左卡尼汀减轻糖尿病性精囊纤维化，伴随脂质代谢改善和内质网应激减轻

《iScience》：Levocarnitine attenuates diabetic seminal vesicle fibrosis in association with improved lipid metabolism and reduced ER stress

　　

**亮点**
•糖尿病诱导小鼠精囊纤维化和脂质蓄积
•糖尿病精囊中脂肪酸调控信号受损
•左卡尼汀减轻糖尿病小鼠精囊纤维化
•左卡尼汀减轻内质网应激和细胞凋亡

**摘要**
精囊完整性有助于维持精液组成和精子功能，而2型糖尿病可导致该器官萎缩和纤维化。利用高脂饮食/链脲佐菌素诱导的雄性小鼠模型和高糖暴露的原代小鼠精囊上皮细胞，我们通过组织学、生物化学和脂质组学分析评估了纤维化重塑、脂质代谢、PPARα/PGC-1α信号、内质网应激和细胞凋亡。糖尿病精囊表现出萎缩和纤维化，伴随脂质谱改变、游离脂肪酸蓄积、PPARα/PGC-1α表达降低，以及IRE1相关应激和细胞凋亡增加。左卡尼汀在体内减轻了这些变化，并在体外减少了促纤维化反应。PPARα过表达重现了多种保护效应，而IRE1抑制减少了应激相关损伤，但未恢复PPARα/PGC-1α信号。这些发现确定代谢失调和内质网应激是糖尿病精囊重塑的相关特征，并支持进一步评估左卡尼汀用于糖尿病相关生殖道损伤的治疗。

**图形摘要**

**引言**
2型糖尿病（T2DM）是一种以持续性高血糖、胰岛素抵抗和进行性β细胞功能障碍为特征的慢性代谢紊乱，约占全球糖尿病病例的90%。其在年轻人群中日益增长的患病率已使其并发症成为紧迫的公共卫生问题。除公认的循环系统、肾脏和神经系统后遗症外，T2DM还与男性生殖功能障碍密切相关。近半数的糖尿病男性表现出精液质量下降、勃起功能障碍和生殖器官结构异常。重要的是，这些表现不应被视为单一的和以睾丸为中心表型，因为诸如精囊（SV）等辅助生殖器官也可能发生糖尿病相关的病理重塑。

SV是男性生殖系统的主要附属腺体，通过分泌果糖、前列腺素和其他生物活性成分，在维持精液质量和精子功能方面起着至关重要的作用。尽管其生理重要性显著，但在糖尿病相关生殖损伤的背景下，SV的研究仍远少于睾丸或附睾。先前的研究报告了糖尿病男性的SV萎缩、组织病理学重塑和细胞外基质（ECM）沉积，表明纤维化可能是糖尿病SV损伤的重要病理特征。这些变化通过损害精液分泌和改变其生化成分，导致男性生殖功能障碍。然而，在糖尿病条件下驱动SV纤维化的分子机制仍不清楚。

在参与糖尿病组织重塑的机制中，脂质代谢失调和内质网（ER）应激尤为值得关注。ER是参与蛋白质折叠、脂质生物合成和钙稳态的关键细胞器。在糖尿病条件下，代谢超载、脂毒性和氧化应激可破坏ER稳态，并触发未折叠蛋白反应的持续激活，最终促进细胞凋亡和组织重塑。与此同时，脂质代谢紊乱已被认为是糖尿病器官损伤的关键因素，特别是在代谢需求高的组织中。脂肪酸处理改变可能导致细胞内脂质蓄积，加剧细胞应激反应，并促进纤维化进展。尽管脂质代谢紊乱与ER应激之间的相互作用已在多种糖尿病并发症中有所报道，但这些过程是否导致T2DM中的SV纤维化仍不清楚。

左卡尼汀（LC）是一种天然存在的季铵化合物，对脂肪酸转运和线粒体β-氧化至关重要。除了其经典的代谢作用外，LC还已被报道具有抗氧化、抗炎和细胞保护作用，并能调节包括ER应激在内的代谢应激反应。重要的是，LC还可能影响全身代谢和内分泌状态，包括葡萄糖-脂质代谢、胰岛素敏感性和生殖激素环境。在男性生殖领域，LC已被用作辅助治疗来改善精子质量、缓解生殖道炎症并提高生育力。这些特性使LC成为治疗糖尿病相关生殖道损伤的有吸引力的候选药物。然而，其在糖尿病SV纤维化中的潜在作用尚未得到研究。

因此，在本研究中，我们探讨了与T2DM相关的SV纤维化是否伴随脂质代谢失调和ER应激相关细胞凋亡，以及LC是否减轻这些病理改变。为了解决这个问题，我们在高脂饮食（HFD）/链脲佐菌素诱导的T2DM小鼠模型和高糖（HG）暴露的原代小鼠精囊上皮细胞（SVECs）中进行了机制研究。通过整合组织学、生物化学和脂质组学分析，本研究旨在阐明糖尿病SV纤维化的致病基础，并评估LC在这种研究不足的男性生殖道损伤中的治疗潜力。

**结果**

**LC改善HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠全身代谢参数**
为了研究LC的体内效应，我们使用HFD喂养联合低剂量链脲佐菌素给药建立了T2DM小鼠模型（图1A）。与对照组（CTRL）相比，糖尿病小鼠出现明显的代谢异常，包括体重减轻、空腹血糖（FBG）升高和胰岛素水平中度增加，与以胰岛素抵抗和进行性β细胞功能障碍为特征的T2DM表型一致（图1B）。LC治疗显著改善了这些代谢异常，表现为体重部分恢复、FBG降低和循环胰岛素水平改善。此外，LC治疗增加了睾酮水平并改善了精子质量，支持其对糖尿病相关生殖损害具有有益作用。因此，在解释后续分析中观察到的LC的SV保护效应时，应考虑这些全身代谢和内分泌改善。

**图1 糖尿病小鼠模型建立、LC干预和样本采集**
(A) 动物实验分组示意图。SCD，标准饲料；HFD，高脂饮食；LC，左卡尼汀。
(B) 糖尿病小鼠代谢参数变化。数据以均值±标准差表示。p值<0.05表示具有统计学意义的差异。a：T2DM组 vs. CTRL组；b：T2DM + LC组 vs. T2DM组；c：CTRL+LC组 vs. CTRL组。

**LC减轻糖尿病小鼠精囊萎缩和纤维化重塑**
我们接下来评估LC是否能缓解糖尿病引起的SV结构损伤。与CTRL组相比，糖尿病小鼠SV体积、重量和器官指数显著降低，证实了明显的腺体萎缩（图2A、2B、S1A和S1B）。组织学分析进一步显示糖尿病SV组织腺管数量减少、上皮高度降低和明显的胶原沉积，表明严重的纤维化重塑（图2C）。免疫组化染色显示纤维连接蛋白、I型胶原和III型胶原沉积增加，主要分布在腺周围基质区域，这些发现进一步由纤维化相关蛋白的western blot分析所支持（图2D-2G）。LC治疗显著改善了糖尿病小鼠的SV结构和减少了ECM蓄积。

**图2 LC通过减轻细胞外基质重塑改善小鼠T2DM诱导的SV萎缩和纤维化**
(A) 小鼠SV的代表性图像。
(B) 小鼠SV重量。每组n = 8。
(C) H&E和Masson三色染色的小鼠SV代表性图像。比例尺在H&E图像中代表100 μm，在Masson三色图像中代表50 μm。
(D) 小鼠SV组织切片中纤维连接蛋白、III型胶原和I型胶原的代表性免疫组化图像。比例尺代表50 μm。
(E) 纤维连接蛋白、III型胶原和I型胶原IHC染色强度的定量分析。
(F和G) 糖尿病小鼠SV中细胞外基质蛋白（纤维连接蛋白、I型胶原和III型胶原）的western blot分析。每组n = 3个生物学重复。
(H-J) 糖尿病小鼠SV中纤维化相关因子水平（CTGF、MMP3、TIMP1和TIMP3）的western blot分析。每组n = 3个生物学重复。
(K和L) α-SMA的western blot检测和定量分析。每组n = 3个生物学重复。?p < 0.05，??p < 0.01；ns，不显著。

ECM重塑是支撑组织稳态、损伤修复和对生理变化适应的动态生理过程。这种平衡由一系列促纤维化和抗纤维化因子精确调节。糖尿病小鼠SV组织表现出结缔组织生长因子（CTGF）显著上调，同时基质金属蛋白酶-3（MMP3）显著下调（图2H和2I），表明向促纤维化ECM重塑转变。此外，糖尿病SV组织中促纤维化因子基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP1）的表达增加。相比之下，TIMP家族的另一成员TIMP3在糖尿病条件下表达无显著变化（图2H和2J），提示TIMP家族各个成员在糖尿病相关SV纤维化中具有不同的作用。此外，糖尿病SV组织中α-SMA表达呈增加趋势，提示肌成纤维细胞活化，尽管这种变化未达到统计学显著性（图2K和2L）。值得注意的是，LC治疗改善了这些重塑相关变化。总之，这些结果表明LC减轻糖尿病小鼠的SV萎缩和纤维化重塑，至少部分与ECM稳态改善有关。

**LC部分恢复糖尿病精囊的脂质代谢稳态和PPAR通路**
鉴于LC在脂肪酸代谢中已确立的作用，我们接下来进行脂质组学和分子分析，以表征糖尿病小鼠SV组织中的脂质代谢改变。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示CTRL、T2DM和T2DM + LC组之间存在明显分离，表明各组具有不同的脂质代谢谱（图3A和S2）。定量脂质组学分析进一步显示糖尿病SV组织总脂质含量增加（图3B）。T2DM组中游离脂肪酸（FFAs）也显著升高，而LC治疗减轻了这些变化（图3C），提示脂质蓄积和脂毒性应激的缓解。变量重要性投影（VIP）> 1且原始p < 0.05的脂质被视为探索性可视化的候选差异脂质，而额外满足错误发现率（FDR）< 0.05的脂质被认为是FDR显著差异脂质（表S1）。差异脂质分析确定CTRL和T2DM组之间有345个差异蓄积脂质（DALs），T2DM和T2DM + LC组之间有47个DALs（图3D和3E）。Venn图分析进一步确定18个共同DALs，这些DALs在糖尿病条件下发生改变并被LC治疗逆转（图3F）。这些脂质被认为是LC响应性脂质组学候选物，提示部分纠正糖尿病相关脂质代谢紊乱。

**图3 小鼠SV定量脂质组学数据的分析和验证**
(A) OPLS-DA得分图。横轴代表预测主成分，展示组间差异，纵轴代表正交主成分，反映组内变异。
(B) 总脂质含量变化。每组n = 8-10。
(C) FFAs变化。每组n = 8-10。
(D) CTRL和T2DM组间差异脂质的火山图。
(E) T2DM和T2DM + LC组间差异脂质的火山图。
(F) 差异脂质Venn图。
(G) 差异脂质KEGG富集分析。每个点的颜色对应p值的大小，颜色越红表示富集越显著。点的大小代表富集的差异脂质数量。
(H和I) 糖尿病小鼠SV中能量代谢关键调节因子（PGC-1α、PPARα和PPARγ）的western blot分析。每组n = 3。?p < 0.05，??p < 0.01；ns，不显著。

京都基因与基因组百科全书（KEGG）对逆转脂质子集的富集分析提供了糖尿病和LC治疗可能影响的脂质通路的探索性概述。鉴于逆转脂质种类数量有限，这些发现应谨慎解释为假设生成性的，而非确定的通路证据。KEGG富集分析显示糖尿病相关脂质代谢改变主要与醚脂代谢、甘油磷脂代谢和铁死亡相关通路有关（图3G）。尽管PPAR信号通路不在显著富集的主要通路中，但FFAs的显著蓄积和LC在脂肪酸转运和氧化中的已知作用使我们以假说驱动的方式检查PPAR信号作为代谢轴。PPARα是脂肪酸摄取、转运和过氧化物酶体β-氧化的关键转录调节因子，使其与糖尿病SV中观察到的FFA主导脂质组学表型高度相关。因此，PPARα被优先作为与观察到的脂质紊乱和LC药理学密切相关的候选代谢节点。Western blot分析显示糖尿病SV组织中PPARα表达显著下调，而PPARγ表达无显著差异。同时，PPARα的关键共激活因子PGC-1α的表达在T2DM组中也显著下调。

重要的是，LC处理恢复了PPARα和PGC-1α两者的表达（图3H和3I）。综合这三组脂质组学数据表明，糖尿病SV组织表现出广泛的脂质代谢紊乱，且这些与糖尿病相关的脂质变化中有一部分可被LC处理部分逆转。由于脂质组学分析中未包含CTRL+LC样本，因此这些数据无法确定LC是否会改变非糖尿病SV组织的基础脂质组。然而，蛋白水平分析显示，LC单独处理并未显著改变非糖尿病SV组织中PPARα/PGC-1α相关信号，但它部分恢复了糖尿病状态下这些信号的抑制。

**LC抑制糖尿病精囊中的内质网应激和凋亡**

我们接下来调查内质网应激是否在体内参与了糖尿病SV损伤。内质网应激标志物GRP78和CHOP的表达在糖尿病小鼠SV组织中显著升高（图4A–4D）。为了比较三条经典的未折叠蛋白反应（UPR）分支通路，我们检测了SV组织中p-IRE1α、p-PERK和ATF6的表达水平。p-IRE1α在T2DM组中表现出最显著的升高，且被LC处理所降低，而p-PERK和ATF6未发生显著变化（图4E和4F）。这些发现表明，在糖尿病条件下IRE1α分支通路被优先激活。此外，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示，糖尿病SV组织中的凋亡细胞数量显著增加，这有助于SV纤维化的进展（图4I和4J）。与此一致，Bcl-2/Bax比值下降，表明凋亡相关信号通路被增强激活（图4G和4H）。LC处理显著降低了GRP78、CHOP和p-IRE1α的表达，减少了TUNEL阳性细胞并恢复了Bcl-2/Bax比值。综合以上发现表明，LC通过抑制内质网应激——尤其是IRE1α分支——以及减少SV组织中的凋亡，对糖尿病SV损伤发挥保护作用。

**图4 LC给药改善糖尿病小鼠SV的内质网应激并减轻凋亡**

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(A) 小鼠SV组织切片中GRP78和CHOP的代表性免疫组织化学图像。比例尺代表50 μm。

(B) GRP78和CHOP的IHC染色强度定量分析。每组n = 3。

(C和D) 糖尿病小鼠SV中内质网应激标志物（GRP78和CHOP）的Western blot分析。每组n = 3。

(E和F) 糖尿病小鼠SV中核心内质网应激通路传感器（p-IRE1α、p-PERK和ATF6）的Western blot分析。每组n = 3。

(G和H) 糖尿病小鼠SV中凋亡调控蛋白（Bcl-2和Bax）的Western blot分析。每组n = 3。

(I和J) 小鼠SV中TUNEL染色的代表性图像和定量分析。比例尺代表100 μm。每组n = 3。?p < 0.05，??p < 0.01；ns，无统计学差异。

**高糖诱导SVECs中PPARα/PGC-1α失调、内质网应激及促纤维化重塑**

鉴于SVECs在SV液合成与分泌中的关键作用，以及糖尿病引起的萎缩和纤维化对该功能的直接损害，我们选择SVECs作为体外模型来探索潜在的发病机制。我们首先采用差异贴附法从8周龄C57BL/6小鼠中分离原代SVECs（图5A）。在实验刺激前，通过免疫荧光染色评估细胞身份和纯度。分离的细胞呈现强烈的泛细胞角蛋白阳性（>97%），而波形蛋白阳性细胞极少检出（图5B和S3）。接下来，我们检测高糖（HG）刺激是否促进SVECs中的上皮–间充质转化（EMT）。经不同浓度葡萄糖处理后，对关键EMT标志物进行免疫荧光染色显示，上皮标志物E-cadherin呈剂量依赖性下降，同时间充质标志物N-cadherin同步增加（图5C–5F）。这些发现提示HG诱导SVECs发生EMT样表型变化。与糖尿病小鼠SV中纤维化水平升高及相关通路改变的结果一致，我们评估了HG刺激的SVECs中与细胞外基质（ECM）重塑、PPAR信号和内质网应激相关的关键蛋白表达。如图5G–5N所示，HG处理显著上调了ECM成分胶原I和α-SMA的表达，以及内质网应激标志物GRP78、CHOP和p-IRE1α的表达，同时下调了PPAR通路调控因子PGC-1α和PPARα的表达。同样，在这些蛋白的表达在HG条件下呈现出时间依赖性趋势（图S4A和S4B）。为评估渗透压升高是否参与了HG诱导的SVEC表型，我们设置了甘露醇渗透对照。与正常葡萄糖（NG）相比，甘露醇处理未显著影响胶原I、GRP78或PGC-1α的表达，而HG则显著增加了胶原I和GRP78的表达并降低了PGC-1α的表达（图S5A–S5D）。这些发现提示，HG相关的促纤维化反应、内质网应激激活和PGC-1α抑制并非单纯由渗透压升高所致。综合而言，这些体外发现再现了糖尿病SV组织中的关键病理变化，并支持SVECs对糖尿病引起的SV纤维化的贡献。然而，由于基质成纤维细胞和肌成纤维细胞是纤维化的关键效应细胞，SVEC模型应被理解为反映上皮细胞对促纤维化微环境的贡献，而非完全再现多细胞SV纤维化过程。

**图5 高糖诱导原代SVEC模型的建立**

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(A) 原代SVECs分离流程示意图。SVECs从8周龄C57BL/6小鼠的SV中分离获得。

(B) 原代SVECs的鉴定。通过免疫荧光染色评估泛细胞角蛋白的分布。比例尺代表100 μm。

(C–F) 原代SVECs经不同浓度葡萄糖刺激72 h后E-cadherin和N-cadherin的免疫荧光分析。比例尺代表50 μm。每组n = 3。

(G–L) 原代SVECs经不同浓度葡萄糖刺激后胶原I、α-SMA、PGC-1α、PPARα、GRP78、CHOP和p-IRE1α的表达及定量分析。展示了代表性Western blot结果。每组n = 3。

(M和N) 原代SVECs经不同浓度葡萄糖刺激72 h后p-IRE1α的免疫荧光分析。比例尺代表50 μm。每组n = 3。?p < 0.05，??p < 0.01；ns，无统计学差异。

**LC恢复HG处理的SVECs中PPARα/PGC-1α信号并减轻内质网应激相关的促纤维化反应**

我们接下来调查LC能否通过恢复PPARα/PGC-1α相关代谢信号来保护SVECs免受HG诱导的损伤。SVECs暴露于HG（30 mM）中模拟糖尿病微环境，随后用不同浓度的LC处理。在该剂量反应实验中，LC以浓度依赖的方式减轻了HG诱导的纤维化相关蛋白上调，其中1 mM产生了最一致且最显著的抑制效果（图6A和6B）。因此，选择1 mM LC用于后续体外机制实验。此外，LC恢复了HG诱导的SVECs中PPARα/PGC-1α相关信号的抑制，这与其在糖尿病小鼠SV组织中的作用一致（图6C和6D）。LC还显著抑制了HG触发的内质网应激和凋亡相关变化，表现为GRP78、CHOP和p-IRE1α表达的降低（图6E和6F）。为进一步区分LC的作用与选择性内质网应激抑制的差异，我们用IRE1抑制剂4μ8C处理HG刺激的SVECs。尽管4μ8C有效抑制了内质网应激相关蛋白的表达和凋亡相关变化，但在HG条件下未能恢复受损的PPARα/PGC-1α相关信号（图6E和6F）。这些发现表明，LC的保护作用比单纯选择性抑制内质网应激更为广泛，涉及PPARα/PGC-1α相关信号的恢复以及内质网应激的减轻。

**图6 LC恢复小鼠SVECs中PPARα/PGC-1α相关信号并减轻HG诱导的促纤维化反应**

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(A) 小鼠SVECs经30 mM葡萄糖与1 mM LC或20 μM 4μ8C联合处理3天后E-cadherin和N-cadherin的免疫荧光分析。

(B) 小鼠SVECs中细胞外基质重塑相关蛋白（胶原I、α-SMA、CTGF、MMP3和TIMP1）的Western blot分析。

(C和D) 小鼠SVECs中能量代谢关键调控因子（PGC-1α、PPARα和PPARγ）的Western blot分析。每组n = 3。

(E) 小鼠SVECs中内质网应激和凋亡标志物（GRP78、CHOP、p-IRE1α、Bcl-2和Bax）的Western blot分析。

(F) 小鼠SVECs经30 mM葡萄糖与1 mM LC或20 μM 4μ8C联合处理3天后p-IRE1α的免疫荧光分析。?p < 0.05，??p < 0.01；ns，无统计学差异。

**PPARα过表达恢复PPARα/PGC-1α信号并改善HG处理的SVECs中内质网应激相关的促纤维化变化**

为进一步阐明PPARα相关代谢信号的恢复是否有助于LC的保护作用，我们在SVECs中过表达PPARα，并评估其在HG条件下的效果。为确认PPARα过表达模型的成功建立，在后续功能实验前通过Western blot检测了PPARα蛋白表达。与mock和空载体对照组相比，转染PPARα过表达质粒的SVECs中PPARα蛋白水平显著升高，确认了PPARα的有效过表达（图7A和7B）。在HG条件下，Western blot分析显示PPARα及其共激活因子PGC-1α均显著下调。重要的是，转染PPARα质粒有效逆转了这种HG诱导的抑制（图7C和7D）。PPARα过表达还显著降低了HG诱导的纤维化相关蛋白表达，包括胶原I和α-SMA（图7E和7F），表明促纤维化重塑减轻。PPARα过表达还抑制了HG触发的内质网应激和凋亡相关变化，表现为GRP78、CHOP和p-IRE1α表达的降低以及Bcl-2/Bax比值的升高（图7G–7J）。值得注意的是，PPARα过表达的效果与LC治疗的抑制结果一致，这不仅强化了PPARα在对抗HG诱导的促纤维化反应中的关键作用，还表明PPARα相关代谢信号的恢复是LC保护作用的重要组成部分。值得指出的是，SVECs在HG处理后的活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平显著升高，且可被LC处理所抑制（图7K和7L）。这些发现提示，氧化应激相关的脂质损伤也可能参与HG诱导的SVEC损伤，尽管铁死亡的直接证据仍有待建立。

**图7 PPARα过表达减轻高糖诱导的SVECs促纤维化反应**

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(A和B) 转染PPARα过表达质粒的SVECs中PPARα过表达的代表性Western blot及定量分析。Parental：经历转染过程但未转染任何质粒的细胞；pcDNA3.1：转染空载体质粒的细胞；pcDNA-PPARα：转染PPARα过表达质粒的细胞。每组n = 3。

(C–J) SVECs经高糖（HG；30 mM）刺激72 h后，进行Western blot分析及PGC-1α、PPARα、胶原I、α-SMA、GRP78、CHOP、p-IRE1α、Bcl-2和Bax表达水平的半定量评估。HG：仅暴露于高糖条件的SVECs；HG+pcDNA-PPARα：转染PPARα过表达质粒并随后经HG刺激的SVECs；HG + LC：经HG和LC联合刺激的SVECs。每组n = 3。

(K) ROS检测。绿色荧光强度反映细胞内ROS水平。

(L) LC干预后SVECs中丙二醛（MDA，脂质过氧化产物）的检测。每组n = 8。?p < 0.05，??p < 0.01；ns，无统计学差异。

**讨论**

糖尿病诱导的SV纤维化的机制仍 largely 不明。在本研究中，我们表明T2DM在SV中诱导了显著的结构和分子损伤，其特征包括腺体萎缩、ECM积累和纤维化重塑。通过整合糖尿病小鼠模型和原代SVECs的发现，我们进一步证明这些病理变化伴随脂质代谢稳态紊乱、PPARα/PGC-1α相关信号受损、内质网应激和凋亡。重要的是，LC在体内和体外模型中均减轻了糖尿病SV损伤。综合而言，这些发现提示糖尿病SV纤维化与代谢失调及内质网应激相关凋亡有关，且LC可能通过同时改善脂质代谢稳态和抑制内质网应激反应发挥保护作用。

SV是男性生殖道的重要附属腺体，其分泌产物对精液组成和精子功能至关重要，从而对男性生殖能力有所贡献。与代谢紊乱可破坏男性生殖巢穴内体细胞支持的证据一致，糖尿病SV损伤可能代表一种后睾丸的上皮支持功能受损，即SVECs从维持精液微环境转向脂质失调、内质网应激和促纤维化重塑。尽管糖尿病对男性生殖健康的有害影响日益受到关注，但SV所受到的关注远不及睾丸或附睾。

先前的临床研究已确认糖尿病患者中存在精囊（SV）萎缩。本研究显示，糖尿病小鼠的精囊组织表现出明确的纤维化组织病理学证据，包括胶原沉积、细胞外基质（ECM）相关蛋白表达增加以及腺体萎缩。这些结构异常伴随糖尿病小鼠精液质量下降，支持了精囊损伤可能参与糖尿病相关生殖功能障碍的观点。苦参碱（LC）处理显著改善了精囊形态，减轻了纤维化重塑，并部分恢复了精子质量，提示保护精囊结构可能有助于改善糖尿病状态下的生殖微环境。此外，我们的体外数据显示，高糖（HG）环境促进了胶原I型和α-SMA的表达，同时引起原代精囊上皮细胞（SVECs）的上皮-间质转化（EMT）变化，表明上皮细胞本身可能主动参与糖尿病精囊中促纤维化微环境的建立。本研究的一个核心发现是，糖尿病精囊纤维化伴随脂质代谢稳态紊乱。精囊主要由假复层柱状上皮组成，可分泌多种精浆成分，包括果糖、前列腺素和抗氧化剂，从而支持精子功能和精浆微环境。由于其高分泌活性，高效的脂肪酸利用对于维持精囊上皮稳态可能尤为重要。显微证据进一步表明，SVECs含有大量线粒体。这种代谢特征在其他高能量消耗细胞中同样可见，如心肌细胞、骨骼肌细胞和肾细胞。我们的脂质组学数据显示，糖尿病精囊组织中总脂质含量增加，游离脂肪酸（FFAs）显著蓄积，同时脂质谱发生广泛改变。此外，糖尿病精囊组织和HG处理的SVECs中PPARα及其共激活因子PGC-1α的表达均降低，而LC处理可恢复二者表达。这些发现支持糖尿病精囊损伤中存在PPARα/PGC-1α相关代谢信号通路受损。尽管本研究未直接测定脂肪酸氧化（FAO）通量，但观察到的FFA蓄积和PPARα/PGC-1α抑制提示糖尿病精囊纤维化中存在脂肪酸处理障碍。脂肪酸处理障碍可能导致细胞内脂质过度蓄积，并通过促进脂毒性而加剧纤维化进程。有趣的是，在一项肝纤维化研究中，FAO相关酶CPT1A在纤维化患者和动物模型的肝星状细胞中上调，从而促进FAO并加重肝纤维化。这一模式与本研究在精囊组织中观察到的脂质代谢稳态紊乱证据不同，这种差异可能归因于不同细胞类型间的内在代谢异质性。总体而言，这些结果表明FAO在纤维化进展过程中可能经历组织特异性的代谢重编程。本研究的另一重要发现是糖尿病精囊损伤中脂质代谢失调与内质网（ER）应激的密切关联。ER是蛋白质折叠、脂质合成和钙稳态的核心细胞器，对代谢负荷尤为敏感。尽管已知持续性FFA升高可诱导ER应激，但糖尿病精囊中脂质代谢障碍的表型尚未被报道。在糖尿病小鼠精囊组织中，ER应激标志物GRP78和CHOP的表达增加。HG处理的SVECs中重现了类似变化，同时p-IRE1α水平升高，提示未折叠蛋白反应（UPR）中IRE1α相关分支被显著激活。与此同时，糖尿病精囊组织和HG处理的SVECs表现出增强的凋亡相关信号，包括Bcl-2/Bax比值降低以及体内TUNEL阳性细胞增加。这些发现支持ER应激相关凋亡参与糖尿病精囊损伤的发病机制。重要的是，LC在两种模型中均显著减轻了ER应激标志物和凋亡相关变化，表明缓解ER应激是其保护效应的重要组成部分。除凋亡外，ER蛋白稳态也可能与糖尿病精囊损伤相关。SVECs是高分泌性上皮细胞，负责产生多种精浆成分，这对依赖ER的蛋白质折叠、脂质生物合成和钙稳态构成了巨大需求。在糖尿病条件下，脂质代谢紊乱和FFA蓄积可能增加ER蛋白稳态负担，并促进适应性不良的UPR激活。PPARα相关代谢信号受损与ER应激之间的机制关系得到了我们在SVECs中干预实验的进一步支持。LC在HG条件下恢复了PPARα/PGC-1α的表达，同时减轻了ER应激、凋亡相关变化和促纤维化反应。相比之下，使用4μ8C选择性抑制IRE1减轻了ER应激相关和凋亡相关变化，但未能恢复受损的PPARα/PGC-1α信号。尽管4μ8C通常用作IRE1α RNase活性抑制剂，我们承认不能完全排除潜在的脱靶或代偿效应。未来需要使用IRE1α基因抑制以及直接测定XBP1剪接或受IRE1调控的mRNA降解（RIDD）活性来验证这一机制。此外，直接过表达PPARα可缓解HG诱导的促纤维化重塑并抑制ER应激相关变化，产生的效果与LC处理观察到的效果大致相当。综合来看，这些观察结果表明，PPARα相关代谢信号中断可能在HG处理的SVECs中发生于ER应激激活的上游或与之平行。因此，LC可能通过恢复PPARα/PGC-1α相关的脂肪酸代谢调控、减轻脂毒性和缓解ER应激相关凋亡来改善糖尿病精囊纤维化。LC最近被证实可同时激活脂肪酸β-氧化并缓解高脂饮食（HFD）诱导的ER应激，这支持了我们的推测。然而，由于ER本身通过调控参与脂质合成和修饰的酶而参与脂质稳态，脂质代谢紊乱与ER应激之间可能存在相互调控。除调控脂质代谢外，LC还可能通过其抗炎和抗氧化作用减轻器官纤维化。此外，LC已被证明可改善肥胖大鼠模型中的胰岛素抵抗并增强睾酮分泌，这与我们的发现一致。解释LC体内保护效应时需考虑的一个重要因素是全身代谢改善的潜在贡献。在本研究中，LC部分改善了糖尿病小鼠的血糖（FBG）、胰岛素相关代谢指标和血清睾酮水平。血糖控制改善可能减轻糖毒性、氧化应激、糖基化相关损伤以及精囊组织中的ER应激激活，而胰岛素敏感性改善可能缓解全身代谢性炎症和脂质超载。此外，睾酮是维持精囊结构和分泌功能的关键营养因子。因此，循环睾酮的恢复可能有助于减轻精囊萎缩和重塑。因此，LC对糖尿病精囊损伤的体内有益效应应被理解为全身代谢改善与局部组织水平保护的综合结果。尽管如此，在HG处理的原代SVECs中观察到的保护效应支持LC具有额外的细胞自主性效应，独立于循环胰岛素或睾酮。这些发现提示，恢复PPARα/PGC-1α相关代谢调控和抑制ER应激可能代表LC介导精囊保护的局部机制，而全身代谢纠正仍然是一个重要的背景因素。然而，糖尿病精囊纤维化不太可能仅由SVEC内在的PPARα相关脂质失调和ER应激相关凋亡所解释。2型糖尿病（T2DM）相关慢性炎症可能通过炎症介质和促纤维化通路（如TGF-β/Smad信号）促进组织重塑。近期的精囊相关研究表明，赖氨酰氧化酶（LOX）通过TGF-β1信号通路促进糖尿病精囊萎缩和纤维化，并伴有CD4+和CD8+ T细胞浸润，而炎症性细胞死亡也被认为参与糖尿病精囊损伤。此外，感染性附睾-睾丸炎的证据表明，S100a4+巨噬细胞可能获得肌成纤维细胞样表型并参与胶原I型和纤连蛋白的产生，凸显了上皮-免疫串扰在男性生殖道纤维化中的潜在作用。因此，全身炎症、TGF-β1信号、炎症性细胞死亡和免疫介导的组织重塑可能代表平行或汇聚的机制，共同导致糖尿病精囊纤维化，尽管它们的相对贡献仍有待确定。本研究还考虑了铁死亡可能参与精囊纤维化。先前的研究表明，抑制铁死亡可减轻糖尿病引起的肝纤维化和肾纤维化。我们的脂质组学富集分析提示糖尿病精囊中可能存在铁死亡的参与。尽管我们在HG处理的SVECs中观察到ROS和MDA水平升高（被LC所减轻），但这些标志物并非铁死亡所独有。未来研究需要确定性测试铁死亡的参与，例如通过测定GPX4活性、SLC7A11表达、ACSL4、脂质过氧化特异性标志物（如4-HNE）以及使用铁死亡抑制剂进行挽救实验。尽管如此，LC对ROS/MDA的降低与其已知的抗氧化特性一致，进一步支持了其多效性保护效应。总之，本研究证明T2DM可促进精囊纤维化，并伴有脂质代谢稳态紊乱、PPARα/PGC-1α相关信号受损以及ER应激相关凋亡激活。LC改善糖尿病小鼠的精囊纤维化，与脂质代谢谱改善、PPARα/PGC-1α表达增加和ER应激减轻相关。这些发现为糖尿病精囊损伤的发病机制提供了新的见解，并支持LC作为值得进一步研究的候选干预手段。研究局限性本研究存在以下局限性应予承认。首先，SVECs的能量代谢模式仍需进一步探索，包括对FAO、糖酵解相关酶活性和线粒体功能的直接评估。其次，由于原代SVECs增殖能力有限且可能对基因操作和高糖应激的联合处理敏感，我们在本研究中未建立稳定的PPARα缺陷SVEC模型用于LC挽救实验。未来需要使用优化的PPARα敲低、药理学PPARα阻断或精囊特异性PPARα敲除模型来确定LC介导的保护作用是否依赖于PPARα。第三，尽管评估了精子质量和睾酮水平，但未检测精囊特异性功能结局，如精浆组成、果糖分泌、精囊来源的分泌蛋白、射精参数或生育/交配结局。因此，本数据无法确立LC介导的精囊挽救直接有助于生殖功能恢复。资源可获得性主要联系人：有关进一步信息和资源/试剂请求，应联系并交由主要联系人尚学军（[e-mail]）处理。材料可获得性：本研究未产生新的独特试剂。数据和代码可获得性：本研究产生的定量脂质组学数据集已提交至figshare（figshare: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32932709）。补充图和表格、未经裁剪的western blot图像以及原始显微图像分别作为数据S1、S2和S3提供在文档S1中。重新分析本文报道数据所需的任何其他信息均可从主要联系人处获取。致谢：感谢香港大学深圳医院董永康教授在本研究中的学术指导。我们感谢迈维代谢科技有限公司进行定量脂质组学测序和数据分析。本研究获国家自然科学基金资助（项目编号：82505580）。作者贡献：撰写—初稿、概念构思、数据整理、形式分析、可视化，P.L.；撰写—初稿、概念构思、方法学、经费获取、调查研究，Y.Y.；撰写—初稿、方法学、可视化，J.W.；方法学、验证、可视化，L.W.；方法学、软件、可视化，F.Y.；撰写—审阅与编辑、资源、经费获取，X.C.；撰写—审阅与编辑、监督、项目管理、概念构思，K.W.；撰写—审阅与编辑、监督、项目管理、经费获取、担保人，X.S.。所有作者均已阅读并批准最终稿件。利益声明：作者声明无利益冲突。生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明：在准备本工作期间，我们使用了"DeepSeek"AI来改善语言的逻辑连贯性。

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STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 抗体 | | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | 货号 ab268020；RRID: AB_2941028 |
| 抗I型胶原蛋白抗体 | Abcam | 货号 ab270993；RRID: AB_2927551 |
| III型胶原蛋白（N端）多克隆抗体 | Proteintech | 货号 22734-1-AP；RRID: AB_2879158 |
| 平滑肌肌动蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 货号 14395-1-AP；RRID: AB_2223009 |
| CTGF 兔多克隆抗体 | Abclonal | 货号 A11067；RRID: AB_2758390 |
| Timp-3 多克隆抗体 | Proteintech | 货号 10858-1-AP；RRID: AB_2204973 |
| Timp-1 多克隆抗体 | Proteintech | 货号 16644-1-AP；RRID: AB_2878292 |
| 抗MMP3抗体 | Abcam | 货号 ab52915；RRID: AB_881243 |
| PPARA 多克隆抗体 | Proteintech | 货号 15540-1-AP；RRID: AB_2252506 |
| PPARγ 多克隆抗体 | Proteintech | 货号 16643-1-AP；RRID: AB_10596794 |
| PGC1α 单克隆抗体 | Proteintech | 货号 66369-1-Ig；RRID: AB_2828002 |
| GRP78 抗体 | Affinity | 货号 AF5366；RRID: AB_2837851 |
| DDIT3/CHOP 抗体 | Affinity | 货号 AF6277；RRID: AB_2835130 |
| 磷酸化IRE1（Ser724）抗体 | Affinity | 货号 AF7150；RRID: AB_2843590 |
| 磷酸化PERK（Thr982）抗体 | Affinity | 货号 DF7576；RRID: AB_2833024 |
| ATF6 抗体 | Affinity | 货号 DF6009；RRID: AB_2833019 |
| Bcl2 多克隆抗体 | Proteintech | 货号 26593-1-AP；RRID: AB_2818996 |
| [敲除验证] Bax 兔单克隆抗体 | Abclonal | 货号 A20227；RRID: AB_3663017 |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Abcam | 货号 ab131205；RRID: AB_11156121 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | 货号 ab8226；RRID: AB_306371 |

| 生物样本 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 小鼠精囊组织 | 本文 | N/A |

| 化学品、肽和重组蛋白 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 链脲佐菌素 | Aladdin | S110910 |
| L-肉碱 | MedChemExpress | HY-B03994 |
| μ8C | Selleck | S7272 |

| 关键商业检测 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | BBI | D721159 |
| 小鼠睾酮ELISA试剂盒 | Jonlnbio | JL25196 |
| Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 |
| MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131 |
| ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033 |

| 存储数据 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 原始Western blot源数据 | 本文 | 文档S1，数据S2 |
| 原始显微镜源图像 | 本文 | 文档S1，数据S3 |
| 脂质组学数据 | 本文 | figshare: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32932709 |

| 实验模型：细胞系 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 小鼠原代精囊上皮细胞 | 本文 | N/A |

| 实验模型：生物体/品系 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 雄性C57BL/6小鼠 | 江大基因公司 | 证书编号 20230007002198 |

| 软件和算法 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| GraphPad Prism 9.0 | San Diego | N/A |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | N/A |
| DeepSeek | 杭州深度求索人工智能基础技术研究有限公司 | N/A |

| 其他 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 原始数据和分析数据 | 本文 | 可向主要联系人合理索取 |

实验模型和研究参与者详情

动物和伦理声明

雄性C57BL/6小鼠（5周龄；24–28 g；无特定病原体[SPF]）购自江大基因公司（中国南京）。所有小鼠均饲养于无特定病原体设施中，遵循12–12小时光暗循环（上午7点开灯），自由摄食和饮水。每个数据点至少分析3只小鼠。所有动物操作均经实验动物中心批准和监督（DZYJSKT202507160001），并符合AAALAC动物福利要求。

随机化和盲法

由未参与后续实验或分析的 researchers 使用计算机生成的随机化序列将动物随机分配至实验组。使用编码的动物和样本标识符对分组进行隐藏。组织学评分和图像定量由对处理组设盲的研究人员在编码的切片/图像上进行。所有评分和定量分析完成后才公开分组编码。

T2DM小鼠模型和实验分组

为建立T2DM小鼠模型，将40只小鼠随机分为对照组（CTRL）或T2DM模型组。为评估L-肉碱（LC）对糖尿病小鼠精囊（SV）纤维化的潜在治疗效果，动物进一步分为四组（每组n = 10）：CTRL组、T2DM组、T2DM + LC组和CTRL+LC组。CTRL组和CTRL+LC组小鼠饲喂标准饲料并注射柠檬酸缓冲液。相反，T2DM组和T2DM + LC组小鼠维持高脂饮食（HFD）5周。用于诱导T2DM的HFD脂肪供能60% kcal，碳水化合物供能20% kcal，蛋白质供能20% kcal，能量密度约为5.24 kcal/g。随后，小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（S110910，Aladdin），剂量为50 mg/kg/天，连续5天，STZ溶于0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 4.5）中。STZ给药一周后，经隔夜禁食测量空腹血糖（FBG），FBG ≥11.1 mmol/L的小鼠视为成功的T2DM模型。随后，T2DM + LC组和CTRL+LC组小鼠口服LC（100 mg/kg/天），其余两组注射生理盐水。LC剂量的选择基于以往小鼠研究，在这些研究中，通过口服灌胃给予100 mg/kg/天LC可恢复高脂饮食诱导的线粒体功能障碍和代谢异常。为支持转化相关性，使用FDA推荐的体表面积转换法估算了LC的人体等效剂量（HED）；小鼠100 mg/kg/天对应60 kg成人的486 mg/天，低于人体已确立的口服治疗剂量的低端范围。每两周监测体重和FBG。模型建立十周后，处死所有小鼠进行组织学和生化分析。

原代精囊上皮细胞的分离和培养

分离方案改编自既往研究并进行了修改。简要而言，新鲜采集的SV组织用无菌眼科剪剪成约1 mm3的小块。组织消化在含有1 mg/mL I型胶原酶和1 mg/mL透明质酸酶的DMEM/F12培养基中进行，37°C孵育60分钟，持续震荡（150 rpm）。细胞悬液通过80 μm尼龙网过滤，以500×g离心5分钟。细胞沉淀重悬于完全培养基中，该培养基由添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和1%上皮细胞生长补充剂（ECGS）的DMEM/F12组成。将细胞悬液接种到鼠尾胶原I型包被（50 μg/cm2，Corning #354236）的培养皿中，在37°C、含5% CO?的湿润环境中培养。为选择性富集精囊上皮细胞（SVECs），采用差异贴壁法。初始接种8小时后，将含有非贴壁上皮细胞的培养基小心转移至新的鼠尾胶原包被培养皿中，而贴壁的基质细胞（主要为成纤维细胞）则丢弃。每48小时更换一次新鲜完全培养基，直至细胞达到70–80%汇合度。

通过泛细胞角蛋白抗体（1:1000，26411-1-AP，Proteintech）进行免疫荧光染色确认原代上皮细胞身份，最终培养物纯度>97%。为评估可能的成纤维细胞污染，在实验刺激前进行了波形蛋白免疫荧光，仅观察到极少数波形蛋白阳性细胞。随后将这些纯化的上皮细胞用于后续实验。

高糖刺激和渗透压对照

原代SVECs在正常糖条件（NG；5.5 mM D-葡萄糖）、高甘露醇渗透压对照条件（HM；5.5 mM D-葡萄糖加24.5 mM D-甘露醇）或高糖条件（HG；30 mM D-葡萄糖）下培养。细胞处理72小时，之后通过Western blot检测I型胶原、GRP78和PGC-1α的表达水平。

方法细节

糖尿病小鼠评估

经隔夜禁食后，分别使用血糖仪（Sinocare，中国长沙）和商业胰岛素ELISA试剂盒（D721159，BBI）测量空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FINS）水平。胰岛素敏感性计算如下：胰岛素敏感性指数 = 14.1/[FBG × FINS] × 100。此外，HOMA-IR使用以下公式确定：HOMA-IR = FBG × FINS/14.1。

精囊重量和器官指数评估

分离双侧精囊，清除周围脂肪和结缔组织后立即称重。SV器官指数使用以下公式计算：SV器官指数（%）= 双侧SV湿重（g）/体重（g）× 100。

脂质提取和LC-MS/MS分析

使用基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的平台对CTRL、T2DM和T2DM + LC三组（每组n = 10）的SV样品进行定量脂质组学分析。简要而言，约20 mg冷冻小鼠SV组织在冰上解冻，用钢珠以30 Hz匀浆20秒。加入1 mL含有内标混合物的MTBE（甲基叔丁基醚）: MeOH（甲醇）= 3:1（v/v）提取溶剂提取脂质。涡旋15分钟后，加入200 μL超纯水诱导相分离。样品涡旋1分钟，4°C、12,000 rpm离心10分钟。收集200 μL上层有机相并蒸干。干燥的脂质提取物用200 μL ACN（乙腈）: IPA（异丙醇）= 1:1（v/v）重溶，涡旋、离心，上清液用于LC-MS/MS分析。脂质提取物使用ExionLC AD UPLC系统联用SCIEX QTRAP 6500+串联质谱仪进行分析。色谱分离在Thermo Accucore C30柱上进行。流动相A由乙腈/水 = 60/40（v/v）组成，含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵；流动相B由乙腈/异丙醇 = 10/90（v/v）组成，含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵。流速为0.35 mL/min，柱温维持在45°C，进样量为2 μL。质谱检测在正负电喷雾电离（ESI）模式下使用多反应监测（MRM）进行。

脂质鉴定、定量和质量控制

脂质种类使用Metware内部脂质数据库MWDB进行注释，基于保留时间和前体离子/产物离子对信息。定量使用内标法进行。色谱峰进行积分和校正，脂质含量根据以下公式计算：X = 0.001×R×c×F×V/m，其中X代表脂质含量，R代表分析物/内标峰面积比，F代表不同脂质类别的校正因子，c代表内标浓度，V代表提取体积，m代表组织重量。因此，脂质丰度数据在下游分析前已归一化至内标和组织重量。通过将所有研究样品的等量混合制备混合质控（QC）样品，并在分析序列中定期注入（通常在每10个研究样品后），以监测分析稳定性。使用QC总离子流重叠、QC样品间的Pearson相关分析和QC变异系数分布来评估仪器性能和数据可重复性。基于这些QC评估，未观察到明显的批次效应；因此，除内标校正、组织重量归一化和峰积分校正外，未应用额外的计算批次校正算法。

脂质组学数据处理和分析

数据经过log?转换和均值中心化后，使用R中的MetaboAnalystR软件包进行正交投影到潜空间判别分析（OPLS-DA）（www.r-project.org）。变量重要性投影（VIP）评分>1且Student's t检验p值<0.05的代谢物被视为显著。置换检验（200次迭代）验证了模型对过拟合的稳健性。将显著代谢物与KEGG化合物数据库进行注释并映射到KEGG通路。使用超几何检验通过代谢物集富集分析（MSEA）评估通路显著性。

血清睾酮分析

为尽量减少昼夜节律对循环睾酮水平的影响，在固定的12小时光暗周期下，于上午08:00至10:00之间采集血样。血样在4°C、14,000 rpm下离心20分钟以获得血清。血清中睾酮的浓度使用商业ELISA试剂盒（JL25196，Jonlnbio）按照制造商推荐方案进行定量。

精子收集和分析

从每只小鼠分离尾状附睾并浸入200 μL PBS缓冲液中。用无菌眼科剪仔细剪碎组织，并在37°C孵育15分钟以使精子释放。取10 μL所得精子悬液置于载玻片上并盖上盖玻片。使用200倍光学显微镜观察评估精子数量和运动能力。

组织病理学分析

从小鼠中取出SV组织并立即在4°C、4%多聚甲醛中固定24小时。固定后，组织经梯度乙醇系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为4 μm。每组使用3只小鼠的精囊组织进行组织病理学评估。对于苏木精-伊红（H&E）染色，石蜡切片在二甲苯中脱蜡，经递减乙醇系列复水，苏木精染色，分化，伊红复染，经递增乙醇系列脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。H&E染色切片用于评估组织一般形态，包括腺体结构、上皮完整性、导管结构和基质重塑。使用商业Masson三色染色试剂盒（G1340，Solarbio）按照制造商说明评估胶原沉积和纤维化重塑。简要而言，石蜡切片脱蜡、复水，用试剂盒提供的试剂依次染色，分化，脱水，透明并封片。组织病理学变化基于代表性显微镜图像进行描述性评估。

TUNEL实验

使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验检测SV组织中的凋亡细胞。经标准脱蜡和复水程序后，组织切片用蛋白酶K（20 μg/mL）在37°C处理15分钟进行通透化。切片随后与50 μL TUNEL反应混合物在37°C孵育60分钟。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；5 μg/mL）在室温下复染5分钟。

免疫荧光染色

细胞用4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定15分钟，随后用0.2% Triton X-100（必要时）进行通透化，并用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。一抗4°C过夜孵育后，细胞用荧光素偶联的二抗（1:500）在室温下处理1小时。

细胞核使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI;1 μg/mL)复染5分钟。荧光图像通过倒置荧光显微镜(NIB610-FL,Nexcope)采集,每个样本随机捕获三个视野用于定量分析。免疫组化染色石蜡包埋组织切片经分级乙醇脱蜡和复水。抗原修复在95°C的10 mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中加热20分钟。非特异性结合通过室温下PBS中5% BSA封闭1小时予以阻断。切片随后在4°C用一抗孵育过夜,继而在室温下用相应的辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗孵育1小时。经PBS洗涤后,使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)作为显色底物显现免疫反应性,继以苏木精复染。染色切片在明场显微镜(Eclipse 80i,Nikon)下成像,每个样本在200×放大倍数下随机捕获三个视野。Western blot seminal vesicle组织和细胞样本在补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾液的RIPA裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中匀浆。使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce/Thermo Scientific)测定蛋白浓度。含10–40 μg蛋白的等分样品经SDS-PAGE分离后电转至PVDF膜(Millipore,德国)。在室温下用TBST中5% BSA封闭1小时后,膜在4°C用一抗孵育过夜。经TBST洗涤三次后,膜在室温下用HRP偶联二抗孵育1小时。二抗包括HRP偶联抗小鼠IgG(LF101,1:5000,Epizyme)和HRP偶联抗兔IgG(LF102,1:5000,Epizyme)。使用增强化学发光(ECL)底物显影蛋白条带,并使用ImageJ软件进行光密度定量分析。对于Western blot分析,所有报告的n值均代表生物学重复而非技术重复。每个生物学重复均由独立采集或制备的样本生成,并施加所指定的实验处理。技术重复不计入用于统计分析的独立n值。细胞内MDA和ROS测定在用好培养的SVECs以高糖(HG;30 mM)和LC(1 mM)孵育24小时后,分别使用MDA测定试剂盒(S0131,Beyotime)和ROS测定试剂盒(S0033,Beyotime)测定丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平,同时使用BCA蛋白测定试剂盒测定细胞样本的蛋白浓度。定量与统计分析所有实验数据均使用GraphPad Prism 9.0软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行分析和绘图。数据以均值±标准差(SD)表示。使用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性,并在适当情况下使用Levene检验或Brown–Forsythe检验评估方差齐性。对于两个独立组之间的比较,当数据满足参数假设时,采用非配对双侧Student's t检验。对于超过两个独立组之间的比较,采用单因素方差分析(ANOVA),并在所有两两比较均相关时继以Tukey事后检验。当多个处理组与预设对照组进行比较时,采用Dunnett事后检验。对于不满足参数检验假设的数据,视情况采用Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验继以Dunn多重比较检验。p值<0.05被视为具有统计学意义。补充信息(1)PDF(3.06 MB)文件S1。图S1–S5、表S1以及数据S1–S3