KMT5A通过表观遗传调控Notch信号通路维持肌肉干细胞的静息状态

《iScience》：KMT5A maintains muscle stem cell quiescence through epigenetic regulation of Notch signaling

　　

要点
• KMT5A通过维持Notch信号通路来保持肌肉干细胞静息状态
• KMT5A依赖的H4K20me1在Notch位点维持转录能力
• 恢复Notch信号通路可挽救Kmt5a缺陷肌肉干细胞的静息状态
• 生理性激活期间，H4K20me3在H4K20me1标记的Notch位点积累

摘要
静息状态能够维持肌肉干细胞（MuSC）的干性身份和再生能力，但支持这一状态的染色质机制尚未被完全阐明。在这里，我们证明H4K20单甲基转移酶KMT5A通过催化沉积H4K20me1来维持静息MuSC中的经典Notch信号通路。Kmt5a缺失导致Rbpj及其他经典Notch通路基因的下降出现延迟，而KMT5A的急性催化抑制足以抑制其表达，表明H4K20me1支持Notch位点的转录能力。通过基因手段恢复Notch信号通路可挽救Kmt5a缺陷MuSC中的静息相关特征，但未能恢复激活后的存活能力或再生输出。在损伤后的生理性激活过程中，Notch位点的H4K20me1在大部分情况下得以保留，而H4K20me3则发生积累。综上，这些发现将KMT5A依赖的H4K20me1确定为一种染色质机制，该机制维持Notch依赖的静息程序，并区分了稳态下Kmt5a的丧失与MuSC的生理性激活。

图形摘要

引言
骨骼肌干细胞（MuSCs），又称卫星细胞，在稳态条件下处于可逆的、非分裂的静息状态，从而维持骨骼肌的干细胞池和再生能力。1 当发生损伤时，MuSCs退出静息状态，被激活、增殖并产生成肌后代以修复受损纤维，同时一部分细胞进行自我更新并重新进入静息状态，以补充干细胞储备。2 因此，静息状态与激活状态之间精确的调控平衡对于防止干细胞耗竭并确保终生肌肉再生至关重要。

多种来自微环境的信号和内在通路汇聚以维持MuSC静息状态，其中经典Notch信号通路作为关键调节因子发挥作用。3 Notch受体的激活会释放Notch胞内域（NICD），NICD与Notch的主要转录效应因子RBPJ结合，驱动维持干细胞状态的基因表达。? Rbpj的基因消融导致MuSCs自发激活和干细胞池耗竭，? ? 这表明持续的Notch活性对于维持静息状态是必需的。然而，尽管其重要性已知，染色质机制如何在静息状态下稳定Notch信号通路仍未被完全理解。

新兴证据表明，染色质调节因子与Notch等信号通路协同作用以维持MuSC静息状态。例如，Polycomb复合物蛋白EZH1通过一种不依赖于其经典H3K27甲基转移酶活性的机制，维持Notch信号通路来保持静息状态。? 然而，支持Notch依赖的静息状态的染色质修饰因子的范围，以及组蛋白修饰是否在MuSC静息状态下以表观遗传学方式维持经典Notch通路位点的转录能力，仍未得到完全表征。KMT5A（SETD8/PR-Set7）是唯一催化组蛋白H4赖氨酸20（H4K20）单甲基化（H4K20me1）的酶，最近被发现是MuSC静息状态的关键调节因子。? H4K20me1可作为底物被进一步甲基化为H4K20me2和H4K20me3，分别由KMT5B和KMT5C催化。? 1? 虽然H4K20me1与染色质开放性和管家基因的转录能力有关，但H4K20me3富集于异染色质区域，被广泛认为是一种抑制性组蛋白修饰。? 我们此前已证明，MuSCs中Kmt5a的丧失会触发自发性的、渐进性的静息状态退出，随后发生铁死亡性细胞死亡。? 虽然这些发现确立了KMT5A对干细胞完整性的必要性，但KMT5A在分子水平上如何维持静息状态的机制仍不清楚。

在这里，我们利用小鼠遗传学、转录组学和表观基因组学分析相结合的方法，证明KMT5A通过催化沉积H4K20me1来维持静息MuSCs中的经典Notch信号通路，从而维持干细胞静息状态。

结果

KMT5A催化活性维持静息MuSCs中的经典Notch信号通路

我们此前报道了组蛋白甲基转移酶KMT5A维持H4K20me1对于保持MuSC静息状态和存活至关重要，但KMT5A如何维持静息状态仍不清楚。

对我们先前发表的来自野生型（WT）和Kmt5a敲除（KO）MuSCs的转录组学数据集（源自诱导型Kmt5a MuSC特异性KO小鼠，Pax7CreERT2/+; Kmt5afl/fl [Kmt5aKO]）的再分析显示，经典Notch通路基因显著下调（图1A）。鉴于Notch信号通路在MuSC静息状态中的核心作用，我们探究KMT5A是否作用于Notch转录程序的上游。在下调基因中，Rbpj受影响的程度最为显著（图1A）。由于RBPJ是经典Notch信号通路必需的DNA结合效应因子且对MuSC静息状态至关重要，? ? 我们在Kmt5aKO MuSCs中验证了其表达水平。Kmt5a删除后，Rbpj mRNA和RBPJ蛋白水平均降低（图1B和1C），表明Kmt5a的丧失损害了经典Notch信号通路的核心组分。

图1 KMT5A催化活性维持静息MuSCs中的经典Notch信号通路

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（A）来自WT和诱导型Kmt5a敲除小鼠的MuSCs在删除后6周的RNA测序分析（n = 3只/条件）显示经典Notch信号通路基因显著下调。数据以log?倍变的heatmap形式展示。
（B）MuSCs中Kmt5a删除6周后Rbpj转录本水平的RT-qPCR分析。
（C）KMT5A KO小鼠MuSCs中RBPJ蛋白水平的免疫印迹分析，删除后6周。KMT5A确认敲除效率；H4K20me1和总H3分别作为修饰和内参对照。
（D）Kmt5a删除6周后核心Notch通路组分（Notch1）和下游靶基因（Hes1和Hey1）的RT-qPCR分析。
（E）WT（白色）、Kmt5a缺失（橙色）和IgG对照（灰色）MuSCs中Rbpj转录起始位点（TSS）的KMT5A占位CUT&RUN-qPCR分析。
（F–H）用KMT5A选择性催化抑制剂UNC0379（Kmt5a i）处理24小时后的KMT5A（G）和H4K20me1（H）免疫印迹（F）及定量分析。催化抑制降低了H4K20me1但未改变KMT5A蛋白水平（n = 3次独立实验）。
（I）KMT5A抑制剂（KMT5A i）或溶剂（veh）处理后Notch通路基因和成肌分化标志物的RT-qPCR分析。数据以归一化倍变 ± SD表示（n = 3只/条件）。
（J）Notch通路位点（Hes1和Rbpj）H4K20me1的代表性基因组浏览器轨迹，显示Kmt5a删除1周后染色质占位减少。

统计分析：RT-qPCR和免疫印迹定量分析采用Welch t检验（双尾）或单因素ANOVA（B和D）。精确p值和校正p值见图中报告。数据以均值 ± SD表示。

我们接着探究KMT5A丧失是否影响更广泛的Notch转录程序。包括Notch1、Hes1和Hey1在内的代表性通路组分和靶基因的表达在Kmt5a删除后并未立即下降，而是呈渐进性下降，在删除6周后明显减少（图1B和1D）。这表明KMT5A赋予Notch位点转录能力，而非作为急性转录激活因子发挥作用。这些延迟的动力学特征与我们此前观察到的结果一致，即在Kmt5a有效敲除的情况下，MuSCs的静息状态在体内呈渐进性而非同步性破坏，且MuSCs的丧失在数周内呈渐进性和随机性发生。与直接的染色质结合一致，CUT&RUN-qPCR显示WT MuSCs中Rbpj转录起始位点存在KMT5A富集，而在Kmt5a缺失细胞中该富集消失（图1E）。

为了检验这种调控是否依赖于催化活性，并补充渐进性的体内敲除模型，我们用UNC0379急性抑制了KMT5A的酶活性。UNC0379迅速降低了H4K20me1而未改变KMT5A蛋白水平（图1F–1H），从而在MuSC状态明显破坏之前实现了KMT5A催化功能的急性扰动。在这些条件下，Rbpj、Hes1、Hey1和Notch1转录本减少，未观察到协调的成肌激活/分化反应，Pax7和Myf5保持不变，MyoD显示轻度增加（图1I）。这些发现表明，KMT5A催化活性丧失后Notch通路表达受损可急性发生，并非仅由长期静息状态破坏的继发后果。CUT&Tag分析进一步显示，静歇MuSCs中Notch通路位点存在强烈的H4K20me1富集，而Kmt5a删除1周后该富集显著降低（图1J）。综上，这些数据表明KMT5A催化活性通过维持H4K20me1来维持静息MuSCs中经典Notch通路基因的表达。

恢复Notch信号通路可挽救Kmt5aKO MuSCs中的静息状态

在确立了KMT5A维持静息MuSCs中Notch信号通路的基础上，我们接着检验Notch活性降低是否解释了Kmt5a缺陷MuSCs中的静息缺陷。为了恢复经典Notch信号通路，我们将Pax7CreERT2/+; Kmt5afl/fl小鼠与ROSANICD小鼠杂交，实现了tamoxifen诱导的MuSC特异性NICD表达。给予tamoxifen后，双突变MuSCs表现出与Kmt5a缺失细胞相当的Kmt5a表达有效丧失，证实NICD过表达并未恢复Kmt5a水平（图2A）。NICD表达在Kmt5a缺失MuSCs中恢复了Rbpj、Hes1和Notch1的表达（图2A），与经典Notch信号通路的重新激活一致。

图2 强制Notch激活可在KMT5A缺失的情况下恢复静息状态

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（A）将Pax7CreERT2/+; Kmt5afl/fl小鼠与ROSANICD小鼠杂交，产生tamoxifen诱导的MuSC特异性双突变体（Kmt5aKO;NICD）。RT-qPCR分析证实NICD过表达可恢复经典Notch通路基因（Rbpj、Hes1、Notch1）的表达，但未恢复Kmt5a的表达。qPCR在tamoxifen给药6周后进行。
（B–D）tamoxifen诱导后6周的MuSC静息状态稳态分析。进行Pax7和Ki67免疫荧光染色以评估MuSC总数（Pax7?；白色箭头）和增殖MuSCs（Pax7?Ki67?）。比例尺，50 μm（上）和25 μm（下）。NICD过表达可防止Pax7?干细胞池的耗竭，并减少Kmt5aKO MuSCs中观察到的异常激活。（C）和（D）为定量结果。除另有说明外，数据以均值 ± SD表示。统计显著性通过单因素ANOVA和多重比较校正确定（如适用）。精确p值和校正p值见图中报告。

见图S1获取相关内容。

在稳态条件下，强制NICD表达防止了Pax7?干细胞池的耗竭，并减少了Kmt5aKO背景下Ki67? MuSCs的比例（图2B–2D）。这些数据表明，Notch信号通路降低是Kmt5a缺陷MuSCs中静息状态不稳定的主要驱动因素，且在稳态条件下恢复Notch活性足以维持静息相关特征。

我们接着检验NICD恢复是否也能挽救损伤后的结局。在损伤后21天，Kmt5aKO;NICD肌肉表现出与Kmt5aKO肌肉相当的重度再生障碍（图S1A–S1C）。两种基因型均缺乏WT肌肉中看到的再生相关的中央核纤维大小峰值（图S1B和S1C）。同样，损伤后21天（dpi）Pax7? MuSCs的定量分析显示，Kmt5aKO和Kmt5aKO;NICD肌肉中MuSC池几乎完全耗竭（图S1D）。为了独立于再生环境评估MuSC命运，将新鲜分离的MuSCs贴板并在体外监测。WT MuSCs保持存活，而Kmt5aKO和Kmt5aKO;NICD MuSCs均表现出从72小时开始明显下降、至96小时加重的存活能力下降（图S1E）。综上，这些发现表明，恢复Notch活性可挽救静息相关特征，但在KMT5A缺失的情况下不足以恢复激活后的存活能力或再生输出。

MuSCs的生理性激活与静息相关Notch位点H4K20me3的积累相关

鉴于Kmt5a删除通过丧失H4K20me1使静息状态不稳定，我们探究了损伤期间的生理性静息状态退出是否同样涉及Notch相关位点H4K20me1的丧失。为了将染色质数据置于转录背景下，我们首先使用已发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（图3A）绘制了成人肌肉发生过程中Notch通路基因的表达图谱。包括Hes1、Hey1和Rbpj在内的静息相关Notch基因在静息MuSCs中最高，在损伤后2天（dpi）降低，并随再生进程重新表达（图3A），与先前的研究一致。11 与经典Notch效应因子Rbpj不同，旁系同源基因Rbpjl（据报道对经典Notch激活无响应）在这些数据集中表现出独特的表达动态。

图3 MuSCs的生理性激活与Notch信号通路位点H4K20me3的积累相关

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（A）肌肉发生过程中MuSCs中Notch基因集表达的heatmap。数据来自公开的scRNA-seq数据集GEO：GSE138826。
（B）静息和激活MuSCs中Notch基因集H4K20me1和H4K20me3的heatmap和meta-gene谱，按H4K20me3差异信号排序。H4K20me1保持稳定，而H4K20me3在激活后增加。MuSCs在BaCl?诱导损伤后在体内激活，并在2 dpi时收集。
（C）激活MuSCs与静息MuSCs之间CUT&Tag信号差异（A ? Q）在基因体（TSS-TES）上的meta-gene谱。

与全局图谱（浅色线）相比，Notch基因集（深色线）在激活后表现出更强的H4K20me3增加。(D) Ncor2和Rbpj位点在静止和激活MuSC中H4K20me1和H4K20me3占位率的代表性基因组浏览器轨道，表明激活后H4K20me3信号增加，而H4K20me1并未相应减少。我们随后对新鲜分离的静止MuSC和BaCl2损伤后体内激活2天的MuSC进行了H4K20me1和H4K20me3的CUT&Tag分析。由于Notch通路基因在MuSC激活期间（图3A）和Kmt5a敲除后（图1）减少，我们最初预期这些位点的H4K20me1会下降。然而，Notch基因集的H4K20me1在激活的MuSC中基本保持不变，而H4K20me3则显著增加（图3B–3D）。由于H4K20me1是进一步甲基化为H4K20me3的底物，这些数据与生理激活过程中Notch位点向H4K20三甲基化方向的进展一致。基因元分析进一步显示，与全局基因图谱相比，Notch基因集的H4K20me3增加更为显著（图3C）。因此，生理激活并不伴随Notch位点H4K20me1的丢失，而是与H4K20me3的积累相关，这与MuSC退出静止状态时这些基因更为抑制性的染色质状态一致，尽管这种积累的功能意义仍有待确定。这些结果区分了伴随生理激活的染色质变化与稳态下Kmt5a敲除所触发的染色质变化。特别是，损伤驱动的静止退出与Notch位点H4K20me3的积累相关，而非H4K20me1的减少，表明静止状态的遗传不稳定化与生理激活可能伴随不同的H4K20甲基化动力学（图4）。图4 MuSC状态转换过程中H4K20甲基化动力学的阶段特异性模型。在稳态MuSC中，KMT5A依赖的H4K20me1维持Notch转录和静止状态（A）。Kmt5a敲除导致H4K20me1丢失而无H4K20me3的代偿性积累，导致表观遗传崩溃和静止状态不稳定（B）。相反，损伤驱动的激活以Notch位点H4K20me3的积累为特征，反映的是受调控的染色质重塑而非维持机制的丧失（C）。使用BioRender制作。讨论MuSC静止状态的维持需要主动强化休眠强制通路，同时保留对再生信号的响应能力。经典Notch信号传导是这一平衡的核心，而Notch-RBPJ信号传导的破坏会 destabilize 成年MuSC的静止状态并耗竭干细胞池。生态位水平的通路如Notch-COLV-CALCR轴进一步表明，Notch信号传导不仅仅是许可性的，更是MuSC体内静止状态的主动稳定器。近期研究还强调Notch输出在不同肌源性阶段和细胞状态中具有高度上下文依赖性，包括Dll1的阶段特异性功能以及Notch激活在肌源性后期阶段的不同效应。在这一框架下，我们的研究鉴定出KMT5A依赖的H4K20me1是一种支持静止Notch程序的表观遗传机制。我们的发现补充了越来越多的证据，即多个生物化学上不同的染色质调节因子通过机制各异的途径汇聚到经典Notch信号传导以维持MuSC静止状态。EZH1是一种催化活性减弱的Polycomb同源蛋白，同样在静止MuSC中维持Notch信号传导，但通过一种独立于其H3K27甲基转移酶活性的机制实现。相比之下，本研究鉴定了一种直接的组蛋白甲基化机制，其中KMT5A催化活性维持经典Notch通路位点的H4K20me1，从而在静止MuSC中保留其转录能力。综合来看，这些研究表明，Notch依赖的静止状态至少由两个平行的表观遗传层次主动维持。KMT5A依赖的H4K20me1与EZH1是调节重叠还是不同的Notch靶位点，以及这些机制是独立还是协同运作，将是未来工作的重要问题。Kmt5a的丢失导致Rbpj和经典Notch通路基因逐步减少。KMT5A的急性催化抑制表型复制了这一转录效应，与H4K20me1在维持转录能力而非急性激活转录中的作用一致。重要的是，可诱导Kmt5a敲除模型中观察到的延迟动力学很可能是具有生物学意义的，而非系统的局限性。尽管Notch相关位点的H4K20me1在Kmt5a敲除后迅速下降，但Notch通路转录本的减少随时间推移变得更加明显。这与KMT5A作为表观遗传维持因子而非急性转录激活因子的拟议作用一致。在可诱导成年敲除系统中，残留的KMT5A蛋白和预存的染色质状态可能在有效遗传重组后暂时保留转录能力。此外，我们此前的研究表明，Kmt5a敲除后H4K20me1的侵蚀和MuSC的丢失是逐步发生的，而非均匀或立即发生的。综合这些观察，支持一种模型，即KMT5A依赖的H4K20me1稳定了一种允许经典Notch通路表达的染色质环境，而该状态的逐步不稳定化导致转录延迟下降。然而，由于慢性Kmt5a敲除模型随时间推移逐渐破坏MuSC静止状态，我们不能完全排除观察到的Notch转录减少部分反映的是MuSC状态变化的二次性强化，而非纯粹是Notch位点初级染色质介导调控的可能性。NICD的遗传恢复纠正了稳态条件下与静止状态相关的特征，表明受损的Notch信号传导是Kmt5a缺陷MuSC中过早激活表型的主要驱动因素。强制表达NICD也部分恢复了Kmt5a缺失细胞中Rbpj转录本水平。Notch通路中的正反馈结构已在其他情境中被描述，此类机制可以解释这一观察；其在MuSC中的基础未在本研究中进一步探讨。与此同时，NICD未能恢复激活后的存活或再生输出。与其说这是模型的局限性，不如说NICD恢复的不完全拯救与KMT5A在MuSC生物学中的广泛功能一致。我们课题组此前的研究证明，KMT5A不仅对维持MuSC静止状态是必需的，而且对激活后保护免于铁死亡也是必需的。因此，尽管在稳态条件下恢复NICD足以挽救静止状态相关特征，但在缺乏KMT5A的情况下NICD表达无法恢复激活后存活或再生能力并不意外。重要的是，尽管先前的研究确立了KMT5A对MuSC稳态至关重要，并证明Kmt5a丢失破坏静止状态，但其维持静止状态的分子机制仍不清楚。本研究通过鉴定一条KMT5A-H4K20me1轴——该轴保持经典Notch通路基因的转录能力，作为支持MuSC静止状态的关键染色质基础机制——填补了这一空白。综合来看，这些发现表明KMT5A通过Notch依赖的静止模块和激活后维持长期干细胞适应性所需的额外通路共同稳定MuSC状态。由于Kmt5a敲除通过Pax7CreERT2仅限于MuSC区室，这里观察到的分子和离体表型有力地支持KMT5A具有MuSC内在性作用。然而，体内观察到的再生缺陷可能反映了MuSC内在功能障碍与再生组织环境相互作用的综合后果。这与先前研究一致，即Notch配体可以在体外促进干性状态而不能完全保留再生能力，强化了Notch相关身份的维持与长期再生能力是相关但非同一特性的观点。本研究还与此前将H4K20依赖的染色质组织与MuSC静止状态联系的研究一致。Suv4-20h1依赖的兼性异染色质限制MuSC激活并保留长期再生能力。因此，H4K20甲基化通路中的不同步骤似乎通过不等价的染色质机制支持MuSC稳态。较高的H4K20甲基化状态可以强化异染色质相关构型，而H4K20me1可以支持包括Notch基因在内的选定位点的转录能力。我们研究中最出乎意料的观察是生理激活并未简单地模拟Kmt5a敲除。尽管Kmt5a丢失减少了Notch位点的H4K20me1并导致静止状态不稳定，但损伤诱导的激活并未伴随H4K20me1的类似减少。相反，Notch基因集的H4K20me3增加。在其他系统中，H4K20me3积累与转录沉默相关，因此MuSC激活可能涉及静止状态相关位点向更为抑制性的H4K20状态的方向性进展。然而重要的是，我们的数据直接证明了特定位点H4K20me3的积累。因此我们提出，稳态Kmt5a敲除与生理激活占据不同的染色质状态，而非同一转换的简单变体。这一区别可能有助于解释为什么Kmt5a丢失不能产生有效的再生转换。在我们此前的工作中，病理条件导致的H4K20me1丢失引起MuSC自发激活，随后发生铁死亡性丢失。本研究现在表明，早期静止缺陷很大程度上是通过无法维持经典Notch信号传导介导的。综合来看，这些发现表明KMT5A依赖的H4K20me1在多个层次上保持MuSC稳态，通过在静止细胞中维持Notch依赖的静止程序并支持激活后存活所需的额外功能。H4K20me3的沉积是否在激活过程中对静止状态相关基因的有效抑制是功能必需的，这些H4K20动力学在全基因组范围内的选择性如何，以及它们如何与Notch信号传导的其他生态位和染色质基础调节因子交叉，将是未来工作的重要问题。研究局限性虽然生理激活与Notch相关位点H4K20me3积累的增强相关，但我们的数据并未证明H4K20me3沉积对Notch抑制或激活是功能必需的。未来的研究将需要确定这一转换的功能意义。H4K20me2动力学未直接检测。虽然H4K20me2由H4K20me1下游产生且在MuSC中相对稳定，但位点特异性的H4K20me2动力学是否对KMT5A下游的转录调控有贡献仍是未来研究的有趣问题。此外，本研究中的所有体内实验均使用雄性小鼠进行，这可能限制了我们发现的跨性别泛化性。未来纳入雄性和雌性小鼠的研究对于确定KMT5A介导的Notch信号传导和MuSC静止状态调控是否在性别间保守将非常重要。资源可用性主要联系人如需进一步信息和资源，请联系主要联系人Roméo S. Blanc（[e-mail]）。材料可用性本文不报告新的独特试剂。数据和代码可用性•本研究中产生的CUT&Tag测序数据已存储于基因表达综合数据库（GEO）中，并公开可用。登录号列于关键资源表中。本文还分析了GEO中现有的公开数据集；登录号列于关键资源表中。•本文不报告原始代码。•重新分析本文所报告数据所需的任何附加信息可从主要联系人处应请求获得。致谢本工作部分由威斯康星大学麦迪逊分校（UW-Madison）提供给R.S.B.的启动资金支持，包括细胞与再生生物学系、副校长研究办公室（UW-Madison）、UW Carbone癌症中心和UW-Madison干细胞与再生医学中心的支持，以及美国国立老龄研究所（K99/R00AG071736，R.S.B.）的支持。我们感谢细胞与再生生物学系暑期本科生实习项目对A.Y.C.的资助。我们还感谢Audrey Kopp和Marjorie Brand博士慷慨分享其CUT&Tag专业知识和试剂。作者贡献构思，R.S.B.；方法学，J.H.H.、A.Y.C.和R.S.B.；调查研究，J.H.H.和R.S.B.；初稿撰写，J.H.H.和R.S.B.；审阅与编辑，J.H.H.、A.Y.C.和R.S.B.；经费获取，R.S.B.；资源，R.S.B.；监督，R.S.B.。利益声明作者声明无利益冲突。写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明在准备本工作期间，作者使用了ChatGPT（OpenAI）以协助语言润色和稿件编辑。在使用该工具或服务后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对出版内容承担全部责任，该内容反映了他们的原创科学工作。

本研究中未使用人工智能工具进行数据分析、解释或原创科学内容的生成。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| 兔单克隆抗-H4K20me1抗体 | Abcam | Ab177188; RRID: AB_3674578 |
| 兔多克隆抗-H4K20me3抗体 | Abcam | ab9053; RRID: AB_306969 |
| 豚鼠抗兔IgG（H + L）二抗 | Novus Biologicals | NBP1-72763; RRID: AB_11024108 |
| 小鼠单克隆抗-Pax7抗体 | 发育研究所杂交瘤库（DSHB） | RRID: AB_528428 |
| 兔抗-KMT5A/SETD8抗体 | Milli-pore | 06–1304; RRID: AB_1977488 |
| 兔抗-KMT5A/SETD8抗体 | Cell Signaling Technology | 2996; RRID: AB_2254384 |
| 兔多克隆抗-Laminin（LAMA1）抗体 | Sigma-Aldrich | L9393; RRID: AB_477163 |
| 兔抗-Ki67抗体（Alexa Fluor 488偶联） | Cell Signaling Technology | 11882; RRID: AB_2687824 |
| 兔多克隆抗-H3K4me3抗体 | Abcam | ab8580; RRID: AB_306649 |
| 小鼠单克隆GAPDH抗体 | Invitrogen | AM4300; RRID: AB_437392 |
| 小鼠单克隆抗-RBPJ抗体 | Santa Cruz | sc-271128; RRID: AB_10610612 |
| 兔多克隆抗-Histone H3抗体 | Abcam | Ab1791; RRID: AB_302613 |
| IgG阴性对照抗体 | Epicypher | 13–0042; RRID: AB_2923178 |
| 兔单克隆抗-H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733S; RRID: AB_2616029 |
| 山羊抗兔IgG（H + L）二抗，DyLight? 488 | Invitrogen | 35552; RRID: AB_844398 |
| 山羊抗小鼠IgG（H + L）二抗，DyLight? 488 | Invitrogen | 35502; RRID: AB_844397 |
| **化学试剂、多肽及重组蛋白** | | |
| UNC0379（KMT5A催化抑制剂） | MedChemExpress | HY-12335 |
| 氯化钡（BaCl?）二水合物 | Sigma-Aldrich | B0750 |
| 胶原酶II型 | Gibco | 17101–015 |
| 分散酶 | Gibco | 17105–041 |
| BioMag?Plus 刀豆蛋白A | Bangs Laboratories | BP531 |
| 预载MEDS连接子的pA-Tn5融合蛋白 | Li等（Dr. Marjorie Brand实验室，威斯康星大学麦迪逊分校） | N/A |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 300410 |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S2626 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| SsoFast? EvaGreen? Supermix | Bio-Rad | 1725202 |
| ECL试剂 | Bio-Rad | 1705061 |
| 无EDTA cOmplete蛋白酶抑制剂混合液 | Roche | 04693132001 |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合液 | Roche | 4906845001 |
| Geltrex? LDEV-Free 低生长因子基底膜基质（ECM） | Gibco | A14132-02 |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100–01 |
| 酚-氯仿 | Fisher BioReagents? | BP1752I-400 |
| 异氟烷 | Dechra | N/A |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| Tissue-Tek O.C.T.复合组织包埋剂 | SAKURA | 4583 |
| Mouse-on-Mouse IgG封闭液 | Invitrogen | R37621 |
| 蛋白酶K | Invitrogen | 25530–015 |
| TCM? 定义血清替代物 | MP Biomedicals | 2010026 |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch | 005–000–121 |
| **关键商业试剂盒** | | |
| 卫星细胞分离试剂盒，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130–104–268 |
| 抗整合素α-7微珠，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130–104–261 |
| CUTANA CUT&RUN试剂盒 | Epicypher | 14–1048 |
| Qubit 1× dsDNA高灵敏度（HS）检测试剂盒 | Invitrogen | Q33230 |
| PicoGreen | Invitrogen | P7581 |
| NEBNext? 高保真2× PCR Master Mix | New England Biosystems | M0541S |
| **已存数据** | | |
| CUT&Tag | 本文 | GEO: GSE324960 |
| Bulk RNA-seq | Blanc等 | GEO: GSE228013 |
| scRNA-seq | Oprescu等 | GEO: GSE138826 |
| scRNA-seq | Blanc等 | GEO: GSE228055 |
| mm10参考基因组 | UCSC基因组浏览器 | https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/ |
| ENCODE DAC黑名单区域 ENCFF547MET | memiya等 | ENCODE: ENCFF547MET |
| **实验模型：生物体/品系** | | |
| 小鼠：C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664; RRID: IMSR_JAX:000664 |
| 小鼠：Pax7CreERT2 | Jackson Laboratory | 017763; RRID: IMSR_JAX:017763 |
| 小鼠：Kmt5afl/fl | Myers等 | N/A |
| 小鼠：Kmt5afl/fl; Pax7CreERT2/+（Kmt5aKO） | 本文 | N/A |
| 小鼠：ROSA NICD | Pan等 | N/A |
| 小鼠：Kmt5afl/fl; ROSA NICD; Pax7CreERT2 | 本文 | N/A |
| **寡核苷酸** | | |
| qRT-PCR引物 | 本文 | 表S1 |
| 通用i5和i7引物 | Li等 | N/A |
| **软件和算法** | | |
| Trim Galore（v0.6.10-1） | Kreuger | https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore |
| Bowtie2（v2.5.4） | Langmead等 | https://github.com/benlangmead/bowtie2 |
| Samtools（v1.22.1） | Danecek等 | https://github.com/samtools/samtools |
| Picard（v3.4.0） | Broad Institute | https://github.com/broadinstitute/picard |
| bedtools（v2.31.1） | Quinlan和Hall | https://github.com/arq5x/bedtools2 |
| deepTools（v3.5.6） | Ramírez等 | https://github.com/deeptools/deeptools |
| IGV（基因组综合浏览器） | Robinson等 | https://github.com/igvteam/igv |
| Seurat（v5.4.0） | Hao等 | https://github.com/satijalab/seurat |
| ComplexHeatmap R包 | Gu等 | https://github.com/jokergoo/ComplexHeatmap |
| GraphPad Prism（v9或v10） | GraphPad Software | https://www.graphpad.com |
| R（v4.x） | R核心团队 | https://www.r-project.org |
| ImageJ2/FIJI（v1.52, 1.53, 1.54p） | Reuden等；Schindelin等 | https://fiji.sc |
| Echo PRO软件（v4.2） | Echo | https://discover-echo.com |
| LI-COR Image Studio软件 | Li-COR Biotech | https://www.licorbio.com/image-studio |
| **其他** | | |
| Echo Revolve荧光显微镜 | ECHO | Revolve2-K4-2259 |
| LI-COR Odyssey Fc成像仪 | LI-COR Biosciences | N/A |
| 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | 4351106 |
| gentleMACS Octo组织解离仪（带加热模块） | Miltenyi Biotec | 130–134–029 |
| MultiMACS Cell24分离器Plus | Miltenyi Biotec | 130–098–637 |
| DynaMag?-2磁铁 | Invitrogen | 12321D |

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**实验模型和受试者详情**

**小鼠**

本研究中所有动物实验均按照罗切斯特大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南进行（方案编号2013-002e；参考编号102192），以及威斯康星大学麦迪逊分校（方案编号M006850）。罗切斯特大学医学中心的比较医学部和威斯康星大学麦迪逊分校的研究动物资源与合规单位提供了方案监管和动物护理合规监督。生物安全方案经罗切斯特大学医学中心机构生物安全委员会和威斯康星大学麦迪逊分校生物安全办公室审查并批准。本研究按照美国国立卫生研究院和美国国立老龄化研究所制定的指南进行，适用时予以遵循。

雄性C57BL/6J成年小鼠（4–6月龄；#000664；Jackson Laboratory）用于实验。Pax7CreERT2/+; Kmt5afl/fl [Kmt5aKO] 小鼠通过交配Kmt5afl/fl（由URMC Dr. Laurie Steiner赠送）和Pax7CreERT2（#017763；Jackson Laboratory）获得。Kmt5afl/fl; ROSA NICD; Pax7CreERT2小鼠通过交配ROSA NICD Notch功能获得性等位基因（由URMC Dr. Kiernan慷慨赠送）和我们的Pax7CreERT2/+; Kmt5afl/fl获得。在比较野生型（WT）和Kmt5aKO条件的实验中，Cre阴性同窝小鼠（Kmt5afl/fl，无Cre）作为WT对照。条件性敲除通过他莫昔芬（T5648；Sigma-Aldrich）连续5天给药诱导。KOim指在最后一步他莫昔芬注射后一天收集的小鼠，而KO6weeks指他莫昔芬给药后6周收集的小鼠。

对于再生实验和激活MuSCs，小鼠使用异氟烷（Dechra）短暂麻醉，然后用1.2%的氯化钡（B0750；Sigma-Aldrich）生理盐水溶液50-80μL注射到胫前肌（TA）中。

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**原代肌肉干细胞分离和培养**

为分离MuSCs，新鲜取出后肢骨骼肌，使用gentleMACS Octo组织解离仪（带加热模块）（130–134–029；Miltenyi Biotec），在胶原酶II（17101-015；Gibco）和分散酶（17105-041；Gibco）溶液中进行解离，然后使用卫星细胞分离试剂盒（130–104–268；Miltenyi Biotec）和抗整合素α-7微珠（130–104–261；Miltenyi Biotec）进行磁珠激活细胞分选（MACS）（130–098–637；Miltenyi Biotec），方法如先前所述。

分离后，新鲜分离的MuSCs直接进行分子分析，但KMT5A抑制剂处理除外，后者将细胞培养24小时。对于CUT&Tag分析，未损伤的新鲜分离MuSCs被视为静息状态，而损伤后2天（2 dpi）收集的MuSCs被称为激活的MuSCs。

对于KMT5A催化抑制，将新鲜分离的MuSCs接种在0.5% ECM（A14132-02；Gibco）上进行，使用生长培养基（DMEM-F12，20% FBS，2% TCM定义血清替代物（2010026；MP Biomedicals），1%青霉素/链霉素，1% HEPES），在37°C、含湿5% CO?条件下培养，同时加入KMT5A催化抑制剂UNC0379（HY-12335；MedChemExpress）（4 μM）或溶剂对照（DMSO）。处理24小时后收集细胞进行免疫印迹和RT-qPCR。

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**方法细节**

**肌肉切片和免疫染色**

取骨骼肌，在30%蔗糖中过夜孵育，用O.C.T.复合组织包埋剂（4583；SAKURA）在液氮冷却的正戊烷中冷冻，切面后于?80°C保存。冻切的肌肉切片厚度为7–10 μm。肌肉切片在10%正常缓冲福尔马林中固定10分钟，用2% NGS/PBS-T（0.2% Triton X-100）在室温下通透30分钟，然后在含10% NGS（005–000–121；Jackson ImmunoResearch）的PBS-T中于室温下封闭30分钟。当使用小鼠一抗时，切片还需在室温下用Mouse-on-Mouse封闭液（R37621；Invitrogen）额外封闭1小时。一抗孵育在5% NGS/PBS-T中进行，4°C过夜。洗涤后，切片在室温下用5% NGS/PBS-T中的二抗孵育1小时。使用DAPI染色标记细胞核。所有切片均用Fluoromount-G（0100-01；SouthernBiotech）封片。每个样本至少分析来自三张切片的三个切片。使用Echo Revolve显微镜通过Echo PRO软件（版本4.2）拍摄切片和细胞图像，并在ImageJ2中（版本1.52、1.53和1.54p）进行图像处理和分析。样本分析以双盲方式进行。

**免疫印迹**

细胞裂解液（50 mM HEPES [pH 7.4]，150 mM NaCl和1% Triton X-100）补充新鲜加入的无EDTA蛋白酶抑制剂（04693132001；Roche）和磷酸酶抑制剂混合液（4906845001；Roche），用一抗在4°C下孵育过夜。

使用KMT5A（06–1304；Milli-pore或2996；Cell Signaling Technology）、H4K20me1（Ab177188；Abcam）、组蛋白H3（Ab1791；Abcam）、RBPJ（sc-271128；Santa Cruz）、GAPDH（AM4300；Invitrogen）一抗。HRP偶联二抗和ECL（1705061；Bio-Rad）用于化学发光检测，而Dylight二抗（35552、35502；Invitrogen）用于LI-COR Odyssey Fc成像仪（LI-COR Biosciences）的红外检测。

**CUT&Tag**

CUT&Tag大致按先前所述方法进行，做了一些小的修改。刀豆蛋白A磁珠（BP531；Bangs Laboratories）通过两次在结合缓冲液[20 mM HEPES（pH 7.5），10 mM KCl，1 mM CaCl?，1 mM MnCl?和0.1%牛血清白蛋白（BSA）]中洗涤来激活，并以每样本10μL结合缓冲液的比例重悬。新鲜分离的MuSCs用1 mL洗涤缓冲液[20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl，0.83 mM亚精胺（S2626；Sigma-Aldrich），0.1% BSA和一个Roche cOmplete蛋白酶抑制剂EDTA-free片（04693132001；Roche）]洗涤，并在1 mL洗涤缓冲液中重悬。每个CUT&Tag反应使用150,000个MuSCs。将激活的磁珠悬液加入细胞中，混合物在室温下旋转翻转20分钟，使磁珠-细胞结合。短暂离心后，将管子放在磁力架上（12321D，Invitrogen），将洗涤缓冲液替换为每样本150 μL抗体缓冲液[洗涤缓冲液加皂苷（0.5 μg/mL）（300410；Sigma-Aldrich）和2 mM EDTA]。向每管加入6 μL兔抗-H4K20me1（ab177188；Abcam）或6 μL兔抗-H4K20me3（ab9053；Abcam）抗体。样本在4°C下在翻转旋转器上过夜孵育。短暂离心后，将管子放在磁力架上，用150 μL皂苷-洗涤缓冲液[含皂苷（0.5 μg/mL）的洗涤缓冲液]替换上清液，其中含有豚鼠抗兔IgG（H + L）二抗（NBP1-72763；Novus Biologicals），稀释比为1:100。在室温下翻转旋转器上孵育1小时后，用皂苷-洗涤缓冲液洗涤细胞3次。pA-Tn5（由UW-Madison Dr. Marjorie Brand赠送）溶液通过将酶在皂苷-300洗涤缓冲液[20 mM HEPES（pH 7.5），300 mM NaCl，0.83 mM亚精胺，皂苷（0.1 μg/mL），0.1% BSA和一个Roche cOmplete蛋白酶抑制剂EDTA-free片]中稀释1:250制备，每样本加入150 μL。CUT&Tag中使用的pA-Tn5预载了MEDS连接子。在室温下翻转旋转器上孵育1小时后，用皂苷-300洗涤缓冲液洗涤细胞3次。快速离心后，用上清液替换为300 μL转座缓冲液[皂苷-300洗涤缓冲液加10 mM MgCl?]，在37°C下旋转孵育1小时进行转座。加入10 μL 0.5 M EDTA停止转座，随后加入3 μL 10% SDS和3 μL蛋白酶K（20 mg/mL：25530015；Invitrogen）。细胞在37°C、热混仪600 rpm条件下过夜孵育。DNA通过酚-氯仿（BP1752I-400；Fisher BioReagents）提取和乙醇沉淀纯化。DNA文库通过带有索引i5和i7引物的PCR扩增；循环数由qPCR确定。使用Qubit 1× dsDNA HS Assay（Q33230，Invitrogen）测定样本浓度。使用Bioanalyzer高灵敏度DNA分析（Agilent）评估文库质量。样本合并后在蒙特利尔临床研究所（IRCM），加拿大蒙特利尔，使用Illumina NovaSeq平台进行双端测序，每样本1000万条reads。

初步序列质量控制和接头去除使用Trim Galore（v0.6.10-1）完成。高质量剪切后的reads使用Bowtie2（v2.5.4）比对到小鼠参考基因组（mm10）。所得SAM文件使用Samtools（v1.22.1）转换为BAM格式并按坐标排序。重复reads使用Picard（v3.4.0）MarkDuplicates识别并去除。与ENCODE DAC黑名单区域（ENCFF547MET）重叠的reads使用bedtools（v2.31.1）排除。仅保留高质量（MAPQ ≥30）和正确配对（flag -f 2）的比对结果。比对到线粒体基因组（chrM）的reads被丢弃。为在基因组综合浏览器（IGV）中可视化，使用deepTools（v3.5.6）bamCoverage以20bp的bin大小生成RPKM归一化的bigWig文件。跨注释基因体的富集使用deepTools computeMatrix在scale-regions模式下计算，然后使用plotHeatmap进行可视化。

**RNA提取和qPCR**

按制造商的方案使用TRIzol试剂（15596026；Invitrogen）提取RNA。RNA经归一化后用于RT-PCR，随后使用EvaGreen（1725202；Bio-Rad）和7500 Fast实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）进行qPCR。转录本水平归一化至至少两个内参基因（TBP、GAPDH和B2M）的平均值，然后归一化至对照条件（ddCT），并报告为ddCT的fold change。

**CUT&RUN qPCR**

收集细胞并使用CUTANA CUT&RUN试剂盒（14–1048；EpiCypher）进行CUT&RUN。简言之，细胞在4°C下与蛋白A-MNase和一抗过夜孵育。通过钙离子激活MNase释放目标染色质片段，随后进行DNA提取。使用PicoGreen（P7581；Invitrogen）定量DNA浓度。使用针对特定感兴趣基因组区域的引物（表S1）进行qPCR，以评估染色质标记的富集。fold富集值相对于IgG对照计算。

**Bulk和单细胞RNA seq分析**

公共scRNA-seq数据从GEO获取：GSE138826。使用Seurat（v5.4.0）R包进行分析。在归一化和降维后，识别Pax7+ MuSCs并进行亚聚类。为可视化Notch信号基因在成人肌生成中的表达，计算Notch通路基因在再生时间过程（从非损伤到21dpi）中的细胞状态平均表达值。使用ComplexHeatmap包生成热图，显示Z分数归一化的表达值，按相对于静息状态（非损伤状态）在2dpi时的表达差异排序。

此前从WT和Kmt5aKO MuSCs生成的bulk RNA-seq数据从GEO获取：GSE228013重新分析。差异表达值来源于先前描述的已发表数据集。

**定量和统计分析**

所有免疫荧光图像的采集和定量均以双盲方式进行：切片在成像前进行编码，仅在所有定量完成后才解码。

细胞计数在每只动物来自三张独立切片、至少三个独立组织切面中完成，且所有定量分析均包含至少三个独立生物学重复，除非另有说明。对于CUT&Tag实验，生物学重复由来自不同小鼠队列的独立分离的MuSC群体组成。静息态MuSC的CUT&Tag实验在每个抗体条件下每个重复使用一只小鼠（n = 3个独立重复）。激活态MuSC的CUT&Tag实验以三份重复在三个独立实验中完成，每个实验将3至4只独立受伤小鼠的MuSC在每个抗体条件下进行合并，这反映了激活态制备物中细胞产量显著较低的事实（每只受伤肌肉约50,000个细胞）。所有CUT&Tag实验均包含IgG同型对照（13–0042；EpiCypher），与阳性对照H3K4me3（Ab8580；Abcam）或H3K27me3（9733S；Cell Signaling Technology）并行处理。无偏见的峰识别及下游基因组分析均未进行事后的位点选择。RNA-seq差异表达分析基于已发表的数据（GEO: GSE228013），采用先前描述的流程进行，Notch通路的富集通过无偏见的通路分析在本研究所呈现的目标验证之前识别。统计分析使用GraphPad Prism或R进行。数据以均值 ± 标准差表示，除非另有说明。两组间比较采用双尾Welch's t检验。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）并结合Tukey多重比较校正，视情况而定。所有统计检验均在分析前选定，全文报告了精确的p值。未从任何分析中排除数据点。每项实验的统计细节，包括所使用的统计检验方法，均在对相应的图注和结果部分中予以说明。补充信息（1）PDF（600.45 KB）文档S1：图S1和表S1