学调查提示已呈地方流行，对畜牧业造成显著经济损失。现有微量血清中和试验特异性高但耗时长；RT-PCR与RT-qPCR虽常用仍需精密仪器；ELISA、间接荧光抗体试验等免疫学方法亦不适于基层现场。CRISPR/Cas系统本身诊断灵敏度不足，需耦合同温扩增技术。因此研究人员拟建立一种单管、双模式、可现场判读的AKAV核酸快速检测法，相关成果发表于《Animals and Zoonoses》。

关键技术方法上，研究人员以AKAV S基因为靶标，经ClustalW比对筛选保守区，用Primer Premier 5设计8对RT-RPA引物、Benchling设计crRNA，BLAST验证特异性；原核表达并纯化Lb-Cas12a蛋白（pET-28b/BL21(DE3)，His柱–肝素柱两步纯化，SDS-PAGE纯度>95%）；采用单管分层体系（管底RT-RPA、管盖CRISPR/Cas12a），37 ℃两步合计50 min；双模式读出分别为荧光微孔板（λex 485 nm/λem 535 nm）与侧流试纸条（T线/FAM-Biotin）；临床验证采用30份奶牛肛门拭子（吉林大学动物伦理号SY202502021），以RT-qPCR（Ct≤35判阳）为参照。

研究结果部分，3.1节CRISPR-Dx-based AKAV S Fragment Gene Detection中，研究人员表达纯化Lb-Cas12a并验证其顺式切割（cis-cleavage）与反式切割（trans-cleavage）活性，确认crRNA靶向S基因保守区且激活依赖靶标存在。3.2节Optimization of reaction of RT-RPA中，8对引物筛得No.6（RT-RPA-6F/6R）扩增效率最高；时间、温度、引物浓度优化确定20 min、37 ℃、0.5 μM为最优。3.3节Optimization of the RT-RPA-CRISPR/Cas12a one-tube Assay System中，正交实验确定Cas12a 350 nM、crRNA 200 nM、ssDNA-FQ报告分子500 nM、切割30 min最优，组内CV 1.9%–4.9%、组间CV 5%–7.5%。3.4节Establishment of a one-tube dual-mode visualization and detection system中，LFS模式ssDNA-FB报告分子75 nM、20 min显色最佳；荧光模式沿用上述体系。3.5节Sensitivity and specificity assessment中，转录RNA梯度稀释（10?–10? copies/μL）显示荧光与LFS均达1 copy/μL检出限；8种非AKAV病毒无交叉信号。3.6节Clinical sample detection中，30份奶牛肛门拭子检出6阳性（20%），荧光、LFS、紫外目测三者一致，与RT-qPCR符合率100%（Cohen's kappa=1.00）。

讨论部分指出，AKAV在中国属二类动物疫病，早期筛查需求迫切；相较Li等RT-qPCR（LOD 13.4 copies/μL）、Deng等双重RT-qPCR（LOD 1.5 copies/μL）及Qiao等RT-LAMP（LOD 5.0 TCID??/mL，需开管），本研究单管封闭设计规避气溶胶污染，50 min内双模式目读，灵敏度达1 copy/μL。局限性包括肛门拭子非传统采样部位、未能用Simbu群病毒（Aino、SBV）验证特异性、LOD仅三次重复、临床样本量n=30偏小。结论部分翻译为：研究人员开发了RT-RPA联合CRISPR/Cas12a的单管双模式可视化检测AKAV方法，37 ℃ 50 min内完成，检出限1 copy/μL；单管设计免开盖，避免扩增气溶胶污染；紫外荧光与LFS双模式裸眼判读，为AKAV现场分子诊断提供可靠替代方案。