丙戊酸重塑磷脂酰甘油稳态及炎症信号中的上皮细胞-巨噬细胞对话

《iScience》：Valproic acid remodels phosphatidylglycerol homeostasis and epithelial-macrophage crosstalk in inflammatory signaling

　　

亮点
• 线粒体PG稳态调控上皮脂质分泌
• VPA重塑PG代谢并增加具有抗炎作用的POPG
• 上皮脂质介导抗炎的上皮-巨噬细胞间通讯
• VPA和POPG在血管化的鸡胚尿囊绒毛膜模型中抑制炎症

摘要
肺表面活性物质脂质维持着肺稳态和先天免疫，其失调与急性呼吸窘迫综合征的发生有关。线粒体磷脂酰甘油（PG）的生物合成是否影响上皮脂质分泌和炎症反应仍不清楚。本研究使用A549细胞，通过破坏编码磷脂酰甘油磷酸合酶的PGS1基因，发现PGS1的部分缺失改变了细胞内PG水平并改变了分泌型磷脂的谱型。临床上广泛使用的抗癫痫药物丙戊酸（VPA）同样重塑了分泌型脂质，并增加了抗炎性PG物种棕榈酰-油酰磷脂酰甘油（POPG）的相对丰度，这一效果在PGS1部分缺失中并未观察到。功能上，VPA处理的上皮细胞的条件培养基可减少脂多糖诱导的PMA分化的U937巨噬细胞样细胞的炎症反应，脂质提取物对此效果有贡献。在血管化的日本鹌鹑尿囊绒毛膜（CAM）模型中，VPA和POPG均降低了炎症并维持了组织结构。总体而言，这些发现将线粒体PG代谢与上皮脂质介导的炎症调控联系起来。

图摘要

引言
肺表面活性物质由II型肺泡细胞产生，在维持肺泡稳定性及调节肺免疫方面发挥着关键作用。在表面活性物质脂质中，磷脂酰甘油（PG）已作为一种抗炎成分受到关注。其主要分子物种——棕榈酰-油酰PG（POPG）——通过限制脂多糖（LPS）在CD14-MD2-TLR4通路中的转移和识别，从而抑制Toll样受体4（TLR4）信号转导。因此，POPG在实验模型中可减轻炎症和组织损伤。在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中观察到肺泡PG降低，并与表面活性物质功能障碍和先天免疫失调相关，这突显了维持足够PG对于肺稳态的重要性。旨在恢复肺泡PG水平的策略，包括外源性POPG递送或表面活性物质补充，在炎症实验模型中已显示出良好的前景。

除在肺泡空间中的细胞外作用外，细胞内PG还参与线粒体膜组织的构建。PG与心磷脂（CL）协同支持呼吸链功能和线粒体动力学，进而通过代谢和氧化还原信号塑造先天免疫程序。然而，线粒体PG稳态如何与上皮细胞释放的表面活性物质相关脂质的组成以及下游的上皮-免疫信号转导相关联，仍不清楚。

PG和CL的生物合成主要发生在线粒体内膜上，其限速步骤由磷脂酰甘油磷酸合酶1（PGS1）催化。PGS1活性对肌醇的可用性敏感，肌醇的可用性将磷脂合成转向磷脂酰肌醇（PI）而以牺牲PG为代价。丙戊酸（VPA）是一种广泛使用的抗癫痫和情绪稳定剂，可调节线粒体代谢和肌醇稳态。与这种多效性一致，已有报道VPA在环境依赖的方式下重塑线粒体磷脂通路，包括PG/CL相关的生物合成。然而，尚不清楚VPA诱导的线粒体脂质代谢重塑是否会转化为表面活性物质相关脂质分泌的改变以及随后的肺上皮系统中炎症信号的调节。

在此，我们结合PGS1的遗传调节和VPA的药物处理，研究线粒体PG生物合成在调控肺上皮细胞中表面活性物质相关脂质分泌和炎症反应中的作用。我们进一步利用条件培养基测试VPA驱动的上皮脂质重塑如何影响巨噬细胞活化，并在高度血管化的日本鹌鹑尿囊绒毛膜（CAM）模型中评估其对炎症反应的影响。通过整合线粒体脂质生物化学、上皮分泌脂质组学和免疫读出指标，我们提出一个问题：线粒体PG生物合成的改变是否足以重编程上皮-巨噬细胞间通讯和组织水平的炎症反应。总之，我们的数据支持这样一个模型，即线粒体磷脂稳态的药理学和遗传学重塑与上皮分泌信号的改变相关联，从而调节炎症信号转导。

结果

线粒体PG生物合成控制A549细胞的磷脂分泌和代谢活性

A549细胞是研究表面活性物质脂质代谢和肺泡脂质稳态的成熟上皮模型。利用该系统，我们研究了线粒体PG生物合成的变化是否反映在分泌型磷脂的数量和分子组成中。为评估线粒体PG生物合成是否影响上皮磷脂分泌和细胞代谢，我们通过遗传学和药理学手段改变了PGS1编码的限速酶。具体方法包括：（i）建立PGS1杂合突变体；（ii）使用VPA处理细胞，这是一种已知可在哺乳动物细胞和酵母中干扰线粒体脂质代谢的化合物。

为制备PGS1突变A549细胞系，我们采用了靶向该基因外显子2的CRISPR-Cas9工具（图S1A）。通过该方法，我们成功制备了PGS1杂合细胞系（记为PGS1+/?）。我们仅获得了单等位基因破坏，这与在其他系统中报道的PG/CL通路更强烈受损时活力/适合度降低的情况一致。选定的PGS1+/?克隆在一个等位基因中存在13个核苷酸的缺失（图S1A和S1B），该缺失预计会在保守的催化基序（HKD）上游截断PGS1，与酶活性丧失一致。由于缺乏合适的抗体，基因破坏通过Sanger测序和跨越缺失外显子2区域的引物进行RT-qPCR验证，结果显示mRNA的丧失（图S1B和S1C）。

重要的是，PGS1的杂合缺失足以使其酶活性降低57%（图1A，0 mM VPA），伴随膜PG和CL分别减少22%和35%（图1B和1C）。以细胞蛋白为标准化对额外细胞内磷脂类别的分析显示，PGS1+/?细胞的总磷脂和PC含量也降低，而PE和PI+PS与野生型细胞相当（图S2A）。尽管存在这些变化，磷脂类别的相对分布基本保持不变，CL是唯一显著减少的磷脂类别（图S2B）。细胞PG和CL水平降低与线粒体功能障碍相关，表现为基础氧耗率降低12%、最大氧耗率降低8%（图1D–1F）以及呼吸链亚基NDUFB8（复合物I）和COXII（复合物IV）丰度降低（图1H；图S3）。这些数据表明，PGS1的部分缺失足以损害A549细胞的线粒体功能。

图1 VPA重编程A549细胞的线粒体脂质组成和代谢输出

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WT和PGS1+/? A549细胞培养5天后，再用0、0.06或0.6 mM VPA在无血清DMEM中处理2天。
（A）在细胞匀浆中测量的PGS1活性。
（B）细胞PG水平和（C）CL水平，通过磷酸盐测定法测定。
（D）完整细胞的基础氧耗率，作为线粒体呼吸的指标。
（E）加入解偶联剂FCCP后的最大呼吸。
（F）最大呼吸与基础呼吸之间的差值计算得出的储备呼吸能力。
（G）加入寡霉素后的质子泄漏（LEAK）。
（H）代表性免疫印迹显示呼吸链亚基NDUFB8（复合物I）、SDHB（复合物II）、UQCRC2（复合物III）、COXII（复合物IV）和ATP5A（ATP合酶）。
（I）基础ECAR。数据表示至少三次独立实验的均值±标准差（显示个体数据点）。（A–C）以未处理WT细胞（0 mM VPA）为标准化。统计学显著性通过单因素ANOVA后接Holm-?idák多重比较检验评估。星号表示与未处理WT相比的显著差异；井号表示同一细胞系内VPA浓度之间的显著差异。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001 或 #p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001。关键图例适用于（A–G）和（H）。

亚治疗和治疗的VPA浓度（0.06和0.6 mM）在48小时内对WT或PGS1+/?细胞的细胞增殖均无影响。在野生型（WT）A549细胞中，VPA使PGS1活性降低最高达30%（图1A）。同时，膜PG水平升高（图1B和1C）。这种模式与我们先前在VPA处理后的观察一致。在PGS1+/?细胞中，VPA将PG和CL恢复至接近WT水平，而PGS1活性与未处理的PGS1+/?细胞相当（图1A–1C）。同时，VPA将PGS1+/?细胞内的总磷脂和PC水平恢复至与未处理WT细胞相当的值（图S2A）。

虽然VPA未显著改变基础呼吸，但0.6 mM VPA处理在两种细胞系中均显著增加了最大呼吸、储备呼吸能力和LEAK呼吸（图1D–1G）。在WT细胞中，这些效应伴随复合物I、II、IV和ATP合酶亚基丰度增加，而在PGS1+/?细胞中仅复合物IV亚基适度增加（图1H；图S3）。同时，基础细胞外酸化率（ECAR）在WT中降低17%，在PGS1+/?细胞中降低20%，表明代谢从糖酵解向增强线粒体依赖方向转移（图1I）。总之，这些数据支持VPA增强线粒体呼吸能力并重塑线粒体膜脂质组成的观点。

接下来，我们研究了PGS1活性改变和VPA处理如何影响PC和PG的分泌，这两种是主要的表面活性物质磷脂。PGS1+/?细胞的PC分泌量约为WT A549细胞的2倍。在WT细胞中，VPA以剂量依赖的方式增加PC分泌（0.06和0.6 mM分别增加1.5倍和2.5倍）。相比之下，0.6 mM VPA使PGS1+/?细胞的PC分泌减少约25%（图2A）。PGS1活性降低还导致PG分泌量相对于WT A549细胞减少34%（图2B）。虽然VPA对WT细胞中PG分泌的影响最小，但0.6 mM VPA将PGS1+/?细胞中的PG分泌恢复至WT水平。

图2 PG的生物合成和VPA处理影响A549细胞分泌型磷脂的质量和数量

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收集WT和PGS1+/? A549细胞的文化上清液，通过离心澄清，并使用质谱法进行分析。
（A）PC和（B）PG的分泌水平。
（C）分泌型PG的相对脂肪酸链组成。
（D）二棕榈酰PG（16:0-16:0）和（E）棕榈酰-油酰PG（16:0-18:1）在培养基中的水平。数据表示三次独立实验的均值±标准差（显示个体点）。（A、B、D和E）以未处理WT细胞（0 mM VPA）为标准化。统计学显著性通过单因素ANOVA后接Holm-?idák多重比较检验评估。星号表示与未处理WT细胞相比的显著差异；井号表示同一细胞系内VPA浓度之间的显著差异。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，#p < 0.05，##p < 0.01。

虽然POPG是天然肺表面活性物质中最丰富的PG物种，但WT和PGS1+/?细胞主要分泌二棕榈酰PG（DPPG；C16:0–C16:0），分别占总PG的49%和57%，而POPG仅分别占约2%和6.5%（图2C）。尽管PG的脂肪酸谱在不同时间和培养条件下保持稳定，但VPA显著改变了WT细胞中的PG组成：DPPG减少25%，而POPG增加12倍。在PGS1+/?细胞中未观察到显著的成分变化，表明完整的PGS1活性对于VPA诱导的PG重塑是必需的（图2C–2E）。

对额外脂质类别的分析显示，VPA广泛改变了WT A549细胞的脂质分泌模式，影响了几种脂质物种的丰度和相对比例（图S4A和S4B）。这些改变在PGS1+/?细胞中基本不存在，除了缩醛磷脂和二酰甘油（DAG），支持PGS1依赖通路在协调VPA驱动的脂质分泌中起核心作用。总之，这些数据表明，由PGS1编码的酶控制并通过VPA调节的线粒体PG生物合成，决定了分泌型磷脂的数量和分子组成，并与A549细胞中的细胞代谢重编程密切相关。

A549细胞中炎症的调控

为量化上皮炎症反应，我们使用IL8表达作为A549细胞中LPS刺激的常用读出指标。在该模型中，其他细胞因子的诱导，如IL6，可能需要额外的预刺激或共刺激，因为已有报道LPS单独不足以诱导。通过在培养基中添加1 μg/mL LPS来诱导WT和PGS1+/?细胞的炎症。为测试外源性磷脂是否调节上皮炎症反应，细胞在有无选定磷脂的情况下用LPS刺激，并定量IL8表达（图3A）。与对照相比，POPG、PI或CL的联合处理显著减轻了LPS诱导的IL8表达，而DPPG、PC、磷脂酸（PA）、磷脂酰乙醇胺（PE）或磷脂酰丝胺（PS）则没有此效果（图3A）。

POPG的抑制作用呈剂量依赖性（图3B），与LPS信号的竞争性拮抗一致。图3 磷脂和VPA处理对上皮细胞中IL8表达的调节。图注完整显示。图查看器。WT和PGS1+/? A549细胞的炎症通过向培养基中添加1 μg/mL LPS诱导。

(A) 在有无外源磷脂的情况下，LPS刺激细胞的IL8表达。(B) 使用递增浓度POPG处理的细胞中IL8的表达。(C) 经VPA预处理后LPS刺激细胞的IL8表达，(D) 分泌的IL-8，以及(E) 细胞内IL-8。数据代表至少两次独立实验的均值±标准差（显示个体数据点），并以未处理的WT细胞（0 mM VPA）为标准化基准。统计显著性采用单因素方差分析后接Holm-?idák多重比较检验进行评估。星号表示与未处理的WT细胞相比存在显著差异；井号表示同一细胞系内不同VPA浓度之间的显著差异。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，##p < 0.01，###p < 0.001。CL，心磷脂；DPPG，二棕榈酰磷脂酰甘油；PA，磷脂酸；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；VPA，丙戊酸。

接下来，我们检测了线粒体PG生物合成减少如何影响上皮炎症信号。未刺激的PGS1+/?细胞的IL8 mRNA基线水平高于WT A549细胞。尽管存在这种情况，PGS1+/?细胞中LPS诱导的IL8上调较WT细胞减少了约50%（图3C；图S5A和S5B）。相比之下，在基线条件和LPS刺激条件下，两种细胞系之间的IL-8蛋白分泌量无显著差异（图3D；图S5C）。为补充分泌IL-8的分析，我们定量了细胞内IL-8蛋白水平。与WT细胞相比，LPS刺激的PGS1+/?细胞中细胞内IL-8蛋白呈小幅增加（图3E）。因此，PGS1杂合缺失改变了IL8转录与IL-8蛋白应答之间的协调关系。

随后，我们测试了VPA预处理对上皮炎症反应的影响。单独使用VPA处理可增加基线IL8表达（图S5B）。LPS刺激后，VPA预处理的WT和PGS1+/?细胞中IL8 mRNA水平分别较未处理细胞升高约2倍和2.5倍。虽然0.06 mM VPA在细胞内IL-8水平降低的情况下仍增加了IL-8分泌，但0.6 mM VPA预处理同时增加了细胞内和分泌的IL-8水平（图3D和3E）。

综合而言，这些数据表明特定脂质物种（POPG、PI和CL）能有效抑制A549细胞中LPS诱导的IL8 mRNA表达，而VPA诱导的代谢重塑增强了细胞对炎症刺激的应答能力，导致IL-8产生增加。

## 活化单核细胞中炎症的调节

鉴于线粒体PG生物合成的扰动（通过PGS1杂合缺失和/或VPA处理）改变了A549细胞的脂质分泌输出（图2）并调节了上皮炎症指标（图3），我们进一步测试了上皮条件培养基是否影响巨噬细胞样炎症反应。对于U937巨噬细胞，我们使用PMA将单核细胞分化为巨噬细胞样细胞。从WT和PGS1+/? A549细胞中收集经VPA（0、0.06或0.6 mM）处理48 h后的条件培养基。这些培养基被转至PMA分化的U937细胞中，随后用0.1 μg/mL LPS刺激6 h（图4）。

图4 A549上皮细胞的条件培养基调节U937巨噬细胞样细胞的炎症反应。图注完整显示。图查看器。WT和PGS1+/? A549细胞经0、0.06或0.6 mM VPA预处理48 h后收集条件培养基，经离心澄清后施加于PMA分化的U937细胞。随后用0.1 μg/mL LPS诱导炎症6 h。

(A) U937细胞中IL6、IL8和TNF的相对mRNA表达。(B) 与条件培养基孵育后U937上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白水平。(C) 在含条件培养基提取脂质的条件下，LPS刺激的U937细胞中IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白水平。数据代表至少两次独立实验的均值±标准差（显示个体数据点），并以新鲜培养基培养的U937细胞为标准化基准。统计显著性采用单因素方差分析后接Holm-?idák多重比较检验进行评估。星号表示与新鲜培养基中U937细胞的显著差异；井号表示同一条件培养基内不同VPA浓度之间的显著差异。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，#p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001。VPA，丙戊酸。

VPA处理的WT和PGS1+/?上皮细胞的条件培养基对U937巨噬细胞表现出浓度依赖性的抗炎效果（图4A和4B）。为检测脂质的特异性贡献，将条件培养基中提取的脂质施加于U937巨噬细胞。对来自未处理（0 mM VPA）WT A549细胞条件培养基的典型脂质提取物进行LC-MS分析，证实了主要磷脂类别的存在，包括约2.3 μg PC、50 ng总PG和0.96 ng POPG。这些脂质提取物部分重现了完整条件培养基的抗炎效果。来自VPA处理A549细胞的脂质同样降低了IL-6和TNF-α，而IL-8分泌呈小幅增加，与IL8转录升高一致（图4C；图S6A）。为确定这些效应是否可由定义的脂质物种重现，将外源磷脂施加于LPS刺激、PMA分化的U937细胞。CL、POPG和PI以浓度依赖方式降低促炎基因表达，较高脂质浓度产生更强的抑制效果（图S6B和S6C）。这些发现支持脂质在介导上皮分泌组抗炎活性中的主要作用。

为评估从A549细胞释放的IL-8是否对条件培养基的效应有所贡献，将重组IL-8添加至LPS刺激的U937巨噬细胞中。所获得的细胞因子谱与条件培养基诱导的谱不同，表明单独IL-8无法重现上皮条件培养基所观察到的抑制效应（图S7A和S7B）。最后，残余VPA的贡献似乎很小。仅在IL-8上观察到与条件培养基的微弱相似性，而IL-6和TNF-α的应答与VPA直接暴露不相关（图S7D–S7F）。

综上所述，这些数据表明A549条件培养基可抑制PMA分化的U937巨噬细胞样细胞中LPS诱导的炎症输出。分泌的上皮脂质对此活性有所贡献，因为脂质提取物可重现部分效果，而条件培养基中的其他成分可能对于完全抑制是必需的。

## 日本鹌鹑CAM中炎症的调节

虽然A549上皮细胞和PMA分化的U937单核细胞的实验为脂质介导的炎症调节提供了宝贵见解，但这两个体系均代表简化的体外模型。为在更生理相关的背景下评估这些效应，我们使用离壳培养的日本鹌鹑胚胎血管丰富的CAM作为局部炎症的体内模型。

我们首先建立了可重复性触发炎症同时保持胚胎存活的LPS条件。在浓度达800 μg/mL时胚胎存活未受显著影响，而1600 μg/mL将存活率降至约50%（图S8A）。在100 μg/mL LPS时已可观察到组织学改变，包括细胞数量增加、基质水肿、绒毛上皮增厚以及免疫细胞在间质中的积累（图5；图S8A）。相比之下，定量血管化参数（血管面积、血管长度、分支点和平均血管厚度）在这些条件下基本保持不变（图S8B）。

图5 VPA和POPG调节鹌鹑CAM中的炎症反应。图注完整显示。图查看器。鹌鹑CAM经0、0.06或0.6 mM VPA预处理24 h。随后通过100 μg/mL LPS或100 μg/mL LPS加25 μM POPG补充诱导炎症2 h。

(A) 硅胶圈定义区域内CAM组织中IL6、IL8和TLR4的相对mRNA表达。数据以未处理CAM（0 mM VPA）为标准化基准，显示至少五次独立实验的均值±标准差（显示个体数据点）。统计显著性采用单因素方差分析后接Holm-?idák多重比较检验进行评估。星号表示与未处理CAM的显著差异；井号表示不同VPA浓度之间的显著差异。(B) 苏木精-伊红染色的代表性组织学切片。比例尺，100 μm。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，###p < 0.001。

基于这些初步实验，我们选择100 μg/mL LPS用于后续分析。我们随后评估了炎症基因表达，重点关注IL6、IL8和TLR4。LPS诱导了所有三个转录本（图S9）。两种测试浓度的VPA预处理均显著减弱了这一诱导（图5A），其中0.06 mM效果最强，使IL6、IL8和TLR4表达分别降低72%、76%和46%。由于POPG是一种表面活性剂相关磷脂，我们测试了POPG补充是否在此组织模型中引发类似效果。为确定有效POPG浓度，我们在LPS刺激条件下比较了10、25和50 μM POPG。在25 μM POPG时观察到IL6、IL8和TLR4表达最强且最一致的抑制（图S9A），因此选择用于后续分析。与抑制效果一致，POPG在离壳CAM模型中以与VPA相似的幅度降低了LPS诱导的炎症基因表达（图5A；图S9B）。

组织学评估进一步支持了转录数据（图5B）。虽然LPS处理的CAM表现出明显的结构破坏，包括上皮增厚、显著水肿和广泛的间质细胞浸润，但这些病理特征在VPA预处理或POPG补充的CAM中显著减少。在这些样本中，绒毛上皮更薄且更连续，间质细胞数量减少，整体组织结构保存更好（图5B）。

综合而言，这些结果表明VPA预处理和POPG补充可减轻鹌鹑CAM模型中LPS诱导的炎症基因表达和组织学炎症特征，将细胞体系的观察延伸至更生理相关的体内模型。

## 讨论

VPA是一种多效性化合物，在不同模型体系中影响线粒体代谢、脂质稳态和细胞器功能。在此，我们使用A549细胞证明，VPA药理学处理和/或PGS1部分基因缺失重塑了线粒体PG稳态、细胞生物能学和磷脂分泌。这些变化伴随着上皮细胞炎症指标的改变，将线粒体PG生物合成置于代谢、脂质释放和炎症信号之间的功能性交汇点。

在A549细胞中，VPA降低了PGS1活性，而细胞内PG水平升高（图1）。这种表观分离支持PG丰度的稳态调控，与其他系统报道的PG/CL通路中的调节反馈一致。线粒体磷脂组成的改变已知可修饰膜性质并影响膜关联蛋白的活性和相互作用，包括呼吸链复合物。综合而言，这些观察支持PG稳态在协调线粒体功能与细胞脂质代谢中的更广泛作用。与PG稳态的重要性一致，PGS1+/?细胞表现出整体细胞磷脂池减少，主要磷脂类别的相对分布基本保持不变，CL是唯一显著改变的类别（图S2）。这些发现表明PG/CL生物合成通路的部分损伤主要影响磷脂丰度而非整体磷脂组成。

鉴于线粒体脂质代谢对细胞磷脂稳态有贡献，我们进一步询问VPA诱导的线粒体PG代谢变化是否反映在表面活性剂相关磷脂的分泌中。质谱分析证实A549细胞分泌的PG和PC物种与天然人ATII细胞中发现的不同，与早期观察一致。VPA选择性地改变了这种分泌输出，在增加总PC分泌的同时重塑PG的分子种类组成而不改变其总体丰度（图2）。这些数据表明药理学扰动可以在肺泡上皮模型A549中偏移PG分子种类谱，从而将线粒体脂质合成与上皮分泌组成变化联系起来。值得注意的是，VPA增加了POPG的相对丰度，这是一种具有已知抗炎特性的PG物种，其通过竞争LPS与CD14-MD2-TLR4复合物结合来介导。这种转变表明PG谱向更"表面活性剂样"且可能具有免疫调节性的方向部分移动，即使是在具有非生理基线脂质组的癌来源上皮模型中也是如此。

相比之下，在PGS1+/?细胞中，VPA诱导的表面活性剂相关脂质和PG物种的重塑基本缺失（图2；图S4）。尽管治疗性VPA几乎完全恢复了细胞内磷脂水平（图1B和1C；图S2），分泌的磷脂谱仍基本不变，表明仅恢复细胞内磷脂池不足以使上皮磷脂分泌正常化。此外，VPA在此背景下标准化了分泌PG的量，但未能诱导PG分子种类的定性变化（图2C）。

这些结果表明，完整的线粒体PG生物合成能力有助于VPA诱导的PG分泌组重塑。PG数量与分子组成之间的区别进一步提示，PGS1活性降低可能限制了特定PG分子种类的可用性，而非简单地决定总PG水平。与此同时，线粒体对PG的需求以维持CL合成和呼吸功能，这可能进一步限制可用于表面活性剂分泌的PG池。与此解释一致的是，酵母研究已表明，当PG周转受到干扰时，线粒体内PG与线粒体外积累的PG在酰基组成上存在差异，这支持了线粒体需求可以塑造可被线粒体外部池获取的PG分子特征的概念。线粒体脂质稳态是炎症信号传导的已知调节因子，其中CL影响呼吸复合物II的稳定性和细胞因子产生。由于CL合成缺陷常与PG积累同时出现，PGS1+/-模型使我们能够在线粒体磷脂生物合成受损的条件下评估上皮炎症反应。在这些条件下，PGS1+/-细胞表现出升高的基础IL8 mRNA表达，但对LPS的转录反应减弱，尽管IL-8分泌相当且细胞内IL-8蛋白水平轻度升高（图3C-3E；图S5）。这些发现表明，在PGS1+/-细胞中，IL8转录本丰度与细胞内或细胞外IL-8蛋白水平之间存在解偶联。这种解偶联与转录后调控一致，包括mRNA稳定性和翻译的差异，这在此前描述的细胞应激和炎症激活条件下已有报道。尽管控制IL8转录、mRNA稳定性和翻译的机制已被广泛研究，但关于IL-8蛋白周转和分泌如何贡献于细胞外IL-8蛋白水平调控的了解相对较少。有趣的是，VPA增强了LPS诱导的IL8表达、细胞IL-8蛋白水平和IL-8分泌，同时在PGS1+/-细胞中恢复了线粒体PG和CL水平（图1A-1F）。综合来看，这些发现支持了线粒体磷脂稳态与上皮炎症应答之间的关联，尽管连接这些过程的机制仍有待确立。

为检验上皮脂质重塑是否影响巨噬细胞激活，我们将WT和PGS1+/- A549细胞的条件培养基应用于U937来源的巨噬细胞，并一致性地观察到促炎标志物表达降低（图4A和4B）。将完整条件培养基与相应的脂质提取物进行比较发现，脂质部分重现了这种抑制效应（图4C；图S6A）。因此，分泌脂质对巨噬细胞调节有贡献，但条件培养基中的其他组分可能也参与其中。重要的是，两种上皮背景下的脂质提取物产生了相似的应答，提示PG分子种类的差异本身不太可能是这种实验设置中巨噬细胞抑制的主要决定因素。这一结论得到条件培养基中检测到的极低PG浓度（约10 ng/mL）的进一步支持，该浓度比外源施加的POPG浓度（25 μM；约19 μg/mL）和天然肺表面活性剂中PG浓度（约5 mg/mL）低数个数量级。因此，条件培养基的抑制活性不太可能仅由所检测到的PG浓度来解释，而可能反映了多种脂质类别和/或脂质相关因子的综合效应。

为克服简化体外系统的局限性并检验组织水平的相关性，我们使用日本鹌鹑胚胎的血管膜作为体内模型。CAM在功能和形态上与肺组织相似，已被用作研究肺部健康问题的模型。在此系统中，VPA和外源施加的POPG均显著减弱了LPS诱导的IL6、IL8和TLR4表达，并保持了组织结构（图5）。虽然CAM不能再现肺特异性结构或表面活性剂回收，但它提供了一个多细胞、血管化的炎症环境，可以在其中并排评估药物调节（VPA）和脂质补充（POPG）。类似的保护性效应已在ARDS和病毒性肺炎的体内模型中报道，支持了靶向肺部炎症中表面活性剂脂质组成的转化医学相关性。

总之，我们的结果突出了线粒体PG生物合成作为影响上皮代谢、脂质分泌和炎症信号的杠杆。VPA并非作为均匀的抗炎剂发挥作用，而是表现出情境依赖性效应：在肺泡上皮细胞中，它增加了炎症应答性（特别是IL8），而在巨噬细胞样细胞和CAM模型中，它减弱了LPS驱动的炎症输出（图6）。这些情境依赖性应答构成了我们提出的VPA介导的上皮-免疫信号调节模型的基础。总体而言，我们的发现将线粒体脂质稳态和表面活性剂相关磷脂定位为炎症性肺病中治疗性调节的可及节点。

图6 提出的VPA依赖性上皮-巨噬细胞炎症信号调节模型

使用A549细胞作为ATII上皮细胞的模型，我们的数据表明，炎症刺激（进一步通过VPA治疗增强）增加了IL-8的产生，从而增强了单核细胞向炎症组织募集的趋化信号。在募集之后，暴露于LPS的单核细胞向巨噬细胞样表型分化；然而，在VPA存在的情况下，它们对关键促炎介质的产生被减弱。这支持了一种模型，即VPA促进免疫细胞在炎症位点的积累，同时减弱巨噬细胞的炎症输出， potentially shifting the local immune response toward a more controlled, regulated state.

研究的局限性

应承认本研究的几项局限性。我们依赖癌瘤来源的上皮细胞和简化的免疫模型，并且未能阐明将线粒体PG合成与脂质转运和分泌联系起来的细胞内机制。此外，VPA具有多效性，不能完全归因于线粒体脂质代谢。尽管如此，遗传学、药理学和脂质补充数据的结合支持了一种模型，即线粒体脂质稳态调节分泌组成，进而调节跨细胞类型和组织水平的炎症信号传导。

资源可用性

主要联系人

有关进一步信息和资源请求应致函并将由主要联系人Mária Balá?ová（[e-mail]）处理。

材料可用性

本研究中生成的PGS1+/- A549细胞系在合理请求的情况下可从主要联系人处获取。

数据和代码可用性

- 脂质质谱数据已存于MassIVE，公开访问编号为MassIVE: MSV000101425（https://doi.org/10.25345/C5DB7W44T）。
- 本研究未报告原始代码。
- 重新分析本研究报道数据所需的任何附加信息可在请求时从主要联系人处获取。

致谢

本研究由斯洛伐克共和国教育、科学、研究和体育部长官科学资助署和斯洛伐克科学院（VEGA；项目编号2/0012/26和2/0081/25）、斯洛伐克研究与发展署（APVV；合同编号APVV-20-0129和VV-MVP-24-0335）、斯洛伐克科学院（资助SAS-NSTC/JRP/2023/773/LipAI）以及捷克共和国资助署（GA?R；资助26-22338S）资助。图6使用BioRender.com制作。

作者贡献

D.I.执行实验、分析数据并起草论文。P.S.生成PGS1+/- A549细胞并进行相关分析。K.A.和F.D.进行质谱分析。M. Mariana、M. Mailinda、Z.I.和B.B.负责CAM实验，包括RT-PCR和组织学。B. Miroslav进行Seahorse代谢测定。B.S.和F.I.测量分泌的细胞因子。H.H.Y.-H.和C.I.参与数据分析。F.D.资助了突变细胞系的生成和表征。B. Mária构思并监督了本研究，获取资金，并监督方法学、可视化、验证和论文撰写。所有作者审阅并批准了最终论文。

利益声明

作者声明不存在利益冲突。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符

抗体
小鼠OxPhos人WB抗体混合套装 | Invitrogen | Cat# 45-8099; RRID: AB_2533835
羊抗小鼠IgG（H+L），HRP偶联 | Merck | Cat# A4416; RRID: AB_258167

化学品、肽和重组蛋白
丙戊酸钠盐（VPA） | Sigma-Aldrich | Cat# P4543
大肠杆菌O111:B4脂多糖 | Merck | Cat# L4130
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | Cat# 11668027
佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA） | Santa Cruz | Cat# sc-3576A
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)（POPG） | Avanti Polar Lipids | Cat# 840457
心磷脂（CL） | Avanti Polar Lipids | Cat# 710335
二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG） | Avanti Polar Lipids | Cat# 840455
磷脂酸（PA） | Avanti Polar Lipids | Cat# 840101
磷脂酰胆碱（PC） | Avanti Polar Lipids | Cat# 840051
磷脂酰乙醇胺（PE） | Avanti Polar Lipids | Cat# 840021
磷脂酰肌醇（PI） | Avanti Polar Lipids | Cat# 840042
磷脂酰丝氨酸（PS） | Avanti Polar Lipids | Cat# 870336
重组人IL-8 | PeproTech | Cat# 200-08
SPLASH脂质组质谱标准品 | Avanti Polar Lipids | Cat# 330707
[14C]甘油-3-磷酸 | American Radiolabeled Chemicals | Cat# ARC 0316
CDP-二酰甘油（CDP-DAG） | Avanti Polar Lipids | Cat# 870510

关键商业检测
GeneJET RNA纯化试剂盒 | Thermo Scientific | Cat# K0732
Aurum总RNA迷你试剂盒 | Bio-Rad | Cat# 7326820
LunaScript RT SuperMix试剂盒 | New England Biolabs | Cat# E3010L
FastStart Essential DNA Green Master | Roche | Cat# 06402712001
人IL-6 ELISA试剂盒 | PeproTech | Cat# 900-T16
人IL-8 ELISA试剂盒 | PeproTech | Cat# 900-T18
人TNF-α ELISA试剂盒 | PeproTech | Cat# 900-T25
Bradford蛋白检测 | Bio-Rad | Cat# 5000006
DC蛋白检测 | Bio-Rad | Cat# 5000111
无染色蛋白标记试剂 | Invitrogen | Cat# A44449
SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | Cat# 34580
Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | Cat# 103015-100

沉积数据
原始和分析数据 | 本文；MassIVE | MassIVE: MSV000101425; https://doi.org/10.25345/C5DB7W44T

实验模型：细胞系
人：A549肺上皮细胞（WT） | ATCC | ATCC CCL-185
人：A549肺上皮细胞（PGS1+/-） | 本文 | N/A
人：U937单核细胞系 | ATCC | ATCC CRL-1593.2

实验模型：生物体/品系
日本鹌鹑（Coturnix japonica）：离壳CAM模型 | N/A | N/A

寡核苷酸
用于RT-qPCR的引物，见表S1 | 本文 | N/A

重组DNA
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 质粒#42230

软件和算法
Quantity One v4.5.2 | Bio-Rad | N/A
Analyst | SCIEX | N/A
SCIEX OS v1.6.1 | SCIEX | N/A
SigmaPlot 14 | Inpixon | N/A
GraphPad Prism v10 | GraphPad Software | N/A
IKOSA Prisma | Kolaido | N/A
BioRender | BioRender | https://www.biorender.com
CRISPOR | Concorded and Haeussler | http://crispor.org

其他
Seahorse XF Pro分析仪 | Agilent Technologies | N/A
ExionLC系统 | SCIEX | N/A
QTRAP 6500+质谱仪 | SCIEX | N/A
Acquity BEH C8柱，2.1 × 100 mm，1.7 μm | Waters | N/A
AriaMx实时PCR系统 | Agilent Technologies | N/A
硅胶60 TLC板 | Merck | Cat# 1.05553
Kapa 2000光学显微镜 | Kvant | N/A
EOS 6D Mark II相机 | Canon | N/A

实验模型和受试者细节

WT和PGS1+/- A549细胞培养

A549人肺泡基底上皮细胞（WT和PGS1+/-），最初来源于一名女性患者的肺腺癌，培养在低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，补充10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素/链霉素。细胞在37°C、5% CO?的加湿培养箱中维持。

除非另有说明，WT和PGS1+/-细胞以每90 mm组织培养皿2 × 10?个细胞（8 mL培养基中2.5 × 10?个细胞/mL）接种，以静态单层培养7天，每2-3天更换培养基。条件培养基在无血清培养基中培养2天后收集。

U937细胞培养和分化

U937人单核细胞，最初来源于一名男性患者，培养在RPMI-1640中，补充10%确定FBS和100 U/mL青霉素/链霉素，在37°C、5% CO?下培养。通过以每90 mm培养皿8 × 10?个U937细胞（8 mL培养基中1 × 10?个细胞/mL）接种并用PMA（10 ng/mL）处理48小时来诱导分化。通过PBS洗涤去除非粘附细胞。粘附细胞在新培养基中培养24小时后进行刺激。

细胞系鉴定和支原体检测

A549 WT和U937细胞系从ATCC获取（A549，CCL-185；U937，CRL-1593.2），并在我们的实验室未进行独立鉴定。A549细胞的PGS1+/-基因型通过DNA测序涵盖靶向PGS1变异的基因组区域来确认。细胞进行了支原体污染检测，并确认为无支原体。

离壳CAM模型

离壳日本鹌鹑（Coturnix japonica）CAM模型按照我们之前报道的方法准备。胚胎在37.5°C和60-70%湿度下维持。在胚胎第8天（ED8），无菌硅胶环（直径6 mm）放置在CAM上以界定处理区域。未确定胚胎性别；因此，无法评估潜在的性别相关效应。

伦理声明

使用日本鹌鹑CAM的实验在ED10或之前进行。根据欧盟指令2010/63/EU关于保护用于科学目的的动物的规定，在禽类胚胎发育最后三分之一之前进行的实验不被视为动物实验，因此不需要机构伦理审批或监督。所有程序均按照适用指南和法规进行。

方法细节

低活性PGS1突变细胞系的生成

为生成低活性PGS1突变体（PGS1+/-），我们采用了CRISPR/Cas9基因编辑系统。单引导RNA（sgRNA）使用CRISPOR设计工具设计，靶向PGS1基因的外显子2，如下所示：sgRNA-F: 5′-caccg AGTCTCCAGTTCTCACGTTA-3′ 和 sgRNA-R: 5′-aaacTAACGTGAGAACTGGAGACT-3′。sgRNA寡核苷酸退火并克隆到BbsI消化的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒中（质粒#42230，Addgene）。使用Lipofectamine 2000（#11668027，Invitrogen）将1 μg pX330-sgRNA-PGS1转染至A549细胞。48小时后，转染细胞被单独接种到96孔板上。单细胞克隆被扩增，并通过PCR分析使用以下引物进行验证：PGS1_GT_F: 5′-AGCTGTTCCCCAGGTCAC-3′ 和 PGS1_GT_R: 5′-CCTCCCAAAGTACTGGCCA-3′，Sanger测序和表型表征。全长PGS1转录本缺失通过qRT-PCR评估（引物序列见表S1）。

处理、刺激和样本收集

对于上皮预处理，WT和PGS1+/-细胞用VPA（0、0.06或0.6 mM）培养48小时。

所选用的 VPA 浓度基于治疗性血清范围（0.346–0.693 mM），以及我们此前显示亚治疗浓度具有生物活性的发现。随后，用磷脂囊泡（POPG；10、25 或 50 μM，分别对应约 7.7、19.3 和 38.5 μg/mL）、大肠杆菌 O111:B4 的 LPS（Merck L4130，1 μg/mL）（图 S10A 和 S10B）或预混组合刺激细胞。2 小时后收获细胞，用 PBS 洗涤，并于 ?20°C 保存以供下游分析。收集条件培养基用于 ELISA、脂质质谱分析和脂质提取物。

对于巨噬细胞样实验，使用如上所述处理的 WT 和 PGS1+/? A549 培养物产生条件培养基。PMA 分化的 U937 细胞在存在条件培养基和/或从条件培养基制备的脂质提取物的情况下，用 LPS（0.1 μg/mL）（图 S10C–S10E）进行刺激。对于外源性磷脂补充实验，磷脂囊泡以 25 μM 或剂量反应分析中指示的浓度添加（图 S6B 和 S6C）。6 小时后收获细胞和培养基，并于 ?20°C 保存。

对于 CAM 实验，VPA（生理盐水中 0、0.06 或 0.6 mM）施用 24 小时。在孵化第 9 天（ED9），将 LPS（100 μg/mL；80 μL 中 8 μg）、POPG（25 μM；80 μL 中 1.54 μg）或其组合添加到同一区域，2 小时后用于 RT-PCR 分析（图 S9F），24 小时后用于组织学检查。

条件培养基中的脂质提取
使用氯仿：甲醇：HCl（60:30:0.2，v/v/v）从 5 mL A549 细胞条件培养基中提取脂质，30°C 处理 1 小时。加入 0.1 M MgCl2 诱导相分离，随后涡旋并孵育 30 分钟。样本离心（460 g，10 分钟）。收集有机相，干燥，并在培养基中重悬。脂质悬浮液经超声处理形成囊泡并施加于 U937 细胞。提取物按原始条件培养基体积标准化，确保所有实验组施加源自等效体积条件培养基的脂质提取物。

蛋白质定量与标准化
记录每个培养皿的总细胞蛋白（Bradford 法；Bio-Rad），以记录培养扩增情况，并在指定处用于标准化。对于 Seahorse XF 测量，使用 DC 蛋白测定法（Bio-Rad）测定蛋白含量。

RNA 提取与定量实时 PCR
使用 GeneJET RNA 纯化试剂盒（Thermo Scientific）分离人细胞总 RNA，使用 AURUM 总 RNA mini 试剂盒（Bio-Rad）分离环区内 CAM 组织的鹌鹑总 RNA。每份样本 1 微克 RNA 使用 LunaScript RT SuperMix 试剂盒（New England Biolabs）进行逆转录。使用 AriaMx 实时 PCR 系统（Agilent Technologies）和 FastStart Essential DNA Green Master（Roche）进行 RT-PCR。人类样本的基因表达水平相对于 hACTB 和 hGAPDH 标准化，CAM 组织相对于 qGAPDH 标准化。报告的值代表使用 ΔΔCt 方法计算的相对表达。引物序列列于表 S1。

酶联免疫吸附测定（ELISA）
按照制造商的说明，使用 ELISA 试剂盒（PeproTech）测量细胞培养上清液中 IL-6、TNF-α 和 IL-8 的浓度。为测定细胞内 IL-8 水平，细胞用 PBS 洗涤两次，使用 Dounce 匀浆器匀浆，并使用 ELISA 分析等量的总蛋白。在指定波长测量吸光度。细胞因子浓度根据试剂盒提供的标准品生成的标准曲线确定。

CAM 组织学
在 ED9，切除 CAM 组织并在 4% 多聚甲醛中固定。样本通过梯度乙醇系列脱水并包埋在石蜡中。24 小时后，组织上覆盖 Paraplast Plus（Sigma-Aldrich）并包埋在铸造模具中。使用切片机（Auxilab S.L.）从每个样本的三个不同区域切割连续切片（5 μm），并用苏木精和伊红染色（Bamed）。使用 Kapa 2000（Kvant）光学显微镜和 Canon EOS 6D Mark II 相机在 8 倍、20 倍和 40 倍放大下拍摄组织切片图像。

PGS1 活性测定
如前所述，通过测量放射性标记底物掺入氯仿溶性磷脂中来评估 PGS1 酶活性。全细胞匀浆（75 μg 蛋白）在 120 μL 中，于 37°C 在 50 mM MES-HCl（pH 7.0）、0.1 mM MnCl2、0.083 mM CDP-DAG、1 mM Triton X-100 和 0.02 mM [14C] 甘油 -3- 磷酸（40,000 DPM）中孵育 60 分钟。用氯仿：甲醇：HCl（100:100:0.6，v/v/v）终止反应，随后用水进行相分配。收集有机层，蒸发，并使用氯仿：甲醇：乙酸：水（75:45:3:1，v/v/v/v）作为展开溶剂，在 Silica Gel 60 TLC 板上分离脂质产物。放射性标记的 PG 通过磷光成像可视化，并使用 Quantity One 软件（Bio-Rad）进行定量。

磷脂中无机磷酸盐的测定
使用氯仿：甲醇：HCl（60:30:0.2，v/v/v）从 1.8 mg 细胞蛋白中提取磷脂，30°C 处理 1 小时，随后加入 0.1 M MgCl2，涡旋，孵育 30 分钟，并离心（460 g，10 分钟）。脂质通过 2D-TLC 分离（氯仿：甲醇：氨：水 66:27:3:0.8 和氯仿：甲醇：乙酸 65:25:8，v/v/v），用碘蒸气显色，如所述刮取进行分析。简言之，刮取的硅胶在 180 °C 用 H2SO4:HClO4（9:1，v/v）灰化 30 分钟，在 105°C 与 ANSA-钼酸盐试剂孵育 30 分钟，并在 830 nm 测量吸光度。磷酸盐含量根据 K2HPO4 标准曲线确定，并相对于总蛋白标准化（μg Pi/mg 蛋白）。

Seahorse 线粒体测定
WT 和 PGS1+/? A549 细胞以每孔 4 × 103 个细胞的密度接种在 Seahorse XF Pro M 微孔板中，培养 7 天。将培养基更换为含有 10 mM 葡萄糖、2 mM L- 谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸的 Seahorse XF DMEM（pH 7.4），并将细胞在 37°C 平衡 1 小时。使用 Seahorse XF Pro Analyzer 测量耗氧率和 ECAR（胞外酸化率）。使用寡霉素（1.25 μM）、FCCP（1 μM）和鱼藤酮 + 抗霉素 A（1 μM + 1.25 μM）探测线粒体功能。数据相对于每孔测定的蛋白含量进行标准化。

免疫印迹分析
蛋白在 12% SDS-PAGE 凝胶上分离并转印到硝酸纤维素膜上。膜在 TBS（50 mM Tris-HCl，pH 8.0；150 mM NaCl）中的 5% 牛奶中封闭 1 小时，并在 4°C 下与人线粒体氧化磷酸化抗体鸡尾酒（1:500；Invitrogen）孵育过夜。HRP 偶联的二抗（抗小鼠，1:30,000；Merck）使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物（Thermo Scientific）进行检测。使用 No-Stain 蛋白标记试剂（Invitrogen）将信号强度相对于总蛋白进行标准化。

靶向脂质组学分析
WT 和 PGS1+/? A549 细胞在 DMEM 中培养 7 天。在收集培养基前两天，将含 10% FBS 的培养基更换为无 FBS 培养基。收集培养基，460 g 离心 5 分钟，并储存于 ?20°C 直至提取脂质。使用如所述的两相 MTBE/甲醇方案从细胞培养基中提取脂质。样本在冰上解冻，涡旋，并将 100 μL 转移至 2 mL 管中。加入 SPLASH Lipidomix 内标（Avanti Polar Lipids）（10 μL），随后涡旋并在冰上孵育 15 分钟。使用超纯水而不加内标平行制备空白样本。依次加入冷甲醇（375 μL）和 MTBE（1,250 μL）并涡旋，样本在 4°C 下带轨道摇动（32 rpm）孵育 1 小时。加入 375 μL H2O 诱导相分离，随后在 4°C 孵育 10 分钟。离心后（10 分钟，4°C，1000 g），收集 1 mL 上层有机相并在室温真空下蒸发（70 mbar）。干燥提取物储存于 ?80°C 直至分析。在进行基于 LC-MS 的脂质组学分析之前，提取物在 100 μL 异丙醇中重悬并涡旋，并将每个样本的 10 μL 分样混合以生成质量控制样本（QC）。使用先前描述的靶向脂质组学 LC-MS/MS 方法分析脂质，色谱和质谱条件如前所述。使用配备 Acquity BEH C8 2.1 mm，100 mm，1.7 μm 色谱柱（Waters）的液相色谱 ExionLC 系统（Sciex）联用三重四极杆质谱仪 Sciex QTrap 6500+（Sciex）。分别使用 Analyst（Sciex）和 SCIEX OS 软件（Sciex，版本 1.6.1）进行数据采集和处理。结果以峰面积表示，并相对于细胞蛋白含量和培养基体积进行标准化。

定量与统计分析
统计分析在 SigmaPlot 14（Inpixon）中进行。使用 D'Agostino–Pearson 检验评估数据分布的正态性。对于多组间比较，使用单因素 ANOVA，随后进行 Holm–?idák 多重比较程序。预计划比较按图例指示进行。除非另有说明，n 表示独立生物学重复（不同天处理独立接种的培养物）。图表使用 GraphPad Prism 10（GraphPad Software, San Diego, CA）制作，显示均值 ± 标准差。p 值 <0.05 被认为具有统计学显著性。

补充信息（1）PDF (1.83 MB) 文件 S1。图 S1–S10，表 S1 和数据 S1