双调蛋白通过微囊泡调控线粒体递送与免疫调节

《iScience》：Amphiregulin shapes mitochondrial delivery and immune modulation by microvescicles

　　

# 要点

• LPS重塑了AEC来源的MV蛋白质组，富集了101种蛋白，包括AREG
• AREG沉默减少了AEC来源MV中的线粒体货物
• AREG沉默损害了MV介导的向免疫细胞的线粒体转移
• 来自AREG沉默AEC的MV无法抑制PBMC增殖和NFAT激活

# 摘要

羊膜上皮细胞（AECs）发挥强效的旁分泌免疫调节功能，但炎症信号是否增强其细胞外囊泡（EVs）的生物学活性仍不清楚。为回答这一问题，我们利用无标记蛋白质组学和基因学方法，表征了基础状态和脂多糖（LPS）刺激条件下绵羊AECs的分泌组。炎症刺激深刻重塑了微囊泡（MVs）的货物，富集了101种与代谢和调控通路相关的蛋白。在前5%的高丰度蛋白中，有两种免疫相关蛋白，包括双调蛋白（AREG），这是一种参与免疫调节和组织重塑的表皮生长因子受体配体。AREG沉默减少了AREG阳性MV，并与线粒体货物含量的改变及向免疫细胞的转移相关。因此，siAREG-MV在PBMC和T细胞中的摄取减少，导致对增殖和CD3依赖性NFAT激活的抑制作用减弱。外源性AREG部分恢复了这些功能。总之，这些发现确定了炎症驱动的AREG信号传导是增强AEC来源MV免疫调节潜力的关键机制，对于无细胞免疫疗法具有重要意义。

## 图解摘要

# 引言

组织损伤的免疫反应在早期恢复中发挥着关键作用，通过协调细胞修复机制来恢复稳态。其成功取决于精确的时空调控；这种平衡的破坏可能导致慢性炎症、纤维化或自身免疫病。这些失调代表了再生结果的主要障碍，强调了对健康和疾病中免疫-组织相互作用的更深入理解的必要性。

在此背景下，研究人员寻求有效调节免疫反应的治疗策略。羊膜上皮细胞（AECs）因其干细胞样可塑性和强效免疫调节功能而成为有前途的候选者。AECs来源于胎盘最内层，结合了胚胎干细胞和成体干细胞的特征，并分泌免疫调节分子以促进组织修复。

AEC条件培养基（AEC-CM）通过多种机制广泛抑制免疫细胞活化，包括抑制外周血单个核细胞（PBMCs）增殖、调节抗原呈递细胞（尤其是巨噬细胞和树突状细胞）的募集、成熟和分化，以及调节T细胞活化。这种无细胞系统作为治疗工具，递送包括生长因子、细胞因子和细胞外囊泡（EVs）在内的复杂生物活性分子货物，影响免疫细胞行为。

在此网络中，双调蛋白（AREG）已成为调节组织修复和免疫调节的关键效应分子。近期研究表明，AECs的AREG分泌受COX-2/PGE2/EP4轴调控，且AREG通过TGF-β信号传导参与免疫抑制。功能上，AREG抑制PBMC活化，并在T细胞中抑制NFAT信号，这是一种由脂多糖（LPS）等炎症刺激触发的反馈调节方式。

除了AREG，AEC来源的微囊泡（AECMV，直径100–1,000 nm的EV亚类）也通过转移富含细胞器的生物活性货物（包括功能性线粒体、脂质和内质网）参与AEC驱动的旁分泌免疫调节。通过巨胞饮作用内化后，AECMV在PBMC和Jurkat细胞中诱导线粒体超极化和caspase-3激活，最终抑制免疫活化并促进免疫稳态。

虽然AREG和AECMV的独立免疫调节作用已有充分记录，但AREG是否作为AECMV的成分发挥功能作用仍不清楚。我们采用蛋白质组学方法发现，AREG被选择性纳入AECMV中，且其丰度在LPS刺激后增加。通过在AECs中沉默AREG并在mRNA和蛋白水平验证敲低，我们利用双转化模型解析了其作用，即绵羊MV在同种异体绵羊PBMC和人类Jurkat细胞上进行测试。AREG沉默AECs的MV表现出受损的免疫抑制活性，无法有效抑制PBMC增殖和Jurkat细胞中NFAT的激活。此外，AREG耗竭后，从MV到免疫细胞的线粒体转移显著减少。

这些发现将AREG确定为AECMV的关键货物，是其免疫调节能力所必需的，可能参与介导MV货物对受体免疫细胞的靶向。它们揭示了一个此前未被认识且具有治疗相关性的机制轴，对免疫介导性炎症的无细胞治疗以及更广泛的再生应用具有重要意义。

# 结果

## AECMV具有独特的蛋白质组特征和炎症响应性

本研究源于我们此前的脂质组学分析，该分析揭示了信号脂质和细胞器相关物种的选择性富集，特别是与线粒体和内质网相关的物种，提示存在协调的功能复合物。

虽然这些发现表明源自AECs的MV具有结构和生物活性特异性，但它们提出了一个问题：哪些蛋白成分可能协调或协同脂质介导的效应，最终介导免疫细胞调节。因此，我们采用蛋白质组学方法来深入了解嵌入在MV货物中的分子效应因子，以及它们的组成如何反映细胞的活化状态。

对MV富集组分（AECMV）进行了基于质谱（MS）的蛋白质组学分析，并与条件培养基总组分（AECtot）和MV耗尽组分（AECMV-free）进行比较。根据我们此前的研究，每种组分均从基础状态和经LPS刺激后的AECs中获取，以模拟炎症条件。我们生成了一个包含2,456种蛋白的蛋白质组数据集，参考Ovis aries UniProt数据库（表S1）。蛋白定量基于神经网络数据非依赖采集（DIA-NN）衍生的归一化蛋白组强度值。这些值反映了基于离子信号强度的蛋白相对丰度，并用于实验内比较。蛋白质组学分析显示，不同分泌组组分之间的总蛋白信号强度相当，无论细胞的炎症状态如何均未观察到显著差异（图1A）。这表明AECtot、AECMV和AECMV-free组分中的总蛋白含量保持一致。

**图1** AECMV具有独特的蛋白质组特征和炎症响应性

(A) 通过无标记质谱在不同分泌组组分（AEC ± LPStot、AEC ± LPSMV-free和AEC ± LPSMV）中获得的总蛋白信号强度。数据以三次独立生物学实验的均值±标准差表示。统计学比较采用单因素方差分析后Tukey多重比较检验；实验组之间未检测到显著差异。

(B) 使用二维主成分分析（PCA）进行降维和实验组间的区分。每个点代表一个独立生物学重复。

(C) 基于Pearson相关系数的层次热图展示了所有分泌组组分的蛋白质组特征。数据的正态性使用D'Agostino-Pearson检验评估。随后使用Pearson相关系数评估变量间的相关性。

为了探究分泌组组分之间的定性差异，我们采用主成分分析（PCA）进行降维（图1B）和以热图呈现的层次聚类（图1C）。PCA显示，前两个主成分可解释总变异的68%，有效区分了三个对应于不同分泌组组分的离散簇（AEC ± LPStot、AEC ± LPSMV-free和AEC ± LPSMV）。这表明尽管总蛋白负荷相当，但各组分的蛋白组成存在明显差异。一致地，热图突出了不同的丰度模式：多个蛋白亚集在AEC ± LPSMV组分中特异性富集，而AECtot和AECMV-free共享不同的特征谱（图1C）。最后，配对相关矩阵（图S1）证实了每个实验组（特别是AEC ± LPSMV）内部的高度一致性，同时展示了三个组分之间的明显分化。

## LPS刺激重塑了AECMV的免疫相关蛋白质组货物

火山图分析用于解析基础状态间的组分差异和LPS诱导的变化（图2）。火山图分析采用显著性阈值p < 0.05，结合蛋白丰度增加的Log2折变（FC）截断值+1.5和蛋白丰度降低的-0.67，揭示了MV与MV-free组分之间有限的蛋白质组分化（图2A），在所有配对比较中产生的差异富集蛋白数量最少（富集144种，耗竭162种）（图2B）。

**图2** AECMV在LPS刺激下经历蛋白质组货物重塑

(A) 火山图展示了基础条件下AECMV与其他分泌组组分（AECtot和AECMV-free）之间差异丰度蛋白。

(B) 在所示基础状态间组分比较中，显示增加（log2FC > +1.5）或降低（log2FC < ?0.67）丰度的蛋白数量。

(C) 火山图展示了LPS诱导后每种分泌组组分中蛋白丰度的变化。

(D) LPS刺激后显示增加（log2FC > +1.5）或降低（log2FC < ?0.67）丰度的蛋白数量，突出了AECMV组分的主要响应。对于每次配对比较，使用Python SciPy包实现的Student's t检验计算p值，并使用statsmodels包实现的Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正。火山图使用GraphPad prism生成。Benjamini-Hochberg校正后p < 0.05且log2FC > +1.5或log2FC < ?0.67的蛋白分别归类为丰度增加或降低的蛋白。数据来自三次独立生物学实验。

相比之下，MV-free组分与总组分相比表现出大量下调蛋白（435种富集，210种耗竭）（图2B）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，这些低丰度蛋白主要与蛋白质加工（核糖体）和线粒体代谢（碳代谢、三羧酸[TCA]循环）以及环境信号响应（PI3K-Akt和HIF1alpha信号通路）相关（表1和S2）。相反，MV-free组分中高丰度蛋白与细胞过程及代谢降解通路（溶酶体、糖胺聚糖、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解通路）相关（表1和S2）。

**表1** 差异丰度蛋白的不同KEGG通路分类

DAPs映射到KEGG通路并根据KEGG数据库定义的主要功能类别分组。粗体表示在高丰度蛋白（log2FC > +1.5；p < 0.05）中显著富集的通路，常规字体表示在低丰度蛋白（log2FC < ?0.67；p < 0.05）中显著富集的通路。斜体表示在高丰度和低丰度蛋白亚集中均显著富集的通路。完整的KEGG富集统计、相关蛋白和蛋白丰度排名见表S2。

| 组分 | 代谢 | 遗传信息 | 加工 | 环境信息加工 | 细胞过程 | 机体/免疫系统 | 疾病 |
|------|------|----------|------|--------------|----------|---------------|------|
| AECMV vs. AECTOT | 氧化磷酸化 | 蛋白酶体；核糖体 | PI3K-Akt信号通路；ECM-受体相互作用 | 细胞黏着；AGE–RAGE信号通路 | 补体与凝血级联；蛋白消化与吸收；松弛素信号通路 | 人类乳头瘤病毒感染；痢疾；癌症通路 | 亨廷顿病；阿尔茨海默病；朊粒病；帕金森病；肌萎缩侧索硬化；癌症中的蛋白聚糖 |
| AECMV-free vs. AECTOT | TCA循环；代谢通路 | 碳代谢 | 糖胺聚糖降解；半胱氨酸和甲硫氨酸代谢；丙酮酸代谢；缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解；糖酵解/糖异生；2-氧代羧酸代谢 | 核糖体；内质网中的蛋白质加工 | PI3K-Akt信号通路；HIF-1信号通路；ECM-受体相互作用 | 细胞黏着；溶酶体 | 胰高血糖素信号通路 | 帕金森病 |
| AECMV vs. AECMV-free | 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢；丙酮酸代谢；代谢通路；碳代谢；糖酵解/糖异生；谷胱甘肽代谢；氨基酸生物合成；精氨酸生物合成；缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解；氧化磷酸化 | 核糖体；内质网中的蛋白质加工；蛋白酶体 | — | — | — | — | 溶酶体–帕金森病；朊粒病；亨廷顿病；肌萎缩侧索硬化；沙门氏菌感染 |
| AEC + LPSMV vs. AEC + LPSTOT | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | A |
| AEC + LPSMV-free vs. AEC + LPSTOT | — | — | — | 细胞黏着 | — | — | — |
| AEC + LPSMV vs. AEC + LPSMV-free | 代谢通路 | — | — | — | — | — | — |

MV组分表现为蛋白质组货物的主要库，在蛋白含量上显著超过MV-free对照，强化了其在分泌组功能中的核心作用。具体而言，与MV-free组分相比，MV组分显示546种高丰度和168种低丰度蛋白（图2B）。对高丰度蛋白的KEGG通路分析鉴定了一个分子特征谱，其特征为线粒体相关代谢（氧化磷酸化），以及遗传信息加工过程（核糖体、蛋白酶体、内质网中的蛋白质加工）和适应性应激反应机制（沙门氏菌感染、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、朊粒病和肌萎缩侧索硬化）（表1和S2），从而强调了适应性应激反应机制的显著激活。

相比之下，低丰度蛋白主要与糖酵解和合成代谢通路（糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、氨基酸生物合成和谷胱甘肽代谢）相关（表1和S2）。

多种线粒体蛋白（包括VDAC1、TRAP1、ATP5PF、ATP5F1A、VDAC2、ATP5PB和NDUFA4）在MV组分中丰度较高（表S1）。其中，TRAP1和PHB2与免疫和应激反应调控相关。例如，CCL20是一种趋化因子，参与将淋巴细胞和树突状细胞募集到炎症部位。此外，在较高丰度蛋白中鉴定出多种参与细胞因子和生长因子信号通路的蛋白，包括TGFBR3、TGFB1I1、MAP2K1、MAPK3、PRKAA1和AKT1S1（表S1）。值得注意的是，TGFBR3作为TGF-beta信号通路中的共受体，在免疫调节和维持免疫耐受中起关键作用。此外，蛋白酶体复合物（PSMD1,2,3,7,5,11,12,13）的许多组分在抗原加工和呈递中发挥重要作用。

这些蛋白的存在表明，源自肺泡上皮细胞（AEC）的微囊泡（MVs），特别是在炎症条件下，携带了一系列能够调节免疫反应的蛋白质组合。综上所述，这些发现支持了 AEC 来源微囊泡（AECMV）作为递送免疫调节信号载体的潜力，突显了它们在开发旨在抑制炎症性疾病中免疫反应的治疗策略中的潜在用途。在评估 LPS 刺激对不同分泌组组分蛋白组组成的影响时，最显著的变化再次出现在 AECMV 组分中（图 2C）。具体来说，LPS 刺激导致 101 种蛋白的丰度增加（图 2D），这些蛋白富集于与代谢相关的 KEGG 通路中。该类别中排名前 5% 的蛋白显示出免疫相关蛋白的富集，包括 CXCL1 和 AREG（图 2C）。CXCL1 主要作为趋化因子发挥作用，驱动炎症期间的白细胞招募。AREG 则日益被证实参与组织免疫调节和修复。此外，AREG 已被鉴定为细胞外囊泡（EV）货物通讯的生物活性成分。值得注意的是，AEC+LPSMV 组中其他丰富的蛋白显示了免疫调节功能（PTX3、NHLRC2 和 SGSH）和组织重塑功能，包括（MMP12、MMP3、MMP13、SERPINF1、FMOD、CTSL 和 CTSC）（表 S2）。总之，这些发现表明，炎症刺激选择性地重塑了 AECMV 的分子货物，反映了对环境线索的靶向适应性反应。相比之下，LPS 诱导的 AEC 上清（AECTOT）和无 AECMV 组分的变化不太显著且更具异质性，这支持了 MVs 代表炎症条件下 AEC 旁分泌信号的主要效应区室的观点。在该囊泡组分中，AREG 出现在最丰富的免疫相关蛋白之列，鉴于其作为生物活性 EV 货物成分的既定作用，它代表了 MV 依赖性免疫调节通讯的强候选介导因子。

AEC 中 AREG 的基因沉默消除了其细胞内储库及与微囊泡相关的货物
为调查与微囊泡相关的 AREG 的生物学相关性，我们对暴露于 LPS 刺激的 AEC 进行了瞬时 AREG 基因敲低。转染非靶向小干扰 RNA（siRNA，siCTR）的 AEC 用作阴性对照。确认了细胞内水平的 AREG 下调，转染 48 小时后，mRNA（p < 0.0001；图 3A）和蛋白表达（图 3B）均显著降低。

图 3 AEC 中 AREG 的基因沉默消除了其细胞内储库及与微囊泡相关的货物
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(A–C) LPS 刺激 AEC 基因沉默后 AREG 表达的定量，通过定量逆转录 PCR（RT-qPCR）评估 AREG mRNA 水平（A），免疫印迹分析细胞内 AREG 蛋白（B），以及 ELISA 测量条件培养基中分泌的 AREG（C）。
(D) 使用抗 AREG 抗体通过流式细胞术定量微囊泡中的 AREG 水平。
(E) AREG 沉默后微囊泡中 TOMM40 富集的免疫印迹分析及光密度定量。
(F) 微囊泡中线粒体标记的流式细胞术定量。
(G) 稳定表达线粒体靶向 TurboRFP 的永生化人 AEC（iAECs）释放的微囊泡的流式细胞术分析，经过对照组 siRNA（siCTR）或靶向 AREG 的 siRNA（siAREG）处理后。示意图使用 BioRender.com 制作。
(H) siCTR- 和 siAREG 处理的 AEC 来源微囊泡中的线粒体 DNA 拷贝数，通过实时 qPCR 定量。数据以三次生物学独立实验的均值 ± 标准差表示，每个生物学重复至少分析三次技术重复。两个指定组之间的比较使用非配对、双尾 Student's t 检验进行（A）–（H）。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。仅显示具有统计学显著性的差异。

一致的是，分泌的 AREG 水平同样显示出显著的耗竭（p < 0.0001 vs. siCTR；图 3C）。值得注意的是，源自 AREG 沉默 AEC 的微囊泡（siAREGMV）与对照微囊泡相比，AREG 阳性率降低了 50%，如荧光激活细胞分选（FACS）分析所示（p < 0.01，siAREGMV vs. siCTRMV；图 3D），从而确认了沉默的有效性。基于先前证明 AEC 免疫组分涉及通过微囊泡转移线粒体的发现，我们检查了 AREG 沉默是否影响微囊泡中的线粒体含量。

为了评估 AEC 来源微囊泡的线粒体货物，我们采用了一种多方法策略，结合了线粒体标记物 TOMM40 的评估、使用 MitoTracker 进行直接线粒体标记、使用稳定表达线粒体靶向 TurboRFP 的永生化人 AEC（iAEC）系进行线粒体靶向 TurboRFP 追踪，以及 mtDNA 定量。虽然 AREG 沉默导致 TOMM40 阳性微囊泡的丰度增加（p < 0.0001，siAREGMV vs. siCTRMV；图 3E），但通过 MitoTracker 标记直接评估线粒体含量（p < 0.001，siAREGMV vs. siCTRMV，图 3F），结合使用表达线粒体靶向 TurboRFP 的 iAEC 进行的补充分析（p < 0.0001，siAREGMV vs. siCTRMV；图 3G）以及 mtDNA 定量（p < 0.001，siAREGMV vs. siCTRMV；图 3H），证明 AREG 耗竭与微囊泡组分中线粒体货物的显著减少相关。这些发现将 AREG 鉴定为线粒体微囊泡组装中的新调节因子。

AREG 沉默的微囊泡在免疫细胞中显示内化受损
基于我们之前的发现，即 AECMV 可以介导线粒体向免疫细胞的转移，从而促进凋亡信号，我们试图确定 AREG 耗竭在该过程中的具体作用。为了验证位于微囊泡表面的 AREG 是否可能干扰线粒体内化，我们监测了微囊泡介导的线粒体货物转移进入受体免疫细胞（绵羊 PBMC 或人 Jurkat T 细胞）的情况，这些微囊泡带有或不带有 AREG 表达。使用种属特异性（绵羊到绵羊和人到人）和跨物种（绵羊到人）模型，旨在整合高级成像和分子定量方法。

在种属特异性情况下，共聚焦显微镜（图 4A，左）揭示了源自 siCTRMV 的红色 MitoTracker 标记线粒体进入绵羊 PBMCs 的内化，与内源性线粒体（绿色）共定位，如橙色合并信号所示。值得注意的是，这种摄取在孵育期间通过外源性 AREG 添加（siCTRMV + AREGEX）而增强，而在 AREG 敲低时（siAREGMV）几乎被消除，并且通过重新补充 AREG（siAREGMV + AREGEX）仅部分挽救，表明了一种 AREG 依赖的、剂量和空间响应机制用于线粒体转移。

图 4 AREG 沉默的微囊泡在免疫细胞中显示内化受损
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(A) 绵羊外周血单个核细胞（PBMCs）对内红色 MitoTracker 标记的、微囊泡相关线粒体的内化。PBMCs 与 siCTRMV、siCTRMV + AREGEX、siAREGMV 或 siAREGMV + AREGEX（AREGEX 表示外源性给药的 AREG）孵育 12 小时。代表性共聚焦图像（左）显示细胞核用 Hoechst 33342 染色（蓝色），内源性 PBMC 线粒体用 MitoTracker green 标记（绿色），微囊泡相关线粒体用 MitoTracker Red 标记（红色）。线粒体摄取通过流式细胞术定量（右）。标尺，5 μm。
(B) 人 Jurkat T 细胞对微囊泡相关线粒体的摄取。微囊泡源自稳定表达线粒体靶向 TurboRFP 的永生化人 AEC（iAECs），并经受指定的 AREG 调节条件。代表性共聚焦图像（左）显示细胞核用 Hoechst 33342 染色（蓝色），细胞质用 Calcein AM 标记（绿色），以及孵育 12 小时后 TurboRFP 标记的线粒体（红色）。线粒体摄取通过流式细胞术定量（右）。标尺，5 μm。
(C) 人 Jurkat T 细胞与源自绵羊 AEC 的红色 MitoTracker 标记的微囊泡孵育后的跨物种线粒体转移。线粒体摄取通过流式细胞术定量（左），而受体细胞中绵羊 mtDNA 的存在通过 qPCR 评估（右）以确认跨物种转移。流式细胞术结果表示为 MitoTracker Red-或 TurboRFP 标记线粒体阳性细胞的平均荧光强度（MFI）比率。CTR 表示未处理的 PBMC 或 Jurkat T 细胞。数据以三次生物学独立实验的均值 ± 标准差表示，每个生物学重复至少分析三次技术重复。统计学显著性通过双向 ANOVA 随后 Tukey's 多重比较检验评估（A）–（C）。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。“All"表示 p < 0.05 与所有其他实验条件相比。仅显示具有统计学显著性的比较。

siAREG 线粒体内化的负面影响通过流式细胞术分析（图 4A，右）进行了定量，确认了 AREG 沉默后 PBMCs 线粒体摄取的减少。

为了排除染料依赖性假象并进一步验证该表型，我们平行使用了标记的 turboRFP iAEC。在确认 AREG 沉默后（图 S2），我们观察到对人 Jurkat 细胞的一致影响：线粒体转移因 AREG 耗竭而受损，并通过 AREG 重新引入而部分挽救，如共聚焦成像（图 4B，左）和流式细胞术（图 4B，右）所示。

在跨物种背景下，源自绵羊 AEC 的红色 MitoTracker 标记的微囊泡与 Jurkat 细胞孵育 12 小时。流式细胞术（图 4C，左）确认了先前的模式：AREG 缺失的微囊泡线粒体掺入减少。为了定量线粒体转移，我们还分析了人 Jurkat 细胞中绵羊转移的 mtDNA 拷贝数（图 4C，右），如先前验证的那样。分析确认了与 siAREGMV 相比，暴露于 siAREGMV 的细胞 mtDNA 摄取显著减少（p < 0.01），并通过 AREG 重新引入挽救（p < 0.001，siAREGMV + AREGEX vs. siAREGMV；图 4C，右）。总之，这些结果表明，微囊泡相关的 AREG 有助于高效的线粒体转移和免疫受体细胞的摄取。

AREG 驱动 AECMV 在免疫细胞中的免疫抑制功能
在确认 AREG 在微囊泡内化进入免疫细胞中的作用后，最后评估了它们的免疫调节作用。具体而言，评估了源自 siAREG 或 siCTR 细胞的微囊泡对激活的免疫细胞（如绵羊 PBMCs 和人 Jurkat T 细胞）的影响。

如图 5A 所示，源自转染非靶向 siRNA 的 AEC 的微囊泡确认了其显著的免疫调节效果，在有丝分裂原刺激下导致细胞增殖显著减少 47.5%（p < 0.01，siCTRMV vs. 植物血凝素 [PHA]）。这种效果通过外源性 AREG 补充而进一步增强，增强了 siCTRMV 活性并将增殖率降至 25.5%（p < 0.05，siCTRMV + AREGEX vs. siCTRMV；图 5A）。相反，AREG 的基因消融导致 AECMV 免疫调节能力的戏剧性丧失（p < 0.05，siCTRMV vs. siAREGMV；图 5A），PBMC 达到与 PHA 诱导激活下观察到的水平相当。值得注意的是，将外源性 AREG 添加到 siAREG 中有效地恢复了微囊泡的调节功能，与未处理的沉默条件相比，增殖减少 2.8 倍（p < 0.01，siAREGMV + AREGEX vs. siAREGMV；图 5A）。然而，在这一后一实验中，AREG 的添加并未恢复在 siCTR + AREG 存在下记录的免疫调节影响，从而表明微囊泡表面 AREG 的存在不能被蛋白外源性补充功能性取代（p < 0.05 siAREG + AREG vs. siCTR + AREG）。

图 5 AREG 驱动 AECMV 在免疫细胞中的免疫抑制功能
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(A) 植物血凝素（PHA）激活的 PBMCs 与指定的微囊泡制剂（siCTRMV ± AREGEX 和 siAREGMV ± AREGEX）孵育 48 小时，使用 eFluor 450 细胞增殖染料评估细胞增殖。数值归一化为 PHA 刺激的 PBMCs，定义为 100% 增殖。
(B) CD3 刺激的 Jurkat NFAT 报告细胞用相同的微囊泡制剂处理 6 小时，定量 NFAT 活性以评估其抑制效果。数值归一化为 CD3 刺激的 Jurkat 细胞，定义为 100% NFAT 激活。数据以三次生物学独立实验的均值 ± 标准差表示，每个生物学重复至少分析三次技术重复。统计学显著性通过双向 ANOVA 随后 Tukey's 多重比较检验评估（A）–（B）。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。仅显示具有统计学显著性的比较。

为了进一步评估 AREG 沉默对微囊泡货物调节细胞内免疫信号通路能力的影响，使用对 CD3 诱导 NFAT 激活有响应的异种 Jurkat 报告细胞评估了 AECMV 的免疫抑制效果。具体而言，如图 5B 所述，源自 siCTR AEC 的微囊泡相对于 CD3 刺激显著减少了 NFAT 激活（p < 0.0001，siCTRMV vs. CD3），这与增殖数据一致。这种效果被外源性 AREG 增强（p < 0.0001，siCTRMV + AREGEX vs. siCTRMV）。相比之下，源自 AREG 沉默 AEC 的微囊泡未能抑制 NFAT 激活（p < 0.0001，siCTRMV vs. siAREGMV；图 5B），达到与 CD3 激活对照相当的水平。值得注意的是，向 siAREGMV 添加 AREG 恢复了 NFAT 通路活性的抑制（p < 0.0001，siAREGMV + AREGEX vs. siAREGMV；图 5B）。这些发现强调了 AREG 在赋予 AECMV 免疫调节属性中的关键作用，表明其在微囊泡内的存在对于维持和增强其对免疫细胞增殖和 CD3 依赖性 NFAT 通路激活的抑制效果至关重要。

此外，这一效应似乎与微囊泡（MV）的内化在机制上相关，因为我们之前的工作证明，微囊泡的免疫抑制活性依赖于免疫细胞的摄取，而这一过程被胞饮抑制剂处理后显著受损。

讨论
我们的无标签比较性蛋白质组分析表明，AECMV是分泌组蛋白的主要载体，并对炎症应激表现出显著的动力学响应。这一发现支持了此前关于羊膜细胞来源的细胞外囊泡（EVs）中选择性富集了膜结合蛋白、分泌蛋白、细胞外基质组分以及雌激素受体（ER）腔内驻留蛋白的报道。此外，本研究进一步扩展了这些观察结果，证明炎症作为一种许可性事件，增强了微囊泡货载的选择性和功能复杂性。我们的数据显示，脂多糖（LPS）刺激诱导了微囊泡组分中101种差异丰度蛋白的积累，这些蛋白在功能上汇聚于代谢重编程，揭示了一种精细而动态的机制，使AECMV在炎症应激条件下塑造免疫应答。

其中，转录调控因子如TGFBR3和TGFB1I1的显著上调，提示AECMV在塑造辅助性T细胞极化及促进外周免疫耐受中发挥作用，这一点已在其他羊膜细胞中得到证实。这些蛋白质此前已被鉴定存在于细胞外囊泡中，已知可水平转移至受体免疫细胞，并通过STAT通路激活来调控转录程序。同时，蛋白酶体亚基（如PSMD蛋白）的富集支持了越来越多的证据，即与微囊泡关联的蛋白酶体具有催化活性，并参与MHC-I抗原加工，从而拓展了AECMV的免疫感知和抗原呈递功能。

这些囊泡的功能特性体现在糖酵解和胆固醇代谢相关酶上，显示AECMV是活跃的免疫代谢单元，能够改变巨噬细胞及其他免疫效应细胞的生物能量状态，这一概念在间充质干细胞细胞外囊泡研究中日益受到重视。大约15%的微囊泡富集蛋白来自线粒体，与囊泡介导的线粒体转移及其免疫代谢效应的报道一致。

在此背景下，我们的数据显示，AREG（一种表皮生长因子EGFR配体，具有已确立的免疫调节特性）的缺失会降低AECMV的线粒体负载，并减少免疫细胞对其的摄取。这表明高效的线粒体货载递送由货载组成和微囊泡表面导向信号共同决定，其中AREG发挥重要作用。有趣的是，AREG的表达与增强的微囊泡内化以及较低的线粒体货载含量相关，提示AREG可能在调节微囊泡组成和转移效率中发挥作用。这种双重功能凸显了AREG作为关键分子开关的角色，它不仅编排微囊泡的组成结构，还协调AECMV向受体免疫细胞的摄取和生物利用度。

扩展这些机制性见解，整合性蛋白质组分析揭示了额外的免疫相关货载，如CXCL1、PTX3、SGSH和NHLRC2，进一步证实了免疫调节和应激反应通路的协同富集策略的存在。蛋白质富集分析确认了免疫代谢调控和蛋白酶体介导的抗原加工的参与，所有这些都将AECMV定位为细胞间免疫应答编排中的核心参与者。微囊泡中富集的趋化因子如CCL20已知可产生趋化梯度，引导CCR6+淋巴细胞定向迁移，这可能为这些囊泡的免疫调节能力增添了空间维度，提示在炎症信号的响应下，AEC不仅利用微囊泡信号抑制免疫过度激活，还通过趋化梯度在空间上协调免疫细胞的定位。

重要的是，AREG作为一种关键效应分子，不仅可如先前所述以可溶形式发挥作用，还可作为微囊泡的选择性包装组分，在其中发挥多重作用。AEC中AREG的基因沉默导致微囊泡抑制PBMC增殖和Jurkat T细胞NFAT激活的能力显著降低，而外源重组AREG补充仅部分恢复了这些效应。这些观察支持了一个模型，即AREG不仅对于通过EGFR信号调控受体免疫细胞的激活至关重要，而且可能通过受体介导的机制确保高效的微囊泡摄取。

值得注意的是，这种受损的免疫调节伴随着向免疫细胞转移线粒体的缺陷，提示两者之间可能存在潜在关联，AREG可能在其中起贡献作用。这与癌细胞来源的AREG外泌体的研究相呼应，后者表明每个囊泡仅需约24个AREG分子即可引发强效且特异性的EGFR反应。有趣的是，剪接体蛋白（如U2AF2、SF3B3、SF3B4、SNRPD1、SNRPA1、SNRNP200、SRSF1、SRSF3、SRSF6和SRSF9）在生理性AECMV中的存在——这些蛋白通常在应激条件下被导出至细胞外囊泡中以调节RNA剪接并赋予治疗耐药性——提示了额外的一层调控影响，即受体免疫细胞中的转录组重塑可能有助于长期免疫静息的维持。

综上所述，我们的发现推进了AECMV作为新一代无细胞免疫调节工具的概念。这些囊泡通过以下方式发挥编排作用：(1) 通过线粒体转移和糖酵解酶含量实现代谢重编程；(2) 通过AREG依赖性通路实现直接免疫抑制；(3) 通过CCL20梯度实现趋化控制；(4) 通过蛋白酶体和剪接体货载调节抗原加工和RNA代谢。炎症信号，尤其是LPS，似乎调节着AEC的囊泡输出，以平衡免疫防御并防止过度激活。

从转化角度而言，富含AREG及其他调节因子的AECMV代表了一种极具前景的无细胞治疗策略，适用于以免疫失调和线粒体功能障碍为特征的疾病——包括移植物抗宿主病（GVHD）、炎症性肠病（IBD）、神经炎症性疾病以及与癌症相关的免疫功能障碍。与细胞疗法不同，微囊泡在安全性、稳定性和工程化潜力方面具有优势。未来的研究应优先解析受体介导的摄取通路，设计富含AREG且具有增强靶向能力的囊泡，并探索共同包装的免疫调节分子之间的协同作用，以最大化治疗效果。

研究局限性
在本研究中，我们提供了证据表明与微囊泡关联的AREG塑造了囊泡组成、线粒体转移及免疫细胞中的免疫调节活性。尽管AREG耗竭显著改变了这些指标，但这些效应的精确分子基础仍未解决。特别是，我们的实验设计无法将AREG在微囊泡生物发生、货载选择以及与受体细胞相互作用中的潜在直接作用，与AREG沉默对亲本AEC及其分泌组的更广泛后果区分开来。此外，依赖siRNA介导的敲低和体外免疫细胞模型可能无法完全反映体内微囊泡-免疫细胞交叉对话的复杂性。未来研究需要采用互补的遗传策略、深入的受体-配体图谱绘制以及具有疾病相关性的临床前模型，以界定微囊泡关联AREG的具体贡献并严格确立其转化意义。

资源可用性
主要联系人
如需获取更多信息和资源，请联系主要联系人Alessia Peserico（[e-mail]）。

材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性
- 质谱蛋白质组学数据已存至ProteomeXchange联盟的PRIDE合作数据库，数据库标识符为PXD074552，自出版之日起公开可用。
- 本文未报告原始代码。
- 重新分析本文所报告数据所需的任何附加信息，可在请求后从主要联系人处获得。

致谢
A.C.-V.感谢欧盟地平线2020研究与创新计划下玛丽亚·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议第955685号（www.p4fit.eu）的支持。A.C.获得了"国家复苏与韧性计划，补充农业生物服务基金"资助，2009年和2016年地震灾区干预统一计划，B措施，B.4子措施 - CUP: C43C21000150001-AARI00116。V.D.G.获得了欧盟下一代欧盟计划M4C1项目资助，项目CUP: C46E23000120006，奖学金编号：39-411-A8-DOT13A8025-8428。H.A.S.感谢UMCG研究基金的资助支持。感谢赫尔辛基大学生物技术研究所和Markku Varjosalo教授提供的设施和专业知识用于蛋白质组分析。图形摘要和部分插图使用BioRender.com制作。

作者贡献
概念化，B.B.；方法学，G.P.和A.C.-V.；形式分析，G.P.、A.C.-V.、A.P.和A.C.；调查研究，G.P.、A.C.-V.、A.P.、A.C.、V.D.G.、M.T.、O.D.G.和A.T.；初稿撰写，B.B.、G.P.、A.C.-V.和A.P.；审阅与编辑，G.P.、A.C.-V.、A.P.和A.C.；监督指导，B.B.、H.A.S.、T.M.和V.R.；项目管理，B.B.；资源，B.B.、T.M.和C.T.；经费获取，B.B.和H.A.S.

利益声明
作者声明不存在竞争性利益关系。

★方法
关键资源表
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| 抗微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | Cat 2146; RRID: AB_2210545 |
| 小鼠单克隆抗CD3 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 16-0037-81; RRID: AB_468854 |
| 兔多克隆抗TOMM40 | MyBiosource | Cat# MBS5400122; RRID: 不可用 |
| 山羊多克隆抗AREG | R&D Systems | Cat# AF262; RRID: AB_2243124 |
| 小鼠单克隆抗AREG | Invitrogen | Cat# 12-5370-42; RRID: AB_2716926 |
| **化学品、肽段和重组蛋白** | | |
| 三(2-羧乙基)磷酸胆碱盐酸盐 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 20490 |
| 碘乙酰胺 | Acros Organics | Cat# 122271000 |
| 测序级改良胰蛋白酶 | Promega | Cat# V5113 |
| 三氟乙酸（TFA） | VWR | Cat# 85049.051 |
| 乙腈（HPLC级） | VWR | Cat# 83640.320 |
| HPLC级水 | Fisher Scientific | Cat# 10505904 |
| TransIT-X2?动态递送系统 | Mirus Bio LLC | Cat# MIR-6000 |
| 脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich | Cat# L2637 |
| 康地兰-植物凝集素（PHA-L） | Invitrogen | Cat# 00-4977-93 |
| 青霉素-链霉素 | Lonza | Cat# DE 17-602E |
| 两性霉素B | Euroclone | Cat# ECM0009 |
| DL-谷氨酰胺 | Euroclone | Cat# ECB300 |
| D-泛素 | Sigma-Aldrich | Cat# P8783 |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva | Cat# GE17-1440-02 |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | Cat# F4680 |
| 含Ca2?和Mg2?的DPBS | Sigma-Aldrich | Cat# D8662 |
| BSA | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | Cat# T4049 |
| Quick Start? Bradford 1x染料试剂 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 50002054 |
| X Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 1610747 |
| 磷酸酶抑制剂 | SERVA Electrophoresis GmbH | Cat# 39055 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | Cat# P2714 |
| 4-15%密度梯度预制胶 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 4568083 |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 1620145 |
| Trans-Blot Turbo 5x转移缓冲液 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 10026938 |
| Every blot封闭液 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 120100201 |
| 1x TBS 1%酪蛋白封闭液 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 1610782 |
| ClarityMax ECL试剂 | Bio-Rad Laboratories | Cat# 1705062 |
| Normocin? | InvivoGen | Cat# ANT-NR-2 |
| 潮霉素B | InvivoGen | Cat# ANT-BL-1 |
| Zeocin? | InvivoGen | Cat# ANT-ZN-1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | Cat# D8418 |
| QUANTI-luc?荧光素酶检测试剂 | InvivoGen | Cat# REP-QLC4LG1 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | Cat# M7513 |
| Mitotracker Green | Invitrogen | Cat# M7514 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 62249 |
| 钙黄绿素AM | Invitrogen | Cat# C3100 |
| **已存档数据** | | |
| 羊膜上皮细胞分泌组蛋白质组分析 | ProteomeXchange联盟，通过PRIDE合作数据库 | 数据库标识符：PXD074552 |
| **关键商业试剂盒** | | |
| BioPure SPN PROTO 300 C18小型柱 | The Nest Group Inc. | Cat# HUM S18 |
| VeBioscience?细胞增殖染料eFluor? 450 | Invitrogen | Cat# 65-0842-90 |
| 绵羊两亲素（AREG）ELISA试剂盒 | MyBiosource | Cat# MBS044705 |
| 人两亲素（AREG）ELISA试剂盒 | Invitrogen | Cat# EHAREG |
| 总RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek Corp. | Cat# 17200 |
| oligodT引物 | Bioline | Cat# BIO-38029 |
| Tetro逆转录酶 | Bioline | Cat# BIO-65050 |
| Quick-DNA小提试剂盒 | Zymo Research Corporation | Cat# D4068 |
| SYBR Lo-ROX试剂盒 | Bioline | Cat# BIO-94050 |
| **寡核苷酸** | | |
| 4条靶向绵羊AREG的定制ON-TARGETplus siRNA | Dharmacon | AREG 1: CCA UUA UAC UGC UGG AUU A; AREG 2: GAA GAA ACA GAA AGA GGA A; AREG 3: AGA AAC AGA AAG AGG AAA A; AREG 4: AAA GAA ACU UCG ACA AGA A |
| 4条靶向人AREG的定制ON-TARGETplus siRNA | Dharmacon | hAREG 1: CCA CAG UGC UGA UGG AUU U; hAREG 2: CAG GAA AUA UGA AGG AGA A; hAREG 3: GCA AAU GUC AGC AAG AAU A; hAREG 4: GAA GAA ACA GAA AGA AGA A |
| ON-TARGETplus非靶向对照组（NTC） | Dharmacon | Cat# D00181010; NTC_1: UGGUUUACAUGUCGACUAA; NTC_2: UGGUUUACAUGUUUGUGUGA; NTC_3: UGGUUUACAUGUUUUCUGA; NTC_4: UGGUUUACAUGUUUUCCUA |
| 绵羊AREG正向引物 | 内部开发 | 5′-AAGGTGTCGCTGAAGAACGA-3′ |
| 绵羊AREG反向引物 | 内部开发 | 5′-TGATTCCGATCTGATACCCTGC-3′ |
| 绵羊线粒体DNA正向引物 | 内部开发 | 5′-CTAGGCCTGTCCCTACTGGT-3′ |
| 绵羊线粒体DNA反向引物 | 内部开发 | 5′-GCAAGCTGTGAAGTGTGGTG-3′ |
| 人AREG正向引物 | 内部开发 | 5′-GATACTCGGCTCAGGCCATT-3′ |
| 人AREG反向引物 | 内部开发 | 5′-ATGGTTCACGCTTCCCAGAG-3′ |
| 人线粒体DNA正向引物 | 内部开发 | 5′-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3′ |
| 人线粒体DNA反向引物 | 内部开发 | 5′-TTAACAACATACCCATGGCCA-3′ |
| **实验模型** | | |
| AEC（羊膜上皮细胞） | 泰拉莫大学 | N/A |
| iAEC | 日本大学医学部 | N/A |
| PBMCs（外周血单个核细胞） | 泰拉莫大学 | N/A |
| Jurkat-Lucia? NFAT细胞 | InvivoGen | Cat# jktl-nfat-cd28 |
| **软件和算法** | | |
| DIA-NN (v1.8.1) | Demichev Lab | https://github.com/vdemichev/DiaNN |
| timsControl | Bruker Daltonics | – |
| ImageJ 1.53k | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| GraphPad Prism 10 | GraphPad | https://www.graphpad.com |
| BioRender | BioRender | https://www.biorender.com |
| NIS-Element软件4.40 | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/software/nis-elements |
| CytExpert SRT | Beckman | https://www.beckman.it/flow-cytometry/research-flow-cytometers/cytoflex/software |
| ClueGO | Cytoscape | https://apps.cytoscape.org/apps/cluego |
| **其他** | | |
| FBS（胎牛血清） | Gibco | Cat# 10270106 |
| α-MEM | Euroclone | Cat# ECM085 |
| LIM DM | Thermo Fisher Scientific | Cat# 12440053 |
| DMEM | Euroclone | Cat# ECM0728 |
| LC18色谱柱（8 cm × 150 μm, 1.5 μm微珠） | Evosep Biosystems | Cat# EV1109 |
| 96孔高结合板 | Corning | Cat# 9018 |

实验模型和受试者详情
本研究使用的羊膜细胞来自成年妊娠绵羊。由于羊膜膜是从按照欧洲共同体法规(EC)第1069/2009号生产食物而屠宰的动物身上作为废料获取的，因此不需要伦理审批。所有程序均在意大利卫生部授权机构进行（批准编号：ABP4169）。绵羊PBMC通过从屠宰场采集的血液分离获得。

表达NFAT诱导型Lucia荧光素酶构建体的报告T细胞系Jurkat-Lucia? NFAT细胞购自InvivoGen（#jktl-nfat-cd28; InvivoGen, 法国图卢兹）。

iAEC细胞系（永生化的人AEC，表达线粒体靶向turboRFP）由日本大学医学部美树敏雄实验室慷慨提供（东京，日本）。iAECs细胞系的身份未经短串联重复（STR）分析确认。然而，iAECs常规检测确认无支原体污染。

方法细节
绵羊来源AEC的分离和培养
AEC从妊娠中期的阿皮耶尼卡绵羊（胎儿长度：25-30 cm）的羊膜膜（AM）中分离，以避免通常在足月时观察到的上皮-间充质转化（EMT）。在无菌条件下切开子宫壁，使用立体显微镜将AM从绒毛膜上机械分离，然后切成2-3 cm的碎片。AM碎片用含钙镁的杜尔贝科PBS（DPBS; #D8662; Sigma-Aldrich, 美国圣路易斯）洗涤，然后在38.5°C下轻轻摇动，与0.25%胰蛋白酶-EDTA（#T4049; Sigma-Aldrich, 美国圣路易斯）孵育40分钟。通过添加10% FBS（#10270106; Gibco, Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）停止酶消化，细胞悬液通过40 μm滤网过滤。

细胞通过500 × g离心10分钟进行收集，并使用LUNA-II?自动细胞计数器（Logos Biosystems Inc.，韩国京畿道）结合台盼蓝染色法计数活细胞。随后，将AEC以每孔10?个细胞接种于6孔板中，培养于α-MEM（#ECM0850L；Euroclone S.p.A.，意大利米兰）中，培养基补充10%灭活胎牛血清（#10270106；Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、1% L-谷氨酰胺（#ECB300D；Euroclone S.p.A.，意大利米兰）、1%两性霉素B（#EUM0009D；Euroclone S.p.A.，意大利米兰）和1%青霉素/链霉素（#DE17-602E；Lonza，瑞士巴塞尔），称为完全培养基，并添加25 μM孕酮（P4；4-孕烯-3,20-二酮，#P8783；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）以抑制EMT。细胞在38.5 °C、5% CO?条件下培养至约70%汇合度，随后使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化脱落，用于后续实验。绵羊PBMC的分离从16 mL新鲜外周血中通过密度梯度离心法分离绵羊PBMC。梯度使用12 mL Ficoll-Paque? PLUS（#GE17-1440-02；Cytiva，美国马萨诸塞州马尔伯勒）按制造商方案制备。分离所得细胞液氮冻存，直至用于免疫学检测。Jurkat报告细胞培养Jurkat-Lucia? NFAT细胞在Iscove改良杜氏培养基（IMDM；#12440053；Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养，培养基补充10%热灭活胎牛血清（#10270–106；Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、100 μg/mL青霉素/链霉素（#DE17-602E；Lonza，瑞士巴塞尔）、100 μg/mL Normocin?（#ANT-NR-2；InvivoGen，法国图卢兹）、5 μg/mL巴氏放线菌素（#ANT-BL-1；InvivoGen，法国图卢兹）和100 μg/mL Zeocin?（#ANT-ZN-1；InvivoGen，法国图卢兹）。细胞每2天传代一次，传代不超过第三代以维持最佳密度，并在37 °C、加湿5% CO?条件下培养。iAEC细胞培养iAEC细胞系在含高糖DMEM（高糖DMEM；#ECM0728L；Euroclone S.p.A.，意大利米兰）中维持，培养基补充10%热灭活胎牛血清（FBS；#10270106；Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、1% L-谷氨酰胺（#ECB300D；Euroclone S.p.A.，意大利米兰）和1%青霉素-链霉素（#DE17-602E；Lonza，瑞士巴塞尔）。此完全培养基用于常规培养，细胞在37 °C、加湿5% CO?孵箱中每48小时传代一次。AEC/iAEC中AREG的瞬时沉默与CM的制备AEC和iAEC的瞬时基因缺失使用小干扰RNA（siRNA）以50 nM终浓度实现。使用靶向AREG的ON-TARGETplus siRNA（#；Dharmacon，Horizon Discovery，美国科罗拉多州拉法耶特）及相应的非靶向对照（NTC）siRNA（#FE5D0018101005；Dharmacon，Horizon Discovery，美国科罗拉多州拉法耶特）。转染使用TransIT-X2?动态递送系统（#MIR-6000；Mirus Bio LLC，美国威斯康星州麦迪逊）按制造商说明进行。为优化转染效率，将细胞培养至50–60%汇合度，且非活细胞比例≤2%。随后使用特异性siRNA进行瞬时基因沉默。24小时后，细胞在无血清培养基（α-MEM补充1%青霉素/链霉素、1%两性霉素B和1% L-谷氨酰胺）中预处理4小时。如先前对AEC所述及其他模型，部分细胞用LPS（1 μg/mL；#L2637，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）处理1小时。处理结束后，所有实验组（对照组和LPS处理组）用无血清培养基洗涤两次，并在含siRNA的新鲜无血清培养基中继续培养24小时（在此期间在收集CM之前进行第二轮转染）。CM通过500 × g离心10分钟收集，上清液于?80 °C保存。收集细胞沉淀以通过定量实时PCR和Western blot分析验证基因沉默效率。• 4条靶向绵羊AREG的定制ON-TARGETplus siRNA（Dharmacon，Horizon Discovery，美国科罗拉多州拉法耶特），作为混合池使用：○ oAREG 1：CCA UUA UAC UGC UGG AUU A○ oAREG 2：GAA GAA ACA GAA AGA GGA A○ oAREG 3：AGA AAC AGA AAG AGG AAA A○ oAREG 4：AAA GAA ACU UCG ACA AGA A• 4条靶向人AREG的定制ON-TARGETplus siRNA（Dharmacon，Horizon Discovery，美国科罗拉多州拉法耶特），作为混合池使用：○ hAREG 1：CCA CAG UGC UGA UGG AUU U○ hAREG 2：CAG GAA AUA UGA AGG AGA A○ hAREG 3：GCA AAU GUC AGC AAG AAU A○ hAREG 4：GAA GAA ACA GAA AGA AGA A• 绵羊和人通用的ON-TARGETplus非靶向混合池（NTC）（#D00181010；Dharmacon，Horizon Discovery，美国科罗拉多州拉法耶特）：○ NTC_1：UGGUUUACAUGUCGACUAA；○ NTC_2：UGGUUUACAUGUUUGUGUGA；○ NTC_3：UGGUUUACAUGUUUUCUGA；○ NTC_4：UGGUUUACAUGUUUUCCUA微囊泡（MV）的分离MV组分从收集的CM中通过超速离心分离，使用Optima? XPN-90超速离心机（Beckman Coulter Life Sciences，美国加利福尼亚州布里亚）在4 °C、25,000 × g条件下离心5分钟，如先前所述。弃去上清液，将含MV的沉淀重悬于无血清培养基中用于下游应用。为确保MV分离的一致性，常规根据先前为该方案建立的表征标准进行评估，包括通过TRPS分析颗粒大小分布以及检测囊泡（如CD63）和细胞器相关标志物（如CNX、TOMM40、HSP60），从而确认所回收组分中微囊泡的富集。蛋白质组学分析的样品制备为进行蛋白质组学表征，将总CM在4 °C、25,000 × g条件下超速离心5分钟，使用Optima? XPN-90超速离心机（Beckman Coulter Life Sciences，美国加利福尼亚州布里亚），如先前所述。收集上清液作为无MV组分，沉淀定义为MV组分。将MV沉淀轻轻重悬于少量无血清培养基中。使用三氯乙酸（TCA）沉淀总CM、无MV组分和MV组分中的蛋白质。具体而言，向每个样品中加入100%（w/v）TCA，使其终浓度达到20%（w/v）。样品在冰上孵育至少1小时，随后在4 °C、16,000 × g条件下离心10分钟。所得蛋白质沉淀用冰冷的90%丙酮中的0.01 M HCl洗涤三次，然后风干。干燥的蛋白质沉淀重悬于含8 M尿素的100 mM碳酸氢铵（NH?HCO?）中。每个样品取15 μg总蛋白质用于蛋白质组学分析。将尿素浓度用100 mM NH?HCO?稀释至1 M。然后样品用5 mM Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐（#20490；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行还原，在室温下用10 mM碘乙酰胺（#122271000；Acros Organics，比利时吉尔）进行烷基化，并使用测序级改良胰蛋白酶（#V5113；Promega Corporation，美国威斯康星州麦迪逊）在37 °C下消化16小时。消化后，样品用10%三氟乙酸（TFA，#85049.051；VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺尔）酸化，并使用BioPureSPN PROTO 300 C18 Mini柱（#HUM S18V；The Nest Group Inc.，美国马萨诸塞州南海尔斯堡）按制造商说明进行脱盐。脱盐后，样品在离心浓缩仪（Concentrator Plus，Eppendorf SE，德国汉堡）中干燥。干燥的肽段用30 μL缓冲液A重悬（HPLC级水中含0.1%（vol/vol）TFA、1%（vol/vol）乙腈（#83640.320；VVR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺尔），#10505904；Fisher Scientific UK Ltd.，英国拉夫伯勒）。为进行DIA分析，将重悬的肽段在缓冲液A1（HPLC水中含1%甲酸）中进一步稀释至7.5 ng/μL。取20 μL装载至Evotip中（Evosep Biosystems，丹麦欧登塞），按制造商说明操作，使肽段装载量达到150 ng用于分析。质谱分析与数据处理脱盐后的样品使用Evosep One液相色谱系统（Evosep Biosystems，丹麦欧登塞）联用混合捕获离子淌度四极杆飞行时间质谱仪（Bruker timsTOF Pro，Bruker Daltonics GmbH & Co. KG，德国不莱梅）进行分析，离子化源为CaptiveSpray纳米电喷雾离子源（Bruker Daltonics GmbH & Co. KG，德国不莱梅）。使用8 cm × 150 μm色谱柱，内含1.5 μm C18微珠（EV1109，Evosep Biosystems，丹麦欧登塞）进行肽段分离，采用每天60个样本方法（21分钟梯度时间）。流动相A和B分别为水中0.1%甲酸和乙腈中0.1%甲酸。MS分析在正离子模式下以dia-PASEF方法（具有样本优化的数据独立采集dia扫描参数）进行。我们对混合样本执行DDA-PASEF模式，以便将这些特定样本的dia-PASEF参数优化至最佳状态。为执行样本特定的dia-PASEF参数调整，基于样本特定的DDA-PASEF运行结果，使用软件"timsControl"（Bruker Daltonics GmbH & Co. KG，德国不莱梅）对默认的dia短梯度采集方法进行调节。每种样品类型修改了以下参数：m/z范围：430.0–1337.0；每循环质量步数：37；平均循环时间：1.91秒。离子淌度窗口设置为与特定样品类型DDA运行中最佳匹配离子云密度。为分析diaPASEF数据，原始数据（.d）使用DIA-NN v18.0处理，利用从UniProt绵羊蛋白质组（Uniprot Ovis Aries参考蛋白质组，2024年3月6日下载为FASTA文件，49510个蛋白质）生成的谱图库。生成谱图库时使用以下设置：固定修饰：氨基甲酰甲基（C）；可变修饰：乙酰化（蛋白质N端）、氧化（M）；酶：胰蛋白酶/P；最大漏切数：1；质量精度固定为1.5e?05（MS2）和1.5e?05（MS1）；碎片m/z设置为100–1600；肽段长度设置为7–50；前体m/z设置为200–1700；前体电荷设置为2–4；不执行蛋白质推断。其他所有设置保持默认。质谱蛋白质组学数据已通过蛋白质鉴定数据库（PRIDE）合作伙伴仓库提交至蛋白质组学交换联盟（ProteomeXchange Consortium），数据库标识符：PXD074552。本体分析使用Cytoscape ClueGO插件对来自不同分泌组分组的蛋白质组进行KEGG通路富集分析。用于通路分析的参考数据库为Ovis aries（Taxid: 9940）。流式细胞术用于MV表征，使用TOMM40（1:100；#MBS5400122，MyBioSource，美国加利福尼亚州圣地亚哥）和AREG（5 μL（0.25 μg）/检测；#12-5370-42；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）抗体。此外，使用MitoTracker? Red CM-H2XRos（500 nM；#M7513；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和eBioscience?细胞增殖染料eFluor? 450（10 μM；#65–0842；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。样品用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS；#D8662；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）彻底洗涤，并在补充0.5% BSA（#A3059；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）的DPBS中重悬。流式细胞术使用CytoFLEX SRT系统（Beckman Coulter，美国加利福尼亚州布里亚）进行，每个样品采集10,000个事件。激发使用405 nm和561 nm激光器，荧光在V450和Y585通道中检测，采用标准对数刻度。数据使用CytExpert SRT软件（版本1.2.10004；Beckman Coulter，美国加利福尼亚州布里亚）进行分析和可视化。Western blot每个样品使用RIPA裂解液（#R0278；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）提取总蛋白，补充磷酸酶抑制剂（#39055；SERVA Electrophoresis GmbH，德国海德堡）和蛋白酶抑制剂混合物（#P2714；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），按制造商说明稀释。样品在冰上孵育30分钟，然后在4 °C、12,000 × g条件下离心12分钟。收集上清液，取5 μL使用Quick Start? Bradford 1x染料试剂（#5000205；Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）测定蛋白质浓度。蛋白质在4–15%梯度预制胶（#4568083；Mini-PROTEAN?，Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）上分离，并使用Trans-Blot? Turbo转膜系统和5×转膜缓冲液（#10026938；Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）转至硝酸纤维素膜（#1620145；Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）上。膜使用EveryBlot?封闭缓冲液（#12010020；Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）封闭5分钟。抗AREG（1:200；#AF262；R&D Systems, Inc.，美国明尼苏达州明尼阿波利斯）和一微管蛋白（1:2000；#2146；Cell Signaling Technology）一抗在含1%酪蛋白封闭剂（#1610782；Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）的1× TBS中稀释，于4 °C孵育过夜。HRP偶联的抗山羊二抗（1:5000；#SC-2354；Santa Cruz Biotechnology, Inc.，美国德克萨斯州达拉斯）在相同缓冲液中稀释，在室温下孵育1小时。使用Clarity Max? ECL底物（#1705062；Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）进行检测，信号通过ChemiDoc? MP成像系统（Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）采集。

## 密度分析

密度分析使用ImageJ软件（v1.53k；美国国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）进行，蛋白表达量通过Stain-Free?技术（Bio-Rad Laboratories，意大利米兰）以总蛋白含量进行标准化处理。

## ELISA检测

根据制造商的说明，使用"Sheep Amphiregulin (AREG) ELISA kit"（#MBS044705；MyBioSource，美国南加州圣地亚哥）和"Human Amphiregulin ELISA kit"（#EHAREG；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）检测CM中的AREG浓度。

## 免疫荧光

根据制造商的说明，使用MitoTracker? Green FM（200 nM；#M7514；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和MitoTracker? Red CM-H2XRos（500 nM；#M7513；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）对PBMCs和MVs中的线粒体进行染色。对于MVs的染色，样品先在37°C下与MitoTracker? Red孵育30分钟，然后以25,000 × g离心5分钟，用细胞培养基洗涤两次（每次洗涤后重复离心），随后重悬于培养基或蒸馏水中，供后续在PBMCs和Jurkat报告细胞上使用。然后将细胞与染色后的AEC ± LPSMV暴露12小时。分析使用流式细胞术或共聚焦显微镜进行。对于共聚焦成像，PBMCs和Jurkat细胞的细胞核在室温下用Hoechst 33342（DPBS中1:1000；#62249；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）复染10分钟。Jurkat细胞质在室温下用Calcein AM（DPBS中1:1000；#C3100MP；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）染色30分钟。

## RNA提取

根据制造商的说明，使用Total RNA Purification Kit（#17200；Norgen Biotek Corp.，加拿大安大略省Thorold）提取AECs的总RNA。随后，以每个样品1 μg总RNA为起始材料，使用oligodT引物（#BIO-38029；Bioline，美国俄亥俄州辛辛那提）和Tetro逆转录酶（#BIO-65050；Bioline，美国俄亥俄州辛辛那提），按照制造商的方案进行cDNA合成。

## DNA提取

为评估绵羊MVs的种间转移，在处理12小时后，从每个条件下1 × 10?个Jurkat报告细胞的合并样品以及1 mL AECMV（阳性对照）中提取DNA。根据制造商的方案，使用Quick-DNA Miniprep Plus kit（#D4068；Zymo Research，美国加利福尼亚州欧文）进行提取。使用NanoDrop? 2000c（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）以分光光度法测定DNA浓度和纯度，取1 μL样品，在230、260和280 nm处测量吸光度。

## 实时qPCR

为定量AEC中AREG以及通过MVs介导的线粒体摄取转移至Jurkat报告细胞中的绵羊线粒体DNA（mtDNA），使用SensiFAST SYBR Lo-ROX试剂盒（#BIO-94050；Bioline，美国俄亥俄州辛辛那提）在QuantStudio? 3系统（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上进行三倍重复的实时qPCR，按照制造商的方案操作。热循环程序包括初始95°C变性3分钟，随后40个循环，每个循环95°C 5秒和60°C 30秒。特异性针对绵羊mtDNA的引物（0.5 pmol/μL）使用NCBI Primer-BLAST设计，并通过熔解曲线分析进行验证。mtDNA拷贝数的计算如Takeda等人所述。

- **AREG引物序列（*Ovis Aries*）：** 正向引物 5′-AAGGTGTCGCTGAAGAACGA-3′（Tm: 59.61°C）；反向引物 5′-TGATTCCGATCTGATACCCTGC-3′（Tm: 59.70°C）。
- **mtDNA引物序列（*Ovis Aries*）：** 正向引物 5′-CTAGGCCTGTCCCTACTGGT-3′（Tm: 60.03°C）；反向引物 5′-GCAAGCTGTGAAGTGTGGTG-3′（Tm: 59.97°C）。
- **mtDNA引物序列（*Homo Sapiens*）：** 正向引物 5′-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3′（Tm: 63.0°C）；反向引物 5′-TTAACAACATACCCATGGCCA-3′（Tm: 62.0°C）。
- **AREG引物序列（*Homo Sapiens*）：** 正向引物 5′-GATACTCGGCTCAGGCCATT-3′（Tm: 59.61°C）；反向引物 5′-ATGGTTCACGCTTCCCAGAG-3′（Tm: 60.04°C）。

## PBMCs激活实验

使用PBMC激活实验评估MV分级的免疫调节活性。将PBMCs（2 × 10?个细胞/孔）接种于96孔板中，用10 μg/mL PHA-L（#00-4977-93；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）刺激，并培养48小时，培养条件为有或无AEC ± LPSMV分级。细胞增殖使用eBioscience? Cell Proliferation Dye eFluor? 450（10 μM；#65–0842；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行检测，按照制造商的说明操作。数据以PHA刺激的对照组进行标准化。

## NFAT通路激活实验

使用Jurkat-Lucia? NFAT报告细胞评估不同MV分级对与增殖相关的细胞内免疫信号通路的影响。扩增三代后的细胞以3 × 10?个细胞/孔接种于预先包被CD3（2 μg/mL，#16-0037-81；Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的96孔高结合板（#9018；Corning，美国纽约州）中。培养维持6小时，培养条件为有或无AEC ± LPSMV分级。添加QUANTI-Luc?试剂（#REP-QLC4LG1；InvivoGen，法国图卢兹）后，使用EnSpire?多模式微孔板读数仪（PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测量发光强度。数据以CD3刺激的对照组进行标准化。

## 功能注释和KEGG通路分析

在各分泌组分级中鉴定出的高丰度和低丰度蛋白分别独立进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。检索显著富集的通路，并根据一级KEGG BRITE层级（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）进行分类。将通路归入主要的KEGG功能类别，计算每个类别中富集通路的频率，以概述每个蛋白质数据集所代表的生物学功能。

## 定量和统计分析

AEC（胎儿）和PBMC（动物）样品至少使用三个生物学重复以评估实验间变异性。每个实验重复三次以评估实验内一致性。样本量（n）和统计学显著性在图注中报告。数据以均数 ± 标准差表示。正态性使用D'Agostino和Pearson检验进行测试。对正态分布数据应用双因素ANOVA和适当的非配对t检验，随后进行Tukey事后检验（GraphPad Prism 10，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。显著性水平设定为p ≤ 0.05。

对于蛋白质组数据，用于进一步DIA数据分析的输入文件为DIA-NN Report.pg_matrix。数据预处理使用自定义的内部R脚本完成。原始强度值进行log2转换和中位数标准化。随后使用随机森林插补方法填充缺失值。对于样本组比较，使用Python包scipy中的Student's t检验计算p值，并通过statsmodels包使用Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正。火山图使用GraphPad Prism生成，p值阈值为0.05，log2强度倍数变化阈值为 > +1.5（最丰度蛋白）和 < ?0.67（较少丰度蛋白）。

## 补充信息 (3)

**下载全部PDF (1.15 MB)**

**文件S1.** 图S1和S2

**电子表格 (2.49 MB) 表S1.** 本研究中鉴定到的UniProt参考的*Ovis aries*蛋白质组数据集，与图1相关

该表报告了每种蛋白在所有实验样品中的表达值，包括三个生物学重复中每个重复获得的值。缺失值使用随机森林方法进行了插补。每个蛋白条目均标注了其UniProt登录号、蛋白名称及相应的基因符号。对于样本组间的比较，p值使用Python SciPy包中实现的Student's t检验计算，并使用statsmodels包中实现的Benjamini-Hochberg方法进行多重比较校正。

**电子表格 (4.47 MB) 表S2.** KEGG通路富集分析，与表1相关

该表报告了在指定的分泌组分级比较中，对丰度增加（log2FC > +1.5，p < 0.05）和丰度减少（log2FC < ?0.67，p < 0.05）的蛋白进行的KEGG通路富集分析。功能富集分析使用检索相互作用基因/蛋白工具STRING数据库（v.12.0）针对*Ovis aries*进行，以*Ovis aries*蛋白质组作为统计背景。富集p值使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正，假发现率（FDR）< 0.05的KEGG通路被认为显著富集。对于每条通路，表格报告了观察到的蛋白数、背景蛋白数、富集强度、信号值、FDR及匹配蛋白。蛋白根据其相对丰度排序，前5%最丰度的蛋白以粉色高亮显示。