《Aquaculture Reports》：Fucose and glucosamine addition to alfalfa meal diets improve growth performance, polysaccharide contents, gut microbiota and metabolite profiles of the sea cucumber
Apostichopus japonicus
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摘要：仿刺参（Apostichopus japonicus）的养殖因海藻过度开发而面临挑战。从仿刺参生长性能的角度看，苜蓿草粉已被证明是有前景的海藻粉替代品。然而，关于苜蓿草粉对其他生理参数的影响，目前知之甚少。本研究探讨了苜蓿草粉饲料及在苜蓿草粉饲料中添加岩
摘要：仿刺参（Apostichopus japonicus）的养殖因海藻过度开发而面临挑战。从仿刺参生长性能的角度看，苜蓿草粉已被证明是有前景的海藻粉替代品。然而，关于苜蓿草粉对其他生理参数的影响，目前知之甚少。本研究探讨了苜蓿草粉饲料及在苜蓿草粉饲料中添加岩藻糖和/或氨基葡萄糖对仿刺参生长、多糖含量、肠道菌群及代谢物谱的影响。结果表明，当饲料中的海藻粉完全被苜蓿草粉替代后，仿刺参的生长速度和体壁多糖含量显著降低。添加1%的单糖（岩藻糖或氨基葡萄糖）或复合单糖（岩藻糖和氨基葡萄糖）缓解了苜蓿草粉引起的生长下降。苜蓿草粉增加了肠道菌群中弧菌属（Vibrio）、肠球菌属（Enterococcus）和希瓦氏菌属（Shewanella）的丰度以及肠道代谢物的丰富度，而单糖补充则减少了这些变化。相关性分析显示，仿刺参的增重率（WGR）和特定生长率（SGR）与melophlin、十七烷酸、foetidin和羟基十三烷酸含量呈负相关。综上所述，在苜蓿草粉饲料中添加岩藻糖和/或氨基葡萄糖部分缓解了苜蓿草粉饲料引起的仿刺参生长性能下降，其机制可能是降低了肠道有害菌属弧菌属、肠球菌属和希瓦氏菌属的丰度。
论文解读文章
**研究背景与问题提出**
仿刺参（Apostichopus japonicus）是一种兼具营养与药用价值的海洋生物，其富含多糖、多肽和皂苷等生物活性物质。我国仿刺参产业年产值超过140亿美元，是海洋经济的重要组成部分。仿刺参饲料中通常添加10%–20%的海藻粉（如裙带菜 Undaria pinnatifida），但野生海藻资源因过度开发而短缺，人工养殖海藻也面临供应不稳定和价格波动大等问题，因此亟需寻找海藻粉的替代原料。苜蓿（Medicago sativa L）在我国广泛种植，产量高，是优质的多年生豆科牧草。已有研究表明，苜蓿草粉可部分替代海藻粉而不影响仿刺参的生长性能，但对其肠道菌群、代谢物等生理过程的影响尚不清楚。仿刺参作为底栖沉积食性动物，缺乏消化腺，高度依赖肠道菌群协助消化食物，因此明确苜蓿草粉替代海藻粉对肠道菌群的影响至关重要。
此外，苜蓿草粉缺乏海藻中特有的多糖成分，而多糖对仿刺参的生长和免疫具有多种有益作用。已有研究证明，添加β-葡聚糖、低聚果糖和黄芪多糖可增强仿刺参免疫力、抑制灿烂弧菌感染并提高抗病力。由于多糖由单糖合成，研究人员推测在苜蓿草粉饲料中添加外源单糖可能达到海藻粉饲料的效果。岩藻糖是仿刺参特征性多糖岩藻聚糖（fucoidan）的基本功能单元，氨基葡萄糖则是仿刺参糖胺聚糖的核心组分之一。然而，在苜蓿草粉饲料中添加岩藻糖和/或氨基葡萄糖对仿刺参生长、非特异性免疫及肠道菌群的影响及调控机制，至今尚无研究报道。
**研究目的与实验设计**
本研究采用肠道菌群和代谢组学联合分析，探究苜蓿草粉完全替代海藻粉并添加岩藻糖和/或氨基葡萄糖对仿刺参生长及肠道菌群的影响。具体目标包括：（1）评估完全替代对仿刺参生长和肠道菌群的影响；（2）探究单糖或复合单糖添加能否缓解替代带来的负面影响；（3）揭示肠道菌群的具体调控机制。研究设置了5个饲料组：对照组（C，含14%海藻粉）、苜蓿草粉组（A，完全替代海藻粉）、苜蓿草粉+1%岩藻糖组（F）、苜蓿草粉+1%氨基葡萄糖组（G）和苜蓿草粉+0.5%岩藻糖+0.5%氨基葡萄糖组（FG）。实验采用225只健康仿刺参（初始体重9.24±0.12 g），随机分为15个养殖桶，每组3个重复，养殖周期为2个月。
**主要关键技术方法**
本研究使用了以下关键技术方法：
1. 生长性能测定：记录体重、体长，计算增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、体壁指数（BWI%）和饲料转化率（FCR）。
2. 体壁多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，在490 nm波长下用紫外-可见分光光度计测定。
3. 体腔液免疫酶活性分析：按试剂盒说明测定超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（ALP）和过氧化氢酶（CAT）活性。
4. 16S rDNA高通量测序：扩增肠道内容物细菌16S rDNA V3-V4区，通过QIIME2进行Alpha多样性和Beta多样性分析，并利用Tax4Fun进行KEGG功能预测。
5. 非靶向代谢组学分析：对肠道内容物进行LC-MS/MS检测，使用XCMS平台进行数据处理，并通过PLS-DA、Venn图、ROC分析和KEGG通路富集分析差异代谢物。
6. 统计分析：使用SPSS 26.0进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较，并对生长指标与差异代谢物进行Pearson相关性分析。
样本来源注明：仿刺参为大连某孵化场人工养殖个体；肠道内容物样本取自5个处理组（每组6只个体）；体壁多糖分析每组3个重复；体腔液样本每桶随机取4只个体。饲料原料中白鱼粉购自大连顺鑫鱼粉有限公司，其他原料均为市售。
**研究结果**
**3.1 生长性能**
与对照组相比，苜蓿草粉组仿刺参的体长、终末体重、增重率和特定生长率分别显著降低8%、16%、37%和29%。添加岩藻糖（F组）的WGR和SGR显著高于A组但仍显著低于C组；添加氨基葡萄糖（G组）的终末体重、体长和体壁指数显著高于A组，其中体长和体壁指数甚至显著高于C组；复合添加组（FG组）的所有生长指标均显著高于A组，且WGR和SGR仍显著低于C组。在饲料转化率方面，A组FCR显著高于其余各组，而FG组FCR显著低于C组。
**3.2 抗氧化酶活性**
苜蓿草粉组CAT活性显著高于C组，而SOD和ALP活性无显著差异。F组和G组的SOD活性显著低于A组，但与C组无差异；G组和FG组的CAT活性显著低于A组，且与C组无显著差异。
**3.3 体壁多糖含量**
A组体壁多糖含量显著低于C组；F、G和FG组均显著高于A组，其中G组和FG组与C组无显著差异，F组仍显著低于C组。
**3.4 肠道菌群结构与丰度**
PCoA显示C组与A组菌群明显分离，而F、G、FG组与A组重叠较多。Alpha多样性方面，A组的Chao1指数、观测特征数和Shannon指数均显著升高；单糖添加组的Shannon指数显著低于A组。门水平上，A、F和FG组放线菌门（Actinomycetota）相对丰度显著高于C组。属水平上，A组的Pelagicola属相对丰度显著低于C组，而未分类的军团菌科显著升高；单糖添加降低了未分类军团菌科的丰度。机会致病菌分析显示，A组的弧菌属（Vibrio）、肠球菌属（Enterococcus）和希瓦氏菌属（Shewanella）相对丰度显著高于C组，而单糖添加显著降低了这些属的丰度。KEGG功能预测表明，A组中原发性免疫缺陷和霍乱弧菌感染通路显著富集，单糖添加可调控这些免疫相关通路。
**3.5 肠道代谢物谱**
PLS-DA显示C组与A组代谢物谱明显分离，FG组代谢物谱更接近C组。通过Venn图和ROC分析（AUC≥90%），鉴定出9种共表达的差异代谢物作为生物标志物：儿茶素（catechin）、melophlin、十七烷酸、苦艾素（absinthin）、eupalinolide、foetidin、umbellacin、garcinisidone和羟基十三烷酸。除苦艾素和儿茶素外，A组中其他代谢物水平均显著高于C组，而FG组较A组显著降低。KEGG通路富集分析显示，胆汁分泌、胰高血糖素信号通路、类固醇激素生物合成和赖氨酸生物合成通路显著富集。
**3.6 代谢物与生长指标的相关性**
Pearson相关性分析表明，WGR和SGR与melophlin、十七烷酸、foetidin和羟基十三烷酸呈负相关；FCR则与上述代谢物呈正相关，而与儿茶素和苦艾素呈负相关。
**讨论与结论**
讨论部分指出，苜蓿草粉完全替代海藻粉导致的生长抑制可能与其高纤维素含量（约25%）有关，显著高于褐藻的2.2%–10.2%，使得仿刺参难以有效消化。单糖添加，尤其是复合添加，可通过调节肠道菌群来减轻生长抑制。苜蓿草粉增加了肠道微生物丰度和多样性，这可能是由于膳食纤维为微生物提供了多种碳源。岩藻糖和/或氨基葡萄糖的添加降低了弧菌属和肠球菌属等机会致病菌的丰度，并下调了原发性免疫缺陷和霍乱弧菌感染通路。苜蓿草粉组升高的抗氧化酶活性可能是一种炎症相关氧化应激的代偿反应。虽然观察到了体壁多糖含量的增加，但肠道菌群是否直接参与多糖合成仍需进一步验证。此外，苦艾素可能来源于饲料中的植物残留物。
研究结论部分总结：完全用苜蓿草粉替代海藻粉抑制了仿刺参的生长，并增加了肠道有害菌属（如弧菌属和肠球菌属）的丰度。单独或复合添加单糖改变了肠道菌群丰度并改善了生长性能，其中复合添加的效果优于单独添加。本研究强调了优化饲料配方对改善肠道菌群的重要性，并为开发促生长的益生菌和益生元提供了理论基础。该研究发表于《Aquaculture Reports》。
