慢性基孔肯雅热与抗 CHIKV 抗体滴度、中和能力及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用降低相关

《iScience》：Chronic chikungunya is associated with decreased anti-CHIKV antibody titers, neutralizing capacity, and antibody-dependent cellular cytotoxicity

　　

要点•慢性基孔肯雅热病例在感染后6个月表现出较低的抗CHIKV IgG和中和抗体（nAb）滴度•慢性基孔肯雅热与FcγRIIIa介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）能力降低有关•抗体依赖性吞噬作用或补体激活与疾病转归无关•性别而非年龄可能影响抗CHIKV抗体滴度和IgG效应功能摘要基孔肯雅病毒（CHIKV）感染可导致以持续关节痛为特征的慢性疾病。虽然对CHIKV的体液免疫应答已有充分表征，但Fc介导的效应功能在疾病发病机制中的作用仍不清楚。我们评估了自行缓解或慢性基孔肯雅热患者中CHIKV特异性抗体的定量和定性特征，包括IgG/IgM滴度以及抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）、抗体依赖性补体沉积（ADCD）、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性NK细胞激活（ADNKA）等效应功能。抗CHIKV IgG和IgM滴度在感染后3至6个月间下降，6个月时较低的滴度与慢性疾病的发病有关。慢性组与自行缓解组的ADCP和ADCD能力相似。慢性病患者表现出ADCC降低，但ADNKA未见降低。女性表现出较高的抗CHIKV E2抗体浓度和ADCP能力。本研究全面概述了具有不同疾病转归的基孔肯雅热患者中Fc介导的效应功能。图摘要引言基孔肯雅病毒（CHIKV）由伊蚊传播，是一种公共卫生关注的虫媒病毒。CHIKV是一种单股正链RNA病毒，有四个不同的谱系：东-中-南非（ECSA）谱系、西非谱系、ECSA-分化印度洋谱系和亚洲谱系。CHIKV的分布以前仅限于非洲和亚洲；然而，近年来在大多数赤道附近地区以及世界更温和的地区，包括法国南部大都市区和意大利北部，也有爆发记录。一般而言，近年来虫媒病毒的快速传播归因于全球化和气候变化，这使得传播媒介和病毒得以在亚热带和温带地区分布，以及病毒突变的发生。CHIKV感染通常被认为是双相性的。在第一阶段（急性期），感染者在蚊虫叮咬后2至6天发病，出现高热、关节痛和头痛。病毒系统性感染广泛的细胞类型，对肌肉相关卫星细胞和滑膜成纤维细胞表现出明显的嗜性。患者在大小关节出现急性致残的肌肉骨骼和关节炎样疼痛，该症状可自行缓解，数周内症状消失。然而，在40%–60%的病例中，关节疼痛可持续数月甚至数年，疾病发展为慢性关节炎（慢性基孔肯雅热），类似于类风湿关节炎。CHIKV感染后慢性疾病的潜在机制驱动因素尚未确定；然而，有推测认为病毒持续感染、自身免疫性疾病诱发和/或原有关节疾病加重可能是导致疼痛和肿胀持续的可能原因。对CHIKV的体液免疫应答已有充分表征。CHIKV特异性IgG和IgM抗体在CHIKV感染急性期末期产生。一般而言，抗CHIKV IgM抗体在感染后最长可检测到3个月，并可能具有中和活性。然而，一些研究表明抗CHIKV IgM可能在感染后持续24–35个月。异常持续存在的抗CHIKV IgM抗体（感染清除后长达3年）在某些研究中与进行性关节炎和骨侵蚀增加相关，而其他研究则未报告此类相关性。抗CHIKV IgG抗体在发热后第5–10天出现，可能在宿主整个生命期间持续存在。这些抗体通常靶向CHIKV包膜（E）、E1或E2糖蛋白内的保守表位，通过抑制病毒附着和进入、融合或释放而表现出中和活性。从康复患者中分离的中和抗体已显示出对多种CHIKV谱系的广泛中和活性，因为它们通常针对E2的保守结构域（B结构域）。除中和作用外，抗体还可通过Fc介导的功能特性提供抗感染保护。来自多种感染性疾病病原体（包括流感、HIV、SARS-CoV-2、RSV和DENV）的新兴证据表明，这些非中和抗体在感染期间发挥保护作用。这种保护主要通过IgG的Fc结构域与白细胞上表达的Fcγ受体（FcγR）相互作用，从而激活单核细胞、巨噬细胞和NK细胞等效应白细胞来实现。抗体Fc介导的效应机制包括抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）、抗体依赖性补体沉积（ADCD）、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性NK细胞激活（ADNKA）以及通过调节树突状细胞功能调控T细胞免疫。这些机制可促进病毒感染细胞的清除，从而帮助控制病毒感染并可能降低疾病严重程度。尽管在表征抗CHIKV IgG应答方面已取得重大进展，但此前的研究主要集中于诱导抗体反应的滴度、中和效力和抗原特异性。最近一些研究在感染CHIKV的小鼠中检测抗CHIKV单克隆抗体的治疗效果，结果表明单克隆抗体的最佳治疗活性需要Fc介导的效应功能，即ADCP和ADCD。另一方面，在注射抗II型胶原蛋白或葡萄糖-6-磷酸异构体血清抗体的小鼠中可诱导类类风湿关节炎疾病，其中免疫复合物通过FcγR结合触发补体激活和炎症，这提示Fc介导的效应功能可能参与慢性基孔肯雅热的发病。尽管在表征抗CHIKV体液免疫应答方面已取得显著进展，特别是在中和抗体产生的背景下，但仍有几个悬而未决的研究问题，反映出我们对抗CHIKV IgG抗体提供保护或可能增加发病机制导致慢性关节炎的机制理解有限。因此，我们旨在调查在柬埔寨患者队列中，因CHIKV感染诱导的IgG Fc效应功能差异是否能解释自行缓解基孔肯雅热患者与发展为慢性疾病的患者之间观察到的不同疾病表型。结果慢性基孔肯雅热患者中抗CHIKV IgG滴度随时间下降为深入了解队列中对CHIKV的抗体应答，我们在RT-qPCR确认CHIKV感染后的3个月和6个月使用商业ELISA试剂盒评估了CHIKV特异性血清IgG和IgM（表1）。如STAR方法部分所述，商业ELISA试剂盒定性检测抗CHIKV E1和E2蛋白的IgM，经修改以表示IgM滴度（以ELISA任意单位计）。所有患者在3个月时CHIKV IgM均为血清阳性，其抗体滴度在6个月时显著下降（p = 0.001）（图1A）。使用商业定性ELISA试剂盒检测抗CHIKV IgG时也观察到类似趋势（图1B）。此外，使用CHIKV E2蛋白优化了内部ELISA方法。所有检测样本CHIKV E2 IgG均为阳性，CHIKV感染后3至6个月间IgG滴度显著下降（p = 0.004）（图1C）。为确定体液免疫应答的功能性，通过焦点减少中和试验（FRNT）测定了抗CHIKV中和抗体滴度。在我们的队列中，中和抗体滴度从感染后3个月到6个月呈上升趋势（p = 0.013）（图1D）。图1 感染后3个月和6个月慢性与非慢性基孔肯雅热患者中抗基孔肯雅热抗体滴度评估（A–D）CHIKV感染病例的血浆样本在感染后3个月和6个月分析抗CHIKV IgM、抗CHIKV IgG滴度、抗CHIKV E2特异性抗体和抗CHIKV中和抗体。（E–H）6个月时慢性与非慢性患者之间抗CHIKV IgM、抗CHIKV IgG滴度、抗CHIKV E2特异性抗体和抗CHIKV中和抗体的比较。误差棒代表中位数±四分位距。使用非配对Wilcoxon符号秩检验和Mann-Whitney检验分别进行配对（A–D）和非配对（E–H）组分析。（A–D：n = 16；E和F：否，n = 22；是，n = 16。）个人数量38非慢性（n = 22）慢性（n = 16）慢性（否/是）22/16——男性20118女性18118年龄（均值±SD）26.4 ± 11.9 26.5 ± 13.5 26.2 ± 9.8年龄（范围）10–55 10–55 11–38年龄<18岁12 8 4年龄>18岁26 14 12表1 纳入队列中非慢性型和慢性型疾病的CHIKV阳性个体的人口统计数据接下来，我们旨在确定抗CHIKV IgM和IgG滴度是否与患者中慢性基孔肯雅热的存在相关。在此，我们观察到感染后6个月，慢性型与非慢性型患者之间的抗CHIKV IgM抗体滴度相似（图1E）。有趣的是，表现为慢性基孔肯雅热的患者与非自行缓解型患者相比，抗CHIKV IgG滴度和中和抗体滴度显著降低（p = 0.007，r = ?0.511，95%置信区间[CI]：[?0.796, ?0.170]；p = 0.008，r = ?0.511，95% CI：[?0.812, ?0.165]）（图1F和1H）。同样，与非慢性型患者相比，慢性型患者中针对CHIKV E2蛋白的IgG滴度也较低，尽管差异不具有统计学显著性（p = 0.059，r = ?0.364，95% CI：[?0.716, 0.028]）（图1G）。总之，我们证明从感染后3个月到6个月，抗CHIKV IgM和IgG抗体滴度随时间下降，而同期中和抗体滴度呈上升趋势。此外，6个月时较高的抗CHIKV E2 IgG和中和抗体滴度与自行缓解的基孔肯雅热有关。抗体介导的效应功能除中和作用外，抗体还可通过Fc介导的功能特性提供抗感染保护。抗体应答的定性特征，如抗体亲合力、亲和力、表位特异性和Ig亚型、糖基化模式等，均影响抗体效应功能。此外，抗体浓度也会影响效应功能检测的结果。因此，为了独立于抗体浓度评估CHIKV患者血浆中产生的抗CHIKV抗体质量，我们确定了最佳抗体浓度，并将每位患者样本的浓度独立归一化用于各种Fc介导的抗体效应功能。接下来，我们评估了从CHIKV患者队列中获得血浆样本的效应功能（经抗体浓度归一化和未归一化），并比较了不同感染后时间、疾病状态、患者年龄和性别下的这些效应功能。ADCP在慢性病型和非慢性病型个体中不随时间变化首先，我们测量了ADCP，其可定义为抗原特异性抗体通过Fcγ受体（主要是FcγRII）介导吞噬细胞与调理化病原体结合，从而吞噬和消灭病原体的能力。在此，我们测量了患者血浆中衍生的抗CHIKV抗体介导THP-1细胞吞噬荧光标记CHIKV E2蛋白微珠的能力（图2A）。基于感染后时间或疾病慢性状态，未观察到CHIKV感染患者血浆的吞噬能力存在差异（图S1A）。为独立于抗体浓度评估血浆样本中调理抗体的质量，选择了500任意ELISA单位的最佳抗体浓度用于检测，并将所有血浆样本归一化至该浓度（图S2A和S2B）。经抗体浓度校正后，未观察到患者血浆样本的吞噬评分在感染后随时间存在差异（图2B）。此外，患者血浆样本的吞噬评分与慢性基孔肯雅热无关（图2C）。图2 感染后3个月和6个月慢性与非慢性基孔肯雅热患者中ADCP和ADCD评估（A–D）使用经抗CHIKV IgG滴度校正（500 IgG ELISA单位）的血浆的ADCP和ADCD检测示意图（A和D）。配对患者样本（n = 16）在感染后3个月和6个月进行的ADCP和ADCD检测（B和C）。（E和F）感染后6个月有（n = 16）或无（n = 22）慢性基孔肯雅热患者的ADCP和ADCD测量值。误差棒代表中位数±四分位距。

配对和非配对组分析分别采用Wilcoxon符号秩检验和Mann-Whitney检验进行。

感染后抗基孔肯雅病毒（CHIKV）抗体的ADCD（抗体依赖性补体介导的细胞溶解）能力随时间推移而增强，并且与清除CHIKV感染细胞相关

抗CHIKV抗体可招募补体途径的效应分子，从而通过补体膜攻击复合物清除病毒感染细胞。在此，我们将CHIKV感染的Vero-CCL细胞与患者血浆样本共孵育，随后与健康供者的血清（作为补体效应分子的来源）共孵育（图2D）。补体介导的活性通过评估补体分子C3b的沉积和细胞死亡来测量。感染后6个月采集的血浆样本表现出显著更强的招募补体分子C3b的能力，尽管慢性基孔肯雅热患者与非慢性患者之间并无差异（图S1B）。按照ADCP检测实验所用的方法，所有血浆样本均调整为500个ELISA任意单位浓度（图S3A和S3B）。即使在校正抗CHIKV E2 IgG抗体滴度后，与感染后3个月时间点相比，感染后6个月时CHIKV抗体介导C3b分子沉积的能力有所改善（图2E）。C3b阳性表达细胞的比例与死亡细胞的比例呈正相关，证实沉积在抗体结合的感染细胞上的C3b分子可能是导致其死亡的原因（图S4）。慢性患者与非慢性患者之间C3b表达细胞比例无差异（图2F）。综上所述，抗CHIKV抗体的ADCD能力随时间推移而增强，且与抗CHIKV E2 IgG抗体滴度无关。

慢性基孔肯雅热患者的ADCC活性较低

抗CHIKV抗体通过与IgG Fc与FcγRIIIa的结合，与NK细胞相互作用。这会激活NK细胞中的细胞细胞毒性通路，即ADNKA（抗体依赖性NK细胞活化），从而导致感染细胞被ADCC（抗体依赖性细胞毒性）杀伤和清除。抗体介导ADNKA和ADCC活性的能力取决于其亚型、对靶抗原的亲和力以及结合FcγRs的能力、Fc糖基化模式和滴度。在此，我们使用了一种商业化的ADCC检测试剂盒（ADCC Reporter Bioassay, V variant），该试剂盒利用表达高亲和力FcγRIIIa变异体（V158）的工程化效应细胞（图3A）。ADCC检测的对照包括：未经血浆孵育的ADCC效应细胞、CHIKV阴性供者的血浆，以及阳性对照利妥昔单抗（试剂盒提供）（图S5A）。使用未校正抗CHIKV抗体浓度的患者血浆样本，我们观察到感染后3个月和6个月时ADCC效应细胞活性相似（图3B）。慢性基孔肯雅热患者Fc受体FcγRIIIa的结合水平低于自限性疾病患者（p = 0.012, r = ?0.477, 95% CI: [?0.773, ?0.136]），表明其介导ADCC活性的能力降低（图3C）。

图3 感染后3个月和6个月慢性及非慢性基孔肯雅热患者ADCC的评估
（A）使用未校正抗CHIKV滴度的血浆进行ADCC检测的原理示意图（血浆稀释1:10）。
（B）感染后3个月和6个月配对患者样本（n = 16）的ADCC检测结果读数。
（C）感染后6个月慢性基孔肯雅热患者（n = 16）与非慢性患者（n = 22）的ADCC检测结果。误差线代表中位数±四分位距。配对和非配对组分析分别采用Wilcoxon符号秩检验和Mann-Whitney检验进行。

NK细胞表达的FcγRIIIa与感染细胞上结合的IgG Fc发生结合，从而导致NK细胞活化。这种活化表现为效应细胞毒性颗粒的脱颗粒以及NK细胞产生IFNγ。因此，我们通过体外实验评估了CHIKV患者血浆中抗体介导NK细胞活化（ADNKA）的能力。通过检测CD107a（NK细胞脱颗粒的替代标志分子）和IFNγ来测量NK细胞活性（图4A）。ADNKA检测的对照包括用CHIKV阴性供者和基孔肯雅热患者血浆孵育的未感染和CHIKV感染的Vero-CCL细胞（图S5B和S5C）。在未校正抗CHIKV浓度的血浆样本中，CD107a表达和IFNγ产生均在感染后3个月至6个月之间下降（图4B和4C）。慢性型与非慢性型患者之间在CD107a表达或IFNγ产生方面均未观察到差异（图4D和4E）。

图4 感染后3个月和6个月慢性及非慢性基孔肯雅热患者ADNKA的评估
（A）使用未校正抗CHIKV滴度的血浆进行ADNKA检测的原理示意图（血浆稀释1:10）。
（B和C）感染后3个月和6个月配对患者样本（n = 16）中表达CD107a和IFNγ的NK细胞百分比。
（D和E）感染后6个月慢性基孔肯雅热患者（n = 16）与非慢性患者（n = 22）中表达CD107a和IFNγ的NK细胞百分比。配对和非配对组分析分别采用Wilcoxon符号秩检验和Mann-Whitney检验进行。

CHIKV患者中的抗体滴度与效应功能：与年龄和性别的关联

先前的流行病学数据显示，CHIKV感染可能更容易影响成年人，尤其是女性。因此，为了阐明Fc介导的抗体效应功能是否有助于解释这些差异，我们根据年龄和性别对患者的这些功能进行了比较。我们观察到女性患者的抗CHIKV IgG抗体滴度显著更高（p = 0.007），抗CHIKV中和抗体也呈现类似的趋势（图5A–5D）。在未校正各自效应功能检测中抗体浓度的血浆样本比较中，男女之间在吞噬能力、补体沉积以及ADCC和ADNKA效应活性方面均未观察到差异（图5F和5H–5K）。然而，对特定效应功能检测的抗体浓度进行标准化后，发现女性患者的吞噬能力显著高于男性患者（p = 0.008）（图5E）。但是，两性之间在启动ADCD的能力方面无差异（图5G）。

图5 按性别分层的基孔肯雅热患者中抗CHIKV抗体滴度和Fc介导的效应功能
（A–K）按性别分层（男性n = 20，女性n = 18）的血浆样本，检测抗CHIKV IgM滴度、抗CHIKV IgG滴度（定性ELISA）、抗CHIKV E2定量ELISA、抗CHIKV中和抗体的焦点减少中和试验（FRNT），以及效应功能检测，即ADCP、ADCD、ADCC和ADNKA。（E）和（G）使用校正抗CHIKV IgG滴度（500个IgG ELISA单位）的血浆进行。（F）、（H）、（I）、（J）和（K）使用未校正抗CHIKV IgG滴度的固定稀释血浆进行。误差线代表中位数±四分位距。非配对组分析采用Mann-Whitney检验进行。

成年（>18岁）和青少年（≤18岁）基孔肯雅热患者之间的总抗CHIKV IgG和IgM滴度以及中和抗体均相似（图S6A–S6D）。在未校正各自效应功能检测中抗体浓度的血浆样本比较中，成年人与儿童之间在吞噬能力、补体沉积或ADCC效应活性方面均未观察到差异（图S6F和S6H–S6K）。此外，对抗体浓度进行校正后，不同年龄组之间的ADCP和ADCD效应检测结果也未出现显著差异（图S6E和S6G）。

综上所述，抗CHIKV抗体的数量及其效应功能与患者的年龄无关。此外，女性患者表现出更高的抗CHIKV E2蛋白特异性抗体滴度和更强的ADCP介导能力。

抗CHIKV抗体滴度、抗体介导的效应功能与人口统计学因素之间的相关性

根据其中和能力，CHIKV特异性抗体可分为中和性抗体和非中和性抗体。中和性抗体可以抑制病毒入侵并诱导抗体介导的效应功能，而非中和性抗体仅能通过Fc介导的机制来控制感染。由于CHIKV特异性抗体在功能上的这种重叠，我们旨在通过Spearman相关性分析阐明抗CHIKV IgG和IgM滴度、中和抗体、患者年龄以及抗体介导的效应功能检测之间的关系（图6）。抗CHIKV中和抗体的滴度与结合E2-E1复合物（r = 0.421, p < 0.01）和E2蛋白（r = 0.486, p < 0.01）的抗CHIKV IgG抗体浓度呈中度相关，而各效应功能之间以及与抗CHIKV抗体滴度之间均未观察到相关性。

图6 抗CHIKV体液免疫应答的相关性
（A）Spearman相关性矩阵，显示感染后6个月测定的抗CHIKV抗体滴度和抗体介导的效应功能（使用未校正抗CHIKV滴度的血浆；血浆稀释1:10）。相关系数（r值）由颜色标度表示。红色和蓝色圆点分别代表两个变量之间的负Spearman相关系数和正相关系数。圆点的大小代表相关系数的幅度。统计分析采用Spearman相关检验（*p < 0.05, **p < 0.01）。

综上所述，在我们柬埔寨患者队列中，感染后3个月至6个月间抗CHIKV IgG和IgM滴度均有所下降。在6个月时间点，观察到的较高抗E2 IgG滴度、中和抗体滴度以及增强的抗CHIKV抗体FcγRIIIa结合与自限性基孔肯雅热相关。

讨论

CHIKV感染可诱导产生持久的IgG，从而保护宿主免受多种CHIKV谱系的再感染。这些抗体在病毒清除中起着关键作用，已有报道指出中和抗体滴度较高与早期恢复期患者较低病毒血症相关。目前，几种CHIKV疫苗候选物正在进行临床开发，其中一种减毒活疫苗（IXCHIQ）和一种病毒样颗粒疫苗（VIMKUNYA）最近获得了美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于成人。这两种疫苗在临床试验中均表现出高免疫原性，实现了完全血清阳转并产生了CHIKV中和抗体。虽然CHIKV感染或疫苗接种后中和抗体的应答在人类中作为再感染保护的重要指标，但近期利用CHIKV单克隆抗体感染小鼠的小鼠模型研究表明，Fc介导的效应功能——即单核细胞和中性粒细胞介导的ADCD和ADCP——有助于清除感染并减轻症状严重程度。然而，Fc介导的功能是否有助于人类预防慢性基孔肯雅热，或是否与关节症状的存在相关，仍有待阐明。因此，我们在柬埔寨患者队列中，对感染CHIKV后3个月和6个月的自限型和慢性型患者进行了全面的功能性抗体应答分析。我们选择了不同的Fc介导效应功能作为代表性示例：ADCD检测抗体与C1q相互作用激活补体途径的潜力；ADCP检测抗体结合FcγRIIa的潜力；ADCC检测评估FcγRIIIa的结合；而ADNKA检测则是用于评估NK细胞活化的生物检测。

虽然抗CHIKV-E2蛋白滴度随时间下降，但中和抗体滴度在感染后3个月至6个月之间有所增加。这一结果表明，这些抗体的中和能力可能由其对病毒颗粒的亲和力和结合能力决定，而非由其浓度决定。E2是中和抗体的主要靶标，大多数分离的单克隆抗体靶向E2。中和抗体滴度的增加可能是由于抗E2应答的进一步亲和力成熟所致。事实上，近期研究表明，人类和动物模型中可观察到长达1年的持续性生发中心应答。

我们发现，感染后6个月慢性型患者的CHIKV特异性IgG和中和抗体滴度显著低于自限性基孔肯雅热患者；然而，这一观察背后的机制仍有待确定。小鼠模型显示，在CHIKV感染期间，由于炎症单核细胞和中性粒细胞的浸润导致淋巴结结构紊乱，病毒特异性B细胞应答可能受到影响。这导致B-T细胞相互作用丧失和生发中心形成受损，最终导致持续性感染的确立。这在人类中是否同样如此仍有待确定。

Anfasa等人在库拉索岛的一个队列中发现，感染后长达12个月内，非慢性型和慢性型患者的中和抗体浓度没有差异；这可能是由于他们研究中感染后采样的时间点不一致所致。相比之下，我们观察到中和滴度随时间显著升高。在感染早期康复期或疫苗接种后观察到的较高浓度的病毒特异性抗体，可能会影响Fc介导的效应功能实验的结果。为控制抗体浓度对抗体介导的效应功能的影响，在ADCD和ADCP实验中，我们均衡了各样本中抗CHIKV E2 IgG的浓度。因此，在这些实验中，仅评估了影响Fc介导的效应功能的抗CHIKV反应质量，如亲和率、亲和力、同种型、Fc糖基化和靶抗原表位。对于ADCC和ADNK实验，我们未对抗CHIKV滴度进行校正，因为我们未观察到ADCC或ADNK活性与抗CHIKV IgG滴度之间存在相关性。然而，我们不能排除患者组间ADCC活性的差异以及随时间变化的ADNK活性并非归因于抗CHIKV IgG滴度变化的可能性。

在评估修正后的抗CHIKV浓度时，感染细胞上的补体沉积百分比随时间增加，尽管自愈型和慢性型基孔肯雅热患者之间没有观察到差异。感染细胞上C3沉积的百分比与细胞死亡相关，表明这是一种清除CHIKV感染细胞的保护性机制。

ADCC报告基因实验测量显示，自愈型疾病的患者FcγRIIIA受体结合减弱，这可能是由于抗CHIKV抗体滴度较低或抗体质量改变所致。这一发现表明，这些介导ADCC的抗体可能具有保护个体避免发展为慢性疾病的作用，通过控制急性感染期的病毒载量并促进肌肉和关节中感染细胞的清除。基孔肯雅热慢性关节痛和肌肉痛的确切机制仍不清楚。有研究提出病毒持续存在可能是导致慢性关节痛的 contributing 因素。在小鼠和非人灵长类动物模型的关节中已观察到病毒RNA和CHIKV非结构蛋白。然而，病毒是否实际上在这些模型或人类关节中持续存在，以及ADCC能力降低是否与病毒持续存在相关，仍有待确定。

然而，这些抗体与效应细胞上FcγRIIIa结合的能力似乎并不直接转化为NK细胞活化，因为慢性型和非慢性型疾病的个体之间CD107a表达和IFNγ产生没有差异。或者，保护作用可能是通过其他表达FcγRIIIa的细胞介导的，如炎症单核细胞或组织驻留巨噬细胞。体外CHIKV感染健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）已被证明在感染急性期驱动单核细胞亚群从经典CD14+单核细胞向炎症性CD16+（FcγRIIIa）单核细胞和NK细胞重新分布。在尼加拉瓜基孔肯雅热儿童队列中，CHIKV感染后CD14+CD16+单核细胞的频率增加。

先前的研究表明，抗CHIKV IgG抗体在年龄增长的人群中趋于增加，这可能是由于反复暴露于病毒所致。柬埔寨仅在2011-2013年和1970年经历过显著的基孔肯雅热疫情，且儿童和成人之间的抗体滴度或Fc介导的效应功能没有观察到差异。女性在CHIKV感染后发展为慢性基孔肯雅热的风险更高，我们观察到与男性相比，女性抗CHIKV E2抗体浓度和吞噬能力显著更高。然而，这与慢性基孔肯雅热的发展如何相关仍有待阐明。

我们的研究对于疫苗开发具有重要的临床意义，因为我们的数据表明，高中和抗体滴度对于预防慢性基孔肯雅热的发展是必要的。因此，疫苗接种后应获得并维持足够高的滴度。应对当前已批准疫苗诱导的中和滴度的持久性和强度进行后续研究。我们观察到感染后6个月慢性型和慢性型个体之间ADCD存在明显差异。因此，已批准的CHIKV疫苗和新型疫苗候选物诱导的抗体可作为未来疫苗研究中额外的保护相关指标，对其Fc介导的效应功能进行评估。

总之，我们的数据深入揭示了慢性型和自愈型基孔肯雅热患者抗CHIKV功能性抗体的发展和维持过程。在柬埔寨患者队列中，我们发现抗CHIKV IgG和IgM滴度在感染后3至6个月之间下降，而中和滴度随时间增加。感染后6个月，较低的抗E2 IgG滴度、中和滴度以及抗CHIKV抗体的FcγRIIIa结合能力降低与疾病的慢性型相关。这些结果对现有和新型疫苗及抗体疗法针对CHIKV的开发具有临床意义。

研究局限性

本研究存在若干局限性。首先，我们未能从所有参与者处获取感染后3个月的血浆样本，因此无法在3个月时间点比较慢性型和自愈型基孔肯雅热患者之间的抗体特征。其次，我们的实验设计未能区分IgM和IgG抗体的作用，因为两者均可参与中和和补体激活。第三，这是一项探索性研究，样本量有限，且在亚组中测试了多个终点，统计效力有限。因此，需要更大队列的后续研究来验证我们最重要的发现。

资源可用性

主要联系人

进一步信息和资源的请求应转至主要联系人Tineke Cantaert（[e-mail]），并由其负责满足。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性

本文报告的所有数据将由主要联系人在请求后共享。本文未报告原创代码。重新分析本文报告数据所需的任何额外信息均可通过主要联系人获取。

致谢

本工作由惠康信托基金（Wellcome Trust grant 311543/Z/24/Z）资助。Cantaert实验室还得到美国国立卫生研究院（NIH：PICREID, 1U01AI151758, R01 AI175134, 和 R01 AI137276）以及Horizon Europe（项目编号101137033）的资助。我们感谢Borita Heng进行样本处理，感谢Emma Yam在实验中的协助。我们感谢柬埔寨国家寄生虫学、昆虫学和疟疾控制中心的Huy Rekol提供的支持。我们还感谢Teyputita Ou提供CHIKV患者分离株。

作者贡献

概念化：V.U.和T.C.；实验分析：V.U.、S. Lay、S.H.和S.K.；形式分析：V.U.和S. Lay；调查研究：V.U.和T.C.；资源：R.L.、T.C.、S.S.和S. Ly；数据整理：V.U.和T.C.；原始草稿撰写：V.U.和T.C.；审阅与编辑：T.C.和S. Lay；可视化：V.U.；指导监督：R.L.、S. Ly、V.D.和T.C.；项目管理：T.C.；经费获取：T.C.

利益声明

作者声明无竞争利益。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
抗体 | |
抗人IgG（γ链特异性）过氧化物酶抗体 | Sigma Aldrich | A8419-2 mL; RRID:AB_258388
抗CHIKV小鼠高免腹水 | 柬埔寨巴斯德研究所 | N/A
标记辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体 | BioRad | N/A
标记APC的抗C3/C3b/iC3b抗体（克隆7C12） | Cedarlane | CL7631APC; RRID:AB_11188343
抗人CD107a APC | Biolegend | 332655; RRID:AB_1279055
抗人CD56 BV421 | Biolegend | 362552; RRID:AB_2566061
抗人CD69 PE-Cy7 | Biolegend | 310912; RRID:AB_314847
抗人CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 317336; RRID:AB_2561628
抗人IFNγ PE | Biolegend | 506507; RRID:AB_315440
细菌和病毒株 | |
基孔肯雅病毒，ECSA基因型 | 柬埔寨患者 | EPI_ISL_20268291
生物样本 | |
人血浆样本（CHIKV感染患者） | 柬埔寨巴斯德研究所 | N/A
人PBMCs（健康供体） | 柬埔寨巴斯德研究所 | N/A
混合人血清（CHIKV血清阴性供体） | 柬埔寨巴斯德研究所 | N/A
化学品、肽和重组蛋白 | |
重组CHIKV E2蛋白 | Sino Biologicals | 40440-V08B
TrueBlue过氧化物酶底物 | KPL | 5510-0030
莫能菌素 | BioLegend | 420701
胰蛋白酶（2×） | Thermo Fisher | 15090046
关键商业实验 | |
CHIKjj Detect? IgG ELISA试剂盒 | InBios | CHKG-C
CHIKjj Detect? IgM ELISA试剂盒 | InBios | CHKM-R
ADCC报告基因生物实验，V等位基因 | Promega | G7010
NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-657
Zombie Aqua?固定 viability 试剂盒 | Biolegend | 423102
True-Nuclear?转录因子缓冲液套装 | Biolegend | 424401
EZ-Link马来酰亚胺-PEO固相生物素化试剂盒 | Thermo Fisher | 1057-0614
FluoSpheres? NeutrAvidin?标记微球 | Invitrogen | #F8776
Bio-Glo?荧光素酶实验试剂 | Promega | G7941
细胞系 | |
THP-1单核细胞 | ATCC | TIB-202
Vero细胞 | ATCC | CCL-81
白纹伊蚊C6/36细胞 | ATCC | CRL-1660
软件和算法 | |
GraphPad Prism v10.3.1 | GraphPad Prism | https://www.graphpad.com
FlowJo v9.0 | FlowJo LLC | https://www.flowjo.com

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实验模型和受试者详情

研究设计

参与者入组由柬埔寨巴斯德研究所（IPC）启动，响应2020年柬埔寨CHIKV疫情。研究获得了柬埔寨国家卫生研究伦理委员会的批准（NECHR #2020-312）。在纳入研究前，从所有参与者或其父母/法定监护人处获得书面知情同意。RT-qPCR检测CHIKV阳性的个体被纳入研究。在感染后3个月和6个月采集血液样本。从这些血液样本中收集血浆，在IPC生物库中-80°C保存。在6个月时间点，由研究护士对参与者进行临床检查，以确定是否存在持续性关节痛症状（关节肿胀、疼痛或发红）。如果至少1个关节表现出持续性症状，该个体被归类为慢性基孔肯雅热病例，而无关节症状的患者被归类为非慢性型。为研究针对CHIKV的抗体效应功能，从2020-21年基孔肯雅热疫情中招募的CHIKV RT-qPCR阳性较大队列中选择了38名个体，这些个体在6个月临床访视时已有慢性化分类结果。研究中的参与者在各组间按性别进行匹配。患者的年龄选择基于与完整队列的年龄分布相匹配。在这38名个体中，16名患者还在感染后3个月采集了样本。患者人口学特征总结在表1中。

方法细节

CHIKV IgG ELISA

使用商业CHIKjj Detect IgG ELISA试剂盒（InBios, USA）按照制造商说明检测针对CHIKV E1/E2蛋白的IgG抗体。板在450 nm处读数，记录OD值。

我们设计了一种内部ELISA用于定量抗CHIKV E2 IgG抗体。简要而言，无菌ELISA板（Nunc）用1 μg/mL重组CHIKV E2蛋白（Sino Biologicals）过夜包被。用5% BSA阻断1小时。洗涤后，将稀释1:100或1:1600的血浆样本加入孔中，37°C孵育1小时。再次洗涤板，加入抗人IgG（γ链特异性）过氧化物酶抗体（A8419-2 mL; Sigma-Aldrich）（稀释1:1000）。然后加入100 μL TMB底物反应10-15分钟，用1M H2SO4终止反应，在450 nm处读数。选择一种在商业CHIKjj Detect IgG ELISA试剂盒中OD值高的患者血浆样本来设置标准曲线。最低和最高标准稀释度分别被赋予任意的ELISA单位1000和10。通过标准曲线外推确定患者样本中抗CHIKV E2 IgG的浓度。

CHIKV IgM ELISA

使用商业CHIKjj Detect IgM ELISA试剂盒（InBios）按照制造商说明检测针对CHIKV E1/E2蛋白的IgM抗体。样本板在450 nm处读数，记录OD值。使用试剂盒提供的阳性对照，通过2倍系列稀释（1:100至1:6400）制备标准曲线。最低和最高标准稀释度分别被赋予任意的ELISA单位1000和10。通过标准曲线外推确定患者样本中抗CHIKV IgM的浓度。

细胞和病毒

THP-1单核细胞（ATCC TIB-202）在RPMI 1640培养基（#R0883-500 ML; Sigma-Aldrich）中培养，补充10%热灭活血清（FBS）（Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（#25030-024; Invitrogen）和100 U/mL青霉素-链霉素（#15140-122, Thermo Fisher）。Vero细胞（ATCC CCL-81）在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; Gibco）中培养，补充10% FBS和1%青霉素/链霉素。所有细胞系在37°C和5% CO2条件下维持。细胞系未经鉴定验证。实验执行前通过PCR检测细胞是否存在支原体污染。

基孔肯雅病毒，属于ECSA基因型，从柬埔寨患者中分离获得（登录号：EPI_ISL_20268291）。简要而言，白纹伊蚊C6/36细胞（ATCC CRL-1660）以MOI 0.1感染CHIKV，28°C感染1小时。感染后2天收集上清液。病毒浓缩采用PEG沉淀法，沉淀物用FBS重悬，-80°C保存至进一步使用。制备的病毒储存液中的感染性病毒滴度使用焦点形成法测定。

中和实验

根据先前描述的方案，通过焦点减少中和试验（FRNT）检测抗CHIKV中和IgG抗体。

简述：将热灭活的患者血浆样本进行系列稀释，并与等量的基孔肯雅病毒（CHIKV）共同孵育。将该混合物覆盖于Vero-CCL细胞上孵育1小时，随后用含有1.6%羧甲基纤维素（Sigma-Aldrich）的DMEM半固体覆盖物替换。15小时后，固定细胞、进行通透化，并分别用多克隆抗CHIKV小鼠高免腹水（IPC，柬埔寨）和标记辣根过氧化酶的抗小鼠IgG抗体（Bio-Rad，法国Marnes La Coquette）各孵育1小时。最后，用TrueBlue过氧化酶底物（KPL，美国马里兰州盖瑟斯堡）对细胞进行染色。中和抗体滴度以引起感染减少90%的血浆稀释度倒数表示，以焦点形式可视化（FRNT90），与对照孔相比。FRNT90使用GraphPad Prism 10.3.1软件进行非线性回归分析计算。

抗体依赖性补体沉积（ADCD）实验：以MOI为1感染CHIKV的Vero-CCL细胞培养24小时。用2倍浓度胰蛋白酶将感染细胞消化脱落，然后与患者血浆样本（稀释1:50或设定为500 IgG ELISA单位浓度）在37°C、5% CO2条件下孵育30分钟。随后，加入50 μL含10% CHIKV血清阴性健康供体（n = 6）混合血清的完全DMEM培养基，在37°C、5% CO2条件下孵育6小时。为将细胞从培养板脱离，细胞经洗涤后，用含2 mM EDTA的1× PBS孵育。细胞用1× PBS洗涤，并用Zombie Aqua固定型活力试剂盒（Biolegend）染色，随后在4°C避光条件下用与APC偶联的抗C3/C3b/iC3b抗体（Cedarlane，克隆7C12）染色30分钟。然后按试剂盒说明用True-Nuclear转录因子缓冲液试剂盒（Biolegend）固定细胞，重悬于FACS缓冲液中，使用BD FACS Canto II（BD Biosciences）进行检测。结果以总细胞（包括活细胞和死细胞）中C3沉积的百分比以及死细胞百分比（Zombie Aqua阳性）报告。

抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）实验：重组CHIKV E2蛋白（40440-V08B；Sino Biological）按照试剂盒说明使用EZ-Link Maleimide-PEO固相生物素化试剂盒（1 μg/mL；1057-0614；Thermo Fisher）进行生物素化。将生物素化E2蛋白与FluoSpheres NeutrAvidin标记微球（#F8776；Invitrogen）以1 μg蛋白对1 μL微球的比例偶联，在4°C避光条件下过夜孵育。将抗原偶联微球重悬于含0.1% BSA的1× PBS中，然后加入各对应孔中。将热灭活的患者血浆（稀释1:40或设定为500 IgG ELISA单位浓度）加入抗原偶联微球中，在室温下孵育15分钟。未加血浆的抗原偶联微球作为阴性对照。孵育后，每孔加入40,000个THP-1细胞（50 μL完全RPMI培养基）。细胞与抗体-微球复合物在37°C孵育2小时。用FACS缓冲液洗涤后，用Zombie Aqua固定型活力试剂盒（Biolegend）染色，再按试剂盒说明用True-Nuclear转录因子缓冲液试剂盒（Biolegend）固定。样品重悬于FACS缓冲液中，使用BD FACS Canto II（BD Biosciences）进行检测。数据使用FlowJo 9.0版本分析。结果以吞噬评分报告，计算方式为微球阳性细胞百分比乘以微球阳性细胞平均荧光强度（MFI）。

抗体依赖性细胞细胞毒（ADCC）实验：使用Promega ADCC Reporter Bioassay，V allele（Promega）进行ADCC效应功能实验。如前所述感染CHIKV的Vero-CCL细胞。实验当天，将25,000个CHIKV感染的Vero-CCL细胞加入分别稀释1:10的血浆样本中，在37°C、5% CO2条件下孵育30分钟。随后加入50,000个ADCC Bioassay效应细胞，使靶细胞：效应细胞比例为1:2。孵育6小时后，向每孔加入75 μL Bio-Glo荧光素酶检测试剂，在室温下孵育15分钟。用具有发光型荧光读取功能的酶标仪读数，荧光以相对光单位（RLU）测量。报告值已减去无抗体对照的荧光值。

抗体依赖性NK细胞激活（ADNKA）实验：如前所述感染CHIKV的Vero CCL细胞。在V型底培养板中每孔加入100,000个感染Vero细胞，与基孔肯雅热感染患者的血浆样本（血浆稀释1:10）在37°C、5% CO2条件下孵育1小时。同时，使用人NK细胞分选试剂盒（Miltenyi Biotec）按照制造商方案从柬埔寨健康供体的PBMCs中分离NK细胞。在另一培养板中每孔加入50,000个NK细胞，用抗人CD107a APC抗体（3 μL/孔）和莫能司林（稀释1:30）在室温下孵育5分钟。然后将NK细胞加入含感染Vero细胞的各对应孔中，使靶细胞：效应细胞比例为2:1，在37°C、5% CO2条件下孵育16小时。孵育后，用Zombie Aqua固定型活力试剂盒（Biolegend）对NK细胞染色以区分活细胞和死细胞，随后用以下抗人抗体进行表面染色：抗CD56 BV421、抗CD69 PE-Cy7和抗CD3 PerCp Cy5.5（均购自Biolegend）。按试剂盒说明用True-Nuclear转录因子缓冲液试剂盒（Biolegend）固定和通透化细胞，并用抗人IFN-γ PE抗体进行胞内染色。样品使用BD FACS Canto II进行检测，数据使用FlowJo 9.0版本分析。

定量和统计分析

统计分析：使用GraphPad Prism 10.3.1软件（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA）进行统计比较。两组比较数据使用D'Agostino & Pearson正态性检验测试正态性。非参数Mann-Whitney U检验用于比较两个非配对组之间的数据，非参数配对Wilcoxon符号秩检验用于比较配对样本数据。所有分析中，p < 0.05被视为有统计学意义。Mann-Whitney U比较的效应量已计算并以95%置信区间表示的等级双列相关系数（r）报告。相关性使用Spearman相关检验评估，其中*p < 0.05，**p < 0.01。

补充信息（1）PDF (519.18 KB)
文件S1。图S1–S6