斑马鱼幼鱼揭示神经坏死病毒的早期神经病理特征及宿主反应

《iScience》：Zebrafish larvae reveal early neuropathology and host responses to nervous necrosis virus

　　

要点

- 斑马鱼幼鱼模型在浸浴暴露后模拟早期OGNNV-HN1感染
- OGNNV-HN1在幼鱼体内12小时内建立有效感染
- NNV破坏幼鱼体内olig2标记的神经细胞及视网膜组织
- RNA-seq将NNV感染与抗病毒、应激及细胞周期通路相关联

摘要

神经坏死病毒（NNV）是水产养殖业中一种重要的嗜神经病原体，但其早期宿主应答仍缺乏明确界定。本研究使用受精后4天（4 dpf）的斑马鱼幼鱼及浸浴暴露方法，考察NNV感染的早期阶段。感染幼鱼表现出病毒逐步积累、衣壳蛋白产生以及从幼鱼匀浆中回收具有感染性的病毒。组织学与超微结构分析显示早期神经损伤，包括视网膜破坏、线粒体肿胀以及脑组织中病毒样颗粒。感染还与运动行为改变相关。转录组分析进一步揭示固有抗病毒、氧化应激、细胞因子及应激应答通路的激活，同时神经元维护、DNA复制和细胞周期进展相关基因受到抑制。这些发现界定了NNV感染的早期病理及转录特征，并突出了斑马鱼幼鱼作为研究水产养殖中早期宿主-病毒相互作用的有用脊椎动物模型。

图解摘要

引言

神经坏死病毒（NNV）是β节状病毒属的一种RNA病毒，是造成水产养殖业重大疾病暴发的水传播病原体。NNV主要通过水环境传播，水环境既是传播媒介又是病毒储存库，使得病毒能在养殖鱼类种群中高效传播。NNV主要感染幼鱼和亚成体鱼，对中枢神经系统（CNS）造成广泛损伤，导致病毒神经坏死（VNN）。感染鱼类表现出特征性症状，如转圈游动、平衡丧失、色素变化、视网膜退化和高死亡率。迄今为止，NNV已被报道感染超过140种经济重要的海洋和淡水鱼类，包括橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）、欧洲鲈（Dicentrarchus labrax）、塞内加尔鲆（Solea senegalensis）和 Gilthead鲷（Sparus aurata）等，造成了严重经济损失，威胁全球水产养殖业的可持续性。

尽管在NNV生物学研究方面已取得重大进展，但目前大多数研究仍依赖体外实验，使用高度易感的鱼类细胞系，如石斑鱼脾细胞（GS）和石斑鱼脑细胞（GB）。然而，石斑鱼类（NNV的自然宿主）在实验室条件下难以维持和繁殖，使得稳定获取敏感鱼类进行受控感染研究面临困难。这些限制制约了对感染机制、复制动力学和宿主免疫应答的系统研究。此外，细胞基系统无法完全捕捉整体宿主-病原体相互作用的复杂性，阻碍了对病毒致病机理、抗病毒免疫以及有效治疗或预防策略的全面研究。

斑马鱼（Danio rerio）长期以来被广泛应用于发育生物学研究，并已发展成为在受控实验室条件下研究水生病毒宿主相互作用的理想模型，包括鲢鲤春病毒血症病毒（SVCV）感染。斑马鱼具有类似哺乳动物的固有和适应性免疫系统，拥有保守的干扰素介导的抗病毒通路，其已完全测序的基因组允许多样的遗传操作，包括基因敲除、基因敲入和转基因品系，用于体内特定细胞群落的追踪。这些优势使其在涉及人类诺如病毒（HuNoV）、寨卡病毒（ZIKV）、甲型流感病毒（IAV）、鲤疱疹病毒3型（CyHV-3）、隐匿死亡节状病毒（CMNV）和病毒性出血性败血病毒（HSHV）的病毒学研究中得到广泛应用。

多项研究已评估斑马鱼作为NNV感染模型的适用性。这些研究表明，易感性在很大程度上取决于幼鱼发育阶段和攻毒途径，直接注射途径通常比浸浴暴露产生更明显的死亡率。后续研究进一步显示，幼鱼也可通过浸浴暴露途径感染，并表现出典型的临床症状和中枢神经系统空泡化。自然感染也已有报道，斑马鱼表现出经典VNN病理学特征，且石斑鱼NNV（RGNNV）样病毒检测结果呈阳性。虽然这些研究证实斑马鱼是β节状病毒的允许宿主，但它们主要关注死亡率、组织病理学验证或固有免疫应答。对早期幼鱼感染的系统分析，包括复制动力学、神经损伤、运动障碍以及建立适用于下游机制研究的标准化平台，仍显不足。

本研究使用斑马鱼幼鱼作为实验宿主，以橙斑石斑鱼神经坏死病毒海南株（OGNNV-HN1）作为攻毒病毒，改进并全面评估了一种受控浸浴暴露感染模型。通过整合病毒载量定量、组织病理学、超微结构表征、运动行为分析和基于olig2的神经成像，我们证明斑马鱼幼鱼重现了养殖鱼类中观察到的关键病理特征，包括活跃的病毒复制、中枢神经系统损伤和运动功能障碍。这一基于浸浴暴露的幼鱼系统为体内研究早期宿主-病毒相互作用和NNV相关神经毒性提供了一个可行的脊椎动物框架。

结果

斑马鱼NNV感染模型的确立

为评估NNV在斑马鱼幼鱼中的致病性，将受精后4天（4 dpf）的AB品系和Tg(olig2:DsRed2)转基因幼鱼暴露于未稀释病毒原液或系列稀释病毒悬浮液中，并记录死亡率（图1A和S1A）。死亡率呈剂量依赖性增加。死亡率数据分析显示，12小时时的估算半数致死浓度（LC50）约为1.43 × 10? TCID50/mL，如图1A中虚线所示。因此，后续正式感染实验选用此浓度。

图1 NNV感染诱导斑马鱼幼鱼剂量依赖性死亡和时间依赖性病毒积累

(A) 受精后4天（4 dpf）的斑马鱼幼鱼在不同终末病毒滴度的NNV悬浮液中浸浴4小时。Con代表未感染对照组。1–7组分别对应终末病毒滴度为7 × 10?、1 × 10?、1.43 × 10?、2.04 × 10?、2.92 × 103、4.16 × 102和5.95 × 101 TCID50/mL。暴露后12小时记录死亡率，虚线表示49%死亡率。12小时LC50通过probit回归法估算。

(B和C) 感染后0、4、8和12小时病毒CP（B）和RdRp（C）的相对RNA水平通过qRT-PCR定量。

(D) 西方印迹分析显示感染幼鱼在感染后0、4、8和12小时NNV CP的时间依赖性积累，以β-actin作为上样对照。每条泳道代表10尾幼鱼混合，进行了三次独立生物学重复。下方的气泡图汇总了三次生物学重复中CP条带的平均灰度强度。

(E和F) 通过AQ-PCR利用标准曲线测定CP（E）和RdRp（F）RNA靶标的绝对拷贝数。对于（B）、（C）、（E）和（F），每个时间点n = 3个生物学重复，每个生物学重复由3尾幼鱼混合组成。对于（D），每个时间点n = 3个生物学重复，每个生物学重复由10尾幼鱼混合组成。数据以均值 ± SEM表示。标注不同字母（a、b、c和d）的数值差异显著，由单因素ANOVA后Tukey多重比较检验确定（p < 0.05）。

NNV RNA和CP蛋白在斑马鱼幼鱼中的积累

为深入探究NNV在斑马鱼幼鱼中的早期感染动态，我们定量测定了感染后0、4、8和12小时病毒CP和RdRp的相对RNA水平。在测量的时间窗口内，CP RNA水平逐步升高，在12小时达到最高水平，表明早期感染期间病毒RNA的渐进性积累（图1B）。类似地，RdRp RNA水平呈时间依赖性增加，在12小时观察到最高水平（图1C）。

西方印迹分析进一步显示，感染后CP蛋白丰度逐渐增加。CP蛋白条带强度从4小时到12小时逐步增强，支持早期感染期间病毒结构蛋白在斑马鱼幼鱼中的积累（图1D）。综上，这些结果表明NNV RNA和CP蛋白在感染斑马鱼幼鱼中以时间依赖性方式积累。

绝对定量证实NNV在斑马鱼幼鱼中的快速积累

结果显示，CP和RdRp靶标的Ct值与质粒拷贝数的对数呈强线性相关。线性方程为 y = ?3.9875x + 34.911（R2 = 0.998，CP）（图S1B）和 y = ?4.5776x + 35.969（R2 = 0.998，RdRp）（图S1C），表明绝对定量PCR（AQ-PCR）检测具有良好的线性。

绝对定量进一步支持感染幼鱼中病毒的渐进性积累。基于标准曲线，CP和RdRp拷贝数从感染后0到12小时随时间增加（图1E和1F；表1）。0小时时已可检测到病毒拷贝，与浸浴暴露和清洗后幼鱼附着的初始病毒输入一致。到8小时，两个靶标的拷贝数均已增加至103量级，支持浸浴攻毒后早期病毒快速积累。到12小时，CP和RdRp拷贝数进一步增加至10?和10?量级。值得注意的是，8小时时首次观察到幼鱼死亡，此时两个病毒靶标均已达到103量级，而12小时观察到更高死亡率时伴随病毒负荷进一步升高。这些数据支持该模型中病毒快速扩增与早期幼鱼死亡之间存在密切的时间关联。

感染时间（h） | CP（Ct*） | CP拷贝数（×103） | RdRp（Ct*） | RdRp拷贝数（×103）
0 | 32.50 | 0.00434 | 0.00342 | 50.306
2 | 27.50 | 0.07182 | 0.54.112 | 221.862
4 | 1213.57 | 3.78415 | 517.910 | —

表1 通过AQ-PCR测定的斑马鱼幼鱼中NNV病毒载量

注：*Ct值代表三个生物学重复的均值，每个重复由3尾幼鱼混合组成。标准曲线：CP，Ct = ?3.9875x + 34.911；RdRp，Ct = ?4.5776x + 35.969。

从感染斑马鱼幼鱼中回收并在SC1细胞中滴定具有感染性的NNV

为评估能否从感染斑马鱼幼鱼中回收具有感染性的NNV，将感染后12小时收集的幼鱼匀浆（经过滤）接种至SC1细胞中。在模拟组中，SC1细胞在整个5天观察期内保持正常形态，形成紧密排列的单层，未检测到细胞病变变化（图2A，上排）。相比之下，暴露于NNV感染幼鱼匀浆的SC1细胞出现了逐渐明显的细胞病变效应（CPE），从接种后3天（dpi）的轻度细胞变圆和汇合度降低开始，进展到5 dpi时的严重细胞收缩、脱落和广泛溶解（图2A，下排）。一致地，对SC1培养上清进行的qRT-PCR分析显示，接种后1至5天病毒CP和RdRp RNA水平逐渐升高（图2B和2C）。此外，基于5 dpi时SC1细胞中观察到的CPE的终点稀释试验显示，12小时感染幼鱼匀浆中含有可检测的感染性病毒，计算滴度约为2.37 × 10? TCID50/mL（表S1）。

图2 斑马鱼来源NNV在SC1细胞中的感染性

(A) 接种斑马鱼来源病毒后SC1细胞中CPE的观察。SC1细胞接种NNV感染后12小时的斑马鱼幼鱼匀浆（过滤后）（感染组），而模拟组接种未感染幼鱼匀浆。在接种后第1、3和5天通过倒置显微镜监测细胞。模拟组在整个观察期内未显示明显形态变化，而感染组表现出渐进性CPE，包括细胞变圆、脱落和广泛溶解，在第5天尤为明显。显示的是三次独立实验的代表性图像。比例尺，100 μm。

(B和C) 对接种后第1、3和5天从感染SC1细胞中收集的培养上清进行qRT-PCR分析，检测病毒CP（B）和RdRp（C）RNA水平。病毒RNA水平随时间逐步增加，支持从感染斑马鱼幼鱼中回收的病毒能够在SC1细胞中增殖。数据以三个生物学重复的均值 ± SEM表示。标注不同字母（a、b、c和d）的数值差异显著，由单因素ANOVA后Tukey多重比较检验确定（p < 0.05）。

NNV感染与斑马鱼幼鱼神经及视网膜组织损伤相关

NNV感染与斑马鱼幼鱼中olig2标记的神经谱系细胞及视网膜组织的明显改变相关。在Tg(olig2:DsRed2)转基因幼鱼中，对照组中olig2启动子驱动的DsRed荧光清晰可见且连续（图3A）。相比之下，NNV感染幼鱼中DsRed荧光强度显著降低（图3B），表明olig2相关神经谱系细胞的破坏或减少。

该观察结果得到了流式细胞术的定量支持，结果显示感染后12小时感染组中DsRed+细胞的比例显著低于对照组（3.3% vs. 14.34%；图3C–3E）。一致的是，qRT-PCR分析显示，感染过程中olig2 mRNA表达呈进行性下降，感染后12小时显著降低（图3F）。Western blot分析进一步支持了这一趋势，显示Olig2蛋白水平呈时间依赖性降低（图3G）。综合来看，这些结果表明NNV感染与感染早期olig2标记的神经谱系细胞群体的破坏有关。

**图3 NNV感染后olig2标记的神经谱系细胞的变化**

（A和B）Tg(olig2:DsRed2)斑马鱼幼鱼对照组（A）和NNV感染组（B）的代表性荧光和亮场图像。红色荧光表示olig2驱动的DsRed阳性神经谱系细胞。代表性图像来自三次独立生物学重复。

（C和D）感染后12小时红色荧光DsRed+细胞的流式细胞术分析。P4表示设定的荧光细胞群。

（E）基于流式细胞术定量分析，感染后12小时DsRed+细胞的比例（占总细胞百分比）。数据以三次生物学重复的均值±标准误表示。标注不同字母（a和b）的数值经非配对Student's t检验确定存在显著差异（p < 0.05）。

（F）NNV暴露后0、4、8和12小时olig2 mRNA的相对表达水平，通过qRT-PCR定量。数据以三次生物学重复的均值±标准误表示，每个生物学重复为三只幼鱼的混合池。标注不同字母（a、b、c和d）的数值经单因素方差分析后Tukey多重比较检验确定存在显著差异（p < 0.05）。

（G）相同时间点的Olig2蛋白Western blot检测，以β-actin作为上样对照。通过灰度分析对信号强度进行半定量分析。每泳道为10只幼鱼的混合池，共进行三次独立生物学重复。

H&E染色显示，对照组眼组织视网膜层排列有序，细胞形态完整（图4A和4B）。相比之下，感染幼鱼表现出视网膜结构紊乱、细胞密度降低以及坏死损伤迹象（图4C），表明NNV感染后视觉组织发生结构性破坏。透射电镜（TEM）进一步揭示了脑组织的超微结构改变（图4D）。感染组线粒体呈现肿胀、空泡化及嵴结构破坏（图4E）。此外，在感染样本中观察到与NNV形态一致的病毒样颗粒（图4F，红色箭头），支持病毒颗粒存在于神经组织中。综合这些观察结果，NNV感染与斑马鱼幼鱼神经和视觉组织的早期损伤有关。

**图4 NNV感染后斑马鱼幼鱼的组织学和TEM分析**

（A和D）组织切片（A）和TEM分析（D）采样部位的示意图。

（B和C）对照组（B）和NNV感染组（C）斑马鱼幼鱼视网膜的H&E染色切片。对照组视网膜层次分明、排列有序，而感染组显示视网膜结构紊乱、细胞排列不规则及细胞密度降低。红色箭头指示视网膜结构破坏，蓝色箭头指示感染组细胞密度降低。

（E和F）斑马鱼脑组织的TEM图像。对照样本（E）显示线粒体完整、细胞质均一。感染样本（F）显示线粒体肿胀、膜结构破坏及电子致密的病毒样颗粒（红色箭头），支持神经组织中存在病毒样颗粒。代表性图像来自三次独立生物学重复。H&E图像中比例尺分别为0.1 mm和1 mm（如图所示）；TEM图像中比例尺为100 nm。

**NNV感染对斑马鱼运动行为的影响**

为探究NNV感染对斑马鱼幼鱼行为的影响，监测了感染后0、4、8和12小时的运动活性，并使用代表性热力图进行分析（图5）。颜色标度表示游泳速度（mm/s），蓝色代表低运动量，红色代表高运动量。在0小时，幼鱼运动相对有限。随着感染进展，游泳轨迹变得更加宽泛、分散且不规则。在8和12小时，与对照幼鱼相比，NNV感染幼鱼表现出更频繁的高速区域和更明显的运动模式改变。这些代表性热力图表明，NNV暴露与感染早期幼鱼运动行为的改变有关。形态学观察显示，对照幼鱼维持正常的体形，而NNV感染幼鱼出现脊柱弯曲、体长缩短和色素聚集（图S2）。

**图5 NNV感染改变斑马鱼幼鱼的运动行为**

斑马鱼幼鱼维持在E2培养基中（对照，左侧）或按照标准浸泡感染方案在12 h LC50浓度下暴露于NNV（1.43 × 105 TCID50/mL，右侧）。感染后0、4、8和12小时记录代表性热力图。每个圆圈代表一只幼鱼。颜色条表示游泳速度（mm/s），蓝色代表低运动量，红色代表高运动量。与对照组相比，NNV暴露幼鱼表现出改变的运动模式，在较晚时间点更为明显。代表性热力图来自三次独立行为记录。

**斑马鱼幼鱼对NNV感染的主机分子响应**

基于本研究中建立的斑马鱼幼鱼NNV感染模型，我们进一步应用RNA-seq分析了暴露后0小时基线组与感染后12小时组之间的转录组变化（图6A）。超过90%的清洁reads比对到斑马鱼参考基因组，且大部分比对reads为唯一比对（表S2）。主成分分析（PCA）显示0小时基线组与感染后12小时组之间存在明显分离，表明NNV感染早期发生显著转录重塑（图6B）。使用DESeq2并以Q ≤ 0.05作为显著性阈值，我们在12小时相对于0小时基线组中鉴定出1,521个上调基因和1,274个下调基因（图6C和6D），表明感染早期宿主基因表达发生广泛变化。

**图6 NNV感染斑马鱼幼鱼的转录组分析**

（A）在12 h LC50浓度下（1.43 × 105 TCID50/mL）感染NNV的斑马鱼幼鱼，在感染后12小时收集以进行RNA提取和RNA-seq分析。对照组指暴露后0小时基线组，NNV感染组指感染后12小时收集的幼鱼。每组RNA-seq采用三个生物学重复，每个生物学重复为10只幼鱼的混合池。

（B）PCA显示对照组和NNV感染组之间存在明显不同的转录谱。

（C）火山图展示对照组与NNV比较中的差异表达基因，红色高亮显著上调基因，绿色高亮下调基因。

（D）热图展示RNA-seq分析中对照组与NNV比较中鉴定出的显著差异表达基因的表达模式。差异表达基因使用DESeq2鉴定，Q ≤ 0.05被认为具有统计学显著性。

GO富集分析显示，上调基因显著富集于与线粒体电子传递、氧化磷酸化、细胞内铁离子隔离、死亡受体激动剂活性以及泛素化相关过程相关的术语（图7A）。相反，下调基因主要富集于与DNA修复和细胞周期过程相关的术语，包括通过断裂诱导复制进行的双链断裂修复、CMG复合体组装、DNA复制起始、细胞骨架组织及微管组织中心形成（图7B）。

**图7 NNV感染后差异表达基因的GO和KEGG富集分析**

（A和B）对照组与NNV比较中NNV感染后上调（A）和下调（B）基因的GO富集分析。对照组指暴露后0小时基线组，NNV组指感染后12小时收集的幼鱼。圆点大小表示富集基因数量，较大的圆点代表更多的基因数。颜色梯度表示富集显著性。

（C和D）对照组与NNV比较中上调（C）和下调（D）基因的KEGG通路富集分析。柱状图显示富集通路及相应基因数量。GO和KEGG富集分析使用基于超几何分布的Phyper进行。Q ≤ 0.05的富集GO术语和KEGG通路被认为具有统计学显著性。

KEGG通路富集分析进一步支持了这些发现。上调基因主要富集于代谢途径、氧化磷酸化、细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路和FOXO信号通路（图7C），表明NNV感染后抗病毒和细胞因子相关应答的激活以及代谢重塑。相比之下，下调基因主要富集于与细胞周期、细胞衰老、p53信号、Wnt信号和DNA复制相关的通路（图7D）。

**通过qRT-PCR分析验证RNA-seq结果**

为评估RNA-seq数据集的可靠性，选择12个差异表达基因（DEGs）进行qRT-PCR验证。其中包括六个上调基因（foxo1a、tnfα、hsp70、c-fos、il10和mlycd）和六个下调基因（olig2、sox10、sox9b、mapk3、wnk1a和tap1），这些基因从RNA-seq分析中鉴定。qRT-PCR结果显示表达趋势与RNA-seq获得的结果一致（图8）。尽管某些基因在两种方法间存在轻微的定量差异，但总体表达模式一致，支持了RNA-seq数据集的可靠性。

**图8 通过qRT-PCR分析验证RNA-seq结果**

选定差异表达基因的表达模式经qRT-PCR验证并与RNA-seq结果进行比较。对照组指暴露后0小时基线组，NNV组指感染后12小时收集的幼鱼。qRT-PCR验证每组采用三个生物学重复，每个生物学重复为10只幼鱼的混合池。数据以相对于对照组的log2倍数变化表示。蓝色和粉色条分别代表RNA-seq和qRT-PCR分析检测到的基因表达水平。RNA-seq差异表达使用DESeq2分析，Q ≤ 0.05被认为具有统计学显著性。qRT-PCR数据的分析方法如STAR方法中所述。

**讨论**

**斑马鱼幼鱼用于建模早期NNV感染的优势**

NNV是水产养殖中的一种主要嗜神经病原体，可在广泛的海洋和淡水鱼类中引起高死亡率。尽管幼体石斑鱼和其他养殖鱼类是天然或高度易感宿主，但它们在实验室条件下维持和实验操作技术难度较大，限制了其在病毒发病机制和宿主应答的受控机制研究中的实用性。因此，许多NNV研究仍然严重依赖易感鱼类细胞系，如GB和GS细胞。尽管这些体外系统为病毒复制和固有免疫调控提供了重要见解，但它们无法完全捕捉到个体水平的神经病理学、行为后果或系统性宿主应答。

斑马鱼幼鱼提供了一个互补的脊椎动物系统，用于在体内研究早期NNV感染。在本研究中，基于浸泡的幼鱼工作流程实现了对病毒感染积累、感染性病毒回收、神经和视网膜组织损伤、运动改变以及感染早期宿主转录应答的综合分析。与注射方法相比，这种浸泡暴露系统更接近反映水中病毒暴露，并允许在完整脊椎动物有机体中检查早期宿主-病毒相互作用。因此，本模型为研究早期NNV相关的神经病理学和宿主应答提供了可行的体内框架。

**感染斑马鱼中NNV的复制动态**

斑马鱼幼鱼在早期感染过程中NNV的快速积累突出了其支持病毒扩增的能力，这由0–12小时观察窗口内CP和RdRp RNA拷贝数的进行性增加所证实。与呼肠孤病毒生物学一致，CP积累水平高于RdRp，反映了向RNA2和结构蛋白产生的转录偏向。在其他易感宿主中也报道了类似的复制模式，包括杂交石斑鱼和亚洲鲈，表明这种复制特征可能在允许的鱼类宿主中是保守的。

我们在浸泡模型中观察到的死亡率动力学与一些先前报道的斑马鱼-NNV研究不同，那些研究中浸泡感染导致有限或延迟的死亡率。这种差异可能反映了病毒株或基因型、接种物制备、病毒剂量、宿主发育阶段、浸泡条件和死亡率标准的不同。在我们的模型中，4 dpf幼鱼在定义的浸泡方案下接受OGNNV-HN1挑战，12 h LC50为1.43 × 105 TCID50/mL。这些条件可能促进相比其他实验条件下更快的早期病理进展。

重要的是，12小时感染窗口得到了直接病毒学证据的支持。

除了 CP 和 RdRp RNA 以及 CP 蛋白积累增加外，从感染 12 小时的幼虫匀浆中分离出了具有感染性的病毒，在 SC1 细胞中的感染滴度约为 2.37 × 10? TCID??/mL。尽管这不能完全解释浸泡模型中观察到的急性死亡率，但它表明在这个早期时间段内已经存在具有感染性的病毒，而不仅仅是病毒核酸的检测。发育敏感性进一步有助于解释这些结果。以往的研究表明，斑马鱼幼虫表现出阶段依赖性易感性，死亡率主要限于孵化后第四天。此外，另一项斑马鱼 NNV 相关研究报告了快速早期的病毒进展，早期病毒基因在 2 小时时占主导地位，而晚期结构基因在 12 小时附近增加。总之，这些发现表明斑马鱼-NNV 感染结果高度依赖于环境，并受病毒基因型、宿主发育阶段和暴露条件的特定组合影响。因此，OGNNV-HN1 在 4 dpf（孵化后 4 天）斑马鱼幼虫中的浸泡感染模型应被视为一个互补系统，用于研究经水传播暴露后的快速早期 NNV 扩增和宿主反应。

NNV 感染对神经系统损伤的影响
NNV 是一种具有强烈神经嗜性的病毒，主要靶向中枢神经系统，并诱导各种硬骨鱼类中特征性的神经病理变化。在我们的斑马鱼模型中，感染幼虫显示出由 olig2 驱动的 DsRed 荧光显著减少，同时伴有视网膜层紊乱和细胞密度降低。这些病变与以往在感染 NNV 的石斑鱼和其他养殖物种中的观察结果一致，在这些物种中报道了神经元凋亡或坏死、轴突退化、胶质细胞增殖以及严重的组织破坏。同样，在 NNV 感染后的斑鲈和欧洲鲈鱼中也有视网膜退化和结构完整性丧失的报道，支持了 NNV 在不同宿主物种中对中枢神经系统和视觉系统结构具有强烈嗜性的观点。

行为观察结果也与感染幼虫的神经组织损伤一致。在感染早期，NNV 感染幼虫表现出改变的运动模式，包括更宽的游泳轨迹和比对照组更不规则的活动。虽然这些观察主要基于代表性热力图，但它们与报道的 NNV 感染鱼类中的神经异常相符。我们模型的一个显著特征是感染早期头部区域 DsRed? olig2 标记细胞的减少。Olig2 是参与神经谱系群体（包括运动神经元相关和少突胶质细胞谱系细胞）发育和维持的关键转录因子。其表达可能对中枢神经系统中的炎症和病毒刺激敏感。因此，感染斑马鱼中 olig2 表达和 Olig2 蛋白水平的早期下降可能反映了与 olig2 相关的神经谱系群体的破坏，而非单一细胞类型的损伤。结合线粒体超微结构改变，这些发现表明与 olig2 相关的神经程序破坏是斑马鱼幼虫中 NNV 相关神经病理学的早期组成部分。

早期 NNV 感染期间宿主的转录反应
RNA 测序分析显示，在早期 NNV 感染期间，斑马鱼幼虫经历了广泛的转录重塑，许多基因的表达显著改变。该反应的一个显著特征是线粒体能量相关通路的富集，包括氧化磷酸化和电子传递。在其他 RNA 病毒感染过程中也报道了类似的代谢转变，通常被解释为反映了与病毒 RNA 合成、蛋白翻译和病毒颗粒组装相关的能量需求增加。在我们的数据中，这种代谢重塑伴随着与细胞内铁隔离和死亡受体活性相关术语的富集，表明在早期感染过程中涉及氧化应激相关和细胞死亡相关过程，这与以往在鱼类病毒感染中的观察结果一致。

同时，免疫和细胞因子相关信号通路显著富集。NNV 暴露后，JAK-STAT 信号通路和细胞因子 - 细胞因子受体相互作用均显著富集。先前的研究表明，JAK-STAT 通路是抗病毒先天免疫的核心调节因子，在病毒感染期间将干扰素信号与抗病毒干扰素刺激基因和促炎细胞因子的诱导联系起来。该通路在斑马鱼幼虫中的富集表明，在早期 NNV 感染期间启动了先天抗病毒程序。FOXO 信号通路的富集也与报道的 FOXO 转录因子整合细胞因子和应激信号以调节鱼类凋亡、氧化应激抵抗力和免疫调节相符，表明应激适应机制可能参与了幼虫对 NNV 的反应。

相比之下，与细胞周期控制、DNA 复制和 DNA 修复相关的通路主要下调。已报道几种其他鱼类病毒（包括虹彩病毒科和鲤鱼病毒）也会抑制细胞周期调节因子和 DNA 合成，这被认为是感染细胞从增殖转向应激和损伤反应，或者是病毒策略以损害宿主细胞更新并促进细胞病变效应。因此，在感染 NNV 的斑马鱼幼虫中观察到的转录组特征与协调的宿主反应一致，该反应将代谢重塑和免疫信号与细胞周期进程抑制相结合。

研究的局限性
尽管对斑马鱼幼虫中早期 NNV 感染提供了重要见解，但本研究存在几个局限性。首先，我们的分析仅限于感染早期（0–12 小时），因此不涉及后期的病理进展或长期感染结果。其次，虽然浸泡模型重现了感染的关键特征，包括病毒积累、具有感染性病毒的分离、神经损伤和运动改变，但未来纳入更详细定量行为分析的研究将进一步加强感染诱导运动变化的功能评估。第三，转录组分析仅关注单一感染后时间点，提供了宿主反应的快照，而非特定免疫、代谢和应激相关通路的完整时间动态。此外，由于孵化后 4 天的斑马鱼幼虫尚未性分化，本研究无法评估性别相关效应，这可能限制研究结果的通用性。最后，由于感染结果可能随病毒株、幼虫发育阶段和暴露条件的不同而变化，需要进行更广泛的比较研究，以进一步评估本斑马鱼 NNV 感染模型中观察到的感染动力学和病理特征的通用性。

资源可用性
主要联系人
更多信息和资源请求应联系主要联系人，谢俊峰 ([e-mail])，他将予以满足。

材料可用性
本研究未生成专门用于本工作的新试剂。

数据和代码可用性
• 本研究产生的 RNA 测序数据已存入 NCBI 序列读取档案库 (SRA)，登录号为 PRJNA1229015 (https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA1229015)。
• 支持本研究结果的其他数据可在 Mendeley data 获取，网址为 https://doi.org/10.17632/dvv2h7ysy3.1。
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致谢
我们感谢中国国家斑马鱼资源中心 (CZRC) 提供本研究中使用的 Tg(olig2:DsRed2) 转基因斑马鱼品系 (CZRC ID: CZ154)。作者也感谢中山大学生命科学核心设施提供透射电子显微镜 (TEM) 协助。我们特别感谢李红梅和张佳敏在准备 TEM 样品以及协助图像采集和分析方面的帮助。本工作得到国家重点研发计划 (2023YFD2402900)、国家现代农业产业技术体系建设专项 (CARS-46)、国家自然科学基金 (32573563, 32273174, 和 31972825) 以及南方海洋科学与工程广东省实验室 (珠海) (SML2024SP003) 的支持。

作者贡献
概念化、方法论、软件、撰写 - 原稿以及撰写 - 审查与编辑：J.G.；调查和方法论：J.J.；数据整理、形式分析和方法论：S.H.；软件和方法论：R.Z.；软件：B.W.；软件和方法论：Q.M.；监督：J.Z.；调查：何健；资金获取和监督：何建国；资金获取、监督、撰写 - 原稿以及撰写 - 审查与编辑：J.X。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

利益声明
作者声明无竞争利益。

STAR★方法
关键资源表
试剂或资源 | 来源 | 标识符
抗体 | | |
Olig2 抗体 | CUSABIO | CSB-PA24549A |
NNV-CP 抗体 | 使用类病毒颗粒 (VLP) 蛋白作为抗原在本实验室制备 | 使用类病毒颗粒 (VLP) 蛋白作为抗原在本实验室制备 |
β-actin 抗体 | Cell Signaling Technology | 4499s |
HRP 偶联的山羊抗兔 IgG | Santa Cruz | Santa Cruz |
细菌和病毒株 | | |
OGNNV-HN1 (NNV) | 分离自尖吻鲈 (Epinephelus coioides) 幼虫 | N/A |
化学品、肽和重组蛋白 | | |
亚甲蓝 | Solarbio | IM184061-73-4 |
TRIzol | Tiangen | 10296010 |
CNRNase | Coolaber | RNase |
FBS | GIBCO | 10099-141 |
TBST | Invitrogen | 28360 |
4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 |
戊二醛 | Macklin | G6025111-30-8 |
MS-222 | WEST GEN | EXB-TB100 |
RNAiso Plus 试剂 | TAKARA | 9109 |
关键商业检测 | | |
PrimeScript? RT 试剂试剂盒 | TAKARA | RR037A |
2x Polarsignal? SYBR Green qPCR 混合液 | MIKM | K800B |
BCA 检测试剂盒 | Solarbio | PC0020 |
苏木精 - 伊红染色试剂盒 | Meilunbio | MB9898-1 |
存档数据 | | |
原始数据 | NCBI | PRJNA1229015 |
数据 | Mendeley Data | https://doi.org/10.17632/dvv2h7ysy3.1 |
实验模型：细胞系 | | |
SC1 细胞系 | 在本实验室通过限稀释法从 SSN-1 中衍生 | N/A |
实验模型：生物体/品系 | | |
Tg(olig2:DsRed2) 斑马鱼 | ZIRC | CZ154 |
AB 斑马鱼 | ZIRC | CZ1 |
软件和算法 | | |
GraphPad Prism 软件版本 10.1.2 | Software Inc. | https://www.graphpad.com |
ImageJ | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.net/ij |
其他 | | |
NIKON ECLIPSE C1 | Nikon | N/A |
JEOL JEM-1400FLASH | JEOL LTD | N/A |
高性能多色流式细胞仪 | CytoFLEX LX | N/A |
Viewpoint 斑马鱼追踪和活动记录系统 | DanioVision, Noldus | https://noldus.com/daniovision/benefits |
NanoDrop ND-1000/2000 | Thermo Fisher Scientific | https://www.thermofisher.cn |
BGI SEQ-500 | BGI | https://www.bgi.com |
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实验模型和研究参与者详情
本研究使用了 AB 野生型斑马鱼和 Tg(olig2:DsRed2) 转基因斑马鱼幼虫。成年 AB 斑马鱼购自中国国家水产生物资源中心，Tg(olig2) 斑马鱼购自中国国家斑马鱼资源中心。鱼类在中山大学生命科学院的斑马鱼设施中按照标准实验室条件饲养。健康的孵化后 4 天 (dpf) 幼虫用于 NNV 感染实验。由于孵化后 4 天的斑马鱼幼虫尚未性分化，本研究未确定性别或将其用作生物学变量。所有鱼类处理程序均遵循中山大学实验动物饲养和使用指南，并经中山大学机构动物护理和使用委员会批准 (批准号：SYSU-LS-IACUC-2025-0056)。

细胞系
SC1 细胞系是本实验室通过限稀释法从 SSN-1 细胞中衍生出的克隆系，用于 NNV 传播、病毒分离和感染性测定。SC1 细胞在补充了 10% 胎牛血清 (FBS; Gibco, USA) 的 Leibovitz's L-15 培养基中，按照方法细节中描述的标准培养条件维持在 28°C。SC1 细胞系基于其起源、形态、生长特征以及 NNV 感染后的特征性细胞病变效应进行了认证。细胞常规监测微生物污染情况，并在本研究使用前检测确认无支原体污染。

方法细节
斑马鱼饲养
成年斑马鱼按照国家斑马鱼资源中心的标准操作规程进行饲养。鱼类在 28.5°C 下饲养，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗。为了繁殖，成年雄性和雌性斑马鱼隔夜分离，并在第二天早上按 1:1 的雌雄比例配对。通过自然产卵获得受精卵，选择正常发育的胚胎并转移至补充了 0.5 mg/L 亚甲蓝的 E2 培养基中。胚胎在 28.5°C 和控制光照条件下孵育，直至用于后续实验。在孵育期间，定期监测胚胎发育，并及时移除死亡或异常胚胎，以尽量减少污染风险并确保实验对象的健康和一致性。

细胞培养和病毒
SC1 细胞在补充了 10% FBS 的 Leibovitz's L-15 培养基中于 28°C 培养。本研究使用的 OGNNV-HN1 分离自中国海南省尖吻鲈 (E. coioides) 幼虫病毒性神经坏死症的自然暴发疫情。将濒死幼虫的脑组织匀浆、过滤，并按照 Frerichs 等人描述的程序接种到 SC1 细胞中进行病毒分离。在使用前，通过 RT-PCR 检测 NNV 特异性基因组区域确认了分离病毒的 identity。工作病毒储备随后在 SC1 细胞中传代。本研究使用的病毒储备滴度为 7 × 10? TCID??/mL，由寇氏法 (K?rber method) 测定 (详见补充方法中的详细程序)。

确定 NNV 在斑马鱼中的中位半数致死量 (LC??)
为了确定 NNV 在斑马鱼中的 LC??，使用 4 dpf 幼虫进行了标准化的基于浸泡的感染测定。进行了一项初步的剂量 - 反应实验，使用了通过 NNV 储备液 (初始滴度：7 × 10? TCID??/mL) 连续 7 倍稀释产生的七种病毒浓度。各组治疗组的最终病毒滴度计算如下：7 × 10?, 1 × 10?, 1.43 × 10?, 2.04 × 10?, 2.92 × 103, 4.16 × 102, 和 5.95 × 101 TCID??/mL。病毒接种物制备在无菌 E2 胚胎培养基中，最终滴度代表每孔的理论浓度。
该测定采用 96 孔板，每孔分配一只幼虫，每个实验组设三个生物学重复 (n = 96 幼虫/重复)，总共 2,304 只幼虫。幼虫暴露于病毒悬液中 4 小时，随后将接种物替换为新鲜 E2 培养基。在暴露后 12 小时内每 2 小时监测一次死亡率，并记录累积死亡率。

使用 probit 回归分析病毒浓度与幼鱼存活率之间的关系，以计算 LC50 值，随后将该值应用于所有正式感染实验中，以标准化病毒剂量。

斑马鱼 NNV 感染的正式实验
基于上述确定的 LC50 值，正式感染实验共使用了 720 条健康的 4 dpf（受精后第 4 天）斑马鱼幼鱼，并分配至不同的下游检测中，包括病毒载量定量、蛋白质分析、组织学及超微结构检查、行为分析、流式细胞术和转录组分析。幼鱼以每孔 10 条分配至 12 孔板中。感染组幼鱼在 12 小时 LC50 浓度（1.43 × 10^5 TCID50/mL）的病毒悬液中浸泡 4 小时，每孔 4 mL。对照幼鱼在相同操作条件下平行处理于 E2 胚胎培养基中。暴露后，移除病毒悬液，用 PBS 清洗幼鱼三次，并转移至新鲜培养水中。该时间点被定义为感染后 0 小时（0 hpi，图 S3）。

时间序列分析的后续样本在 0 小时后 4、8 和 12 小时收集。在每个时间点进行病毒 RNA 定量时，随机选取 9 条幼鱼，分为三个生物学重复，每个重复包含 3 条幼鱼。0 小时组代表病毒暴露和清洗后立即收集的幼鱼，用作暴露后的基线，代表清洗后的初始幼鱼关联病毒输入量。所有样本保存在?80°C 直至进一步分析。

病毒载量定量和复制动力学分析
使用 TRIzol 试剂按照制造商的方案从 NNV 感染和对照斑马鱼幼鱼中提取总 RNA。通过测量 260 nm 和 280 nm 处的吸光度，分光光度法测定 RNA 纯度和浓度。260/280 比值在 1.8 到 2.0 之间的样本用于后续分析。使用 PrimeScript? RT Reagent Kit（含 gDNA Eraser）进行第一链 cDNA 合成。反应混合物在 37°C 下孵育 15 分钟，随后在 85°C 下处理 5 秒，所得 cDNA 保存在?20°C 直至下游定量分析。

为监测 NNV 积累和复制动力学，采用基于水解探针的 AQ-PCR 检测病毒 CP 和 RdRp RNA 靶标。反应在 LightCycler 480 实时 PCR 系统（Roche）上进行，使用为 CP 和 RdRp 区域设计的目标特异性引物 - 探针组（表 S3）以及商业探针 qPCR 预混液，遵循制造商说明。使用含有 CP 或 RdRp 靶片段的质粒进行 10 倍系列稀释（10^6–10^1 拷贝/μL）生成标准曲线。将 Ct 值与模板拷贝数的对数作图，获得线性回归方程，随后用于计算感染后 0、4、8 和 12 小时收集样本中的病毒拷贝数。所得 CP 和 RdRp 拷贝数的时间序列谱图用于描述 NNV 体内的积累和复制动力学。

qRT-PCR
在 Roche LightCycler 480 II 系统（Roche Diagnostics，中国上海）上进行相对定量实时 PCR（qRT-PCR），10 μL 反应体系包含 5 μL 2× Polarsignal qRT-PCR Mix（MIKX，中国）、1 μL cDNA、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物和 3 μL 无核酸酶水。循环程序包括在 95°C 下初始变性 30 秒，随后进行 40 个循环，每个循环为 95°C 5 秒和 60°C 30 秒，并进行熔解曲线分析以确认扩增特异性。每个样本进行三个技术重复分析。引物序列列于表 S3，所有反应的扩增效率均高于 90%。β-actin 被用作参考基因，因为在本研究中其在 NNV 感染下表达保持稳定。使用 0 小时组作为校准，通过 2^-ΔΔCt 法计算相对转录水平。

蛋白质提取和 Western 蛋白印迹分析
使用 4 dpf 斑马鱼幼鱼进行总蛋白提取，样本采集于 NNV 感染后 0、4、8 和 12 小时。对于每个时间点，10 条幼鱼混合为一个样本，制备三个生物学重复。幼鱼在预冷的补充有 PMSF 的 RIPA 缓冲液中裂解，并在冰上孵育 30 分钟。使用 BCA 测定试剂盒（Solarbio，PC0020）测定蛋白浓度。然后将裂解液与 5× SDS 样品缓冲液混合，并在 100°C 加热变性 15 分钟。将等量蛋白（每泳道 25–40 μg）上样至 10% SDS-PAGE 胶中，通过电泳分离，并转移至 PVDF 膜上。

蛋白转移后，PVDF 膜在室温下用 PBST 配制的 5% 脱脂奶粉封闭 1 小时。随后，膜在 PBST 中稀释的一抗中孵育 2 小时，包括使用病毒样颗粒（VLP）蛋白作为抗原在我室制备的抗 NNV CP 抗体、抗斑马鱼 Olig2 抗体（CUSABIO，中国）和抗 β-actin 抗体（Cell Signaling Technology，美国）。用 TBST 清洗三次后，膜在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（Santa Cruz，美国）孵育 1 小时。最后，膜用 TBST 清洗三次，并使用增强化学发光检测试剂（Invitrogen，美国）显色。

组织学检查和透射电镜（TEM）
在本研究中，组织切片制备自感染后 0 小时和 12 小时收集的斑马鱼，遵循 Tanaka 等人描述的方案进行了略微修改。整条幼鱼在 4°C 下用 4% 多聚甲醛固定 24 小时，在 70% 乙醇中冲洗，通过乙醇梯度脱水，并使用标准组织学方案嵌入石蜡中。切片厚度为 5 μm，裱片于载玻片上，并用苏木精 - 伊红（H&E）染色。使用 Nikon ECLIPSE C1 显微镜拍摄切片的显微图像，遵循先前建立的方法。

对于 TEM 分析，收集斑马鱼幼鱼并在 4°C 下用 2.5% 戊二醛固定 24 小时，随后用 1% 锇酸后固定 2 小时。然后将样品脱水并嵌入 Spurr's 树脂中。获取超薄切片（50 nm），用醋酸铀和柠檬酸铅染色，并在 JEOL JEM-1400FLASH 透射电子显微镜下检查。

斑马鱼幼鱼病毒分离和 SC1 细胞感染测定
为评估从斑马鱼幼鱼中回收的 NNV 的感染力，在感染后 12 小时收集每组 60 条幼鱼进行病毒分离。模拟处理幼鱼平行处理作为阴性对照。在无菌条件下，将幼鱼转移至 400 μL 预冷 PBS（pH 7.4）中，彻底匀浆，并在 4°C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。所得上清液依次通过 0.45 μm 和 0.22 μm 注射器过滤器过滤，以去除组织碎片和潜在的细菌污染物。

将过滤后的上清液接种至 96 孔板中的 SC1 细胞单层上，在 28°C 下孵育 2 小时以允许病毒吸附。吸附后，移除接种物并用新鲜维持培养基替换。细胞随后在 28°C 下培养，并在倒置显微镜下每日监测最多 5 天。记录 CPE（细胞病变效应）以评估病毒感染力。此外，在感染后 1、3 和 5 天收集培养上清液，对病毒 CP 和 RdRp RNA 水平进行 qRT-PCR 分析，如前所述。还通过终点稀释法在 SC1 细胞上确定 12 小时感染幼鱼匀浆的感染滴度，基于接种后 5 天观察到的 CPE 计算 TCID50，如补充方法中所述。

olig2 标记斑马鱼中的 NNV 感染
在本研究中，使用了携带 Tg(olig2:DsRed2) 等位基因的转基因斑马鱼品系 vu19Tg。在该品系中，olig2 启动子驱动 DsRed 在 olig2 表达的神经谱系细胞中表达，包括早期发育期间与运动神经元相关的群体。对于实验，4 dpf vu19Tg 幼鱼如上所述感染 NNV，并在感染后 12 小时采样。然后将幼鱼用 20 mg/L MS-222 麻醉，在显微镜下检查荧光变化，使用 z stack 最大强度投影图像评估 NNV 感染对 olig2 标记神经结构的影响。

流式细胞术分析
为定量分析 olig2 标记神经谱系细胞的变化，从对照和 NNV 感染的 Tg(olig2:DsRed2) 幼鱼（感染后 12 小时收集）中分离头部组织并解离成单细胞悬液。细胞通过 40 μm 细胞滤网过滤并悬浮于含 2% FBS 的 PBS 中。使用 CytoFLEX LX 高性能多色流式细胞仪（Beckman Coulter，中国）进行流式细胞术，以量化 DsRed+ 细胞的比例和荧光强度。基于前向散射和侧向散射排除细胞碎片，并使用相同的门控策略在所有组中量化 DsRed+ 细胞。每组包含三个生物学重复。

行为分析
使用配备温控和照明模块的斑马鱼追踪和活动记录系统（DanioVision，Noldus，荷兰）进行行为测定，以评估 NNV 感染对 4 dpf 幼鱼运动活性的影响。实验前，将斑马鱼幼鱼单独放置于 12 孔板中，每孔一条，以便精确观察个体的运动行为。环境温度维持在 28°C，光强调整至系统最大值的 20%，以减少幼鱼的应激反应。

每个数据记录会话持续 180 分钟，期间 Viewpoint 追踪系统持续实时监测和记录斑马鱼运动轨迹。运动参数以 1 分钟间隔导出，以获得详细的运动数据。此外，使用 Viewpoint 活动监测系统记录每条斑马鱼幼鱼的活动持续时间，从而评估其在不同时间点的活动状态和行为特征。实验结束时，收集到的轨迹数据使用 Tracking Mask 行为分析软件进行处理和分析，生成 3D 轨迹图，提供关于游泳路径、速度和活动范围的全面信息。

斑马鱼幼鱼对 NNV 感染的转录组分析
对感染后 0 小时和 12 小时收集的斑马鱼进行转录组分析。在每个时间点，生成三个生物学重复，每个重复包含 10 条幼鱼的池。使用 TaKaRa RNAiso Plus 试剂，按照制造商的方案从样本中提取总 RNA。文库制备和测序由擎科生物（中国北京）进行。使用连接 oligo(dT) 的磁珠富集 mRNA，随后使用随机六聚体引物进行逆转录和第二条链 cDNA 合成以构建 cDNA 文库。然后扩增文库以生成 DNA 纳米珠（DNBs）并装载到模式化纳米阵列上。测序在 BGISEQ-500 平台上进行，原始测序数据使用 SOAPnuke（版本 1.5.2）处理以去除低质量读数。基因表达水平使用 StringTie（版本 2.1.2）进行定量，并使用 DESeq2（版本 1.4.5）在感染后 0 小时和 12 小时组之间进行差异表达分析，显著性阈值为 Q ≤ 0.05。符合该标准的基因被认为显著差异表达，上调和下调基因根据 log2 倍数变化的方向进行分类。此外，基于超几何分布使用 Phyper 进行了京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

定量和统计分析
除非另有说明，统计分析均使用 GraphPad Prism 版本 10.1.2（GraphPad，San Diego，CA，USA）进行。数据以均值±标准误（SEM）表示。对于两组之间的比较，使用非配对 Student's t 检验。对于多组或多时间点之间的比较，使用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验。标记有不同字母（a、b、c 和 d）的数值差异显著（p < 0.05）。确切的 n 值和 n 的含义在图例、表格或方法细节中提供，视情况而定。对于幼鱼实验，n 指如图例中指定的幼鱼数量或生物学重复数。对于混合分子测定，每个生物学重复代表一组独立的幼鱼混合样本。对于流式细胞术，n 指从解剖幼鱼头部组织制备的独立生物学重复数。对于代表性图像，除非另有说明，否则检查了至少三个独立的生物学重复或独立实验。LC50 值通过 probit 回归计算，TCID50 值使用 K?rber 法计算。

使用DESeq2对RNA-seq数据进行差异表达分析，以Q ≤ 0.05作为统计学显著性标准。补充信息（1）PDF（318.63 KB）文档S1。图S1–S3和表S1–S3