Trop-1/EpCAM苏氨酸115位点是COVID-19中过度增殖性细胞修复和严重肺损伤的驱动因素

《iScience》：Trop-1/EpCAM Thr115 is a driver of hyperproliferative cell repair and of severe lung damage in COVID-19

　　

要点

• Trop-1/EpCAM Thr115多态性与严重COVID-19预后相关
• Trop-1/EpCAM Thr115驱动正常细胞和转化细胞的增殖
• Trop-1/EpCAM Thr115在COVID-19中驱动肺部高增殖性创面修复
• Trop-1/EpCAM Thr115的肺部修复导致氧气扩散减少超过100倍

摘要
SARS-CoV-2肺部感染引发的急性反应可能严重损害氧气交换，但其潜在的分子机制尚不清楚。研究发现，TROP1/EPCAM p.M115T多态性与COVID-19严重程度相关。我们发现，T115 Trop-1/EpCAM是细胞生长的驱动因子，而M115 Trop-1/EpCAM几乎没有（或完全没有）诱导细胞生长的能力。TROP1/EPCAM基因敲除小鼠表现出胚胎干细胞增殖能力的改变。随后发现，Trop-1/EpCAM T115等位基因驱动小鼠成纤维肉瘤细胞的过度增殖能力。通过CRISPR-Cas9敲除内源性TROP1/EPCAM并比较转染TROP1/EPCAM p.T115（T修饰）或p.M115（M修饰）等位基因，在人结肠癌细胞中观察到相应的生长刺激。在COVID-19患者中，T115 Trop-1/EpCAM导致SARS-CoV-2损伤的肺泡中异常的过度增殖性创面修复，从而引发严重的氧气交换障碍。尸检分析COVID-19患者肺部发现，感染受损的肺泡上皮上，T115 Trop-1/EpCAM阳性上皮细胞过度增殖。这与T115 Trop-1/EpCAM阳性炎症细胞的过度增殖和肺泡透明膜形成相关。计算表明，这些多层屏障使氧气扩散减少了多达100倍。我们的发现揭示了一种意想不到的T115 Trop-1/EpCAM导致肺损伤的机制，并提示其作为相应治疗方法的潜在靶点。

图形摘要

引言

COVID-19大流行开始多年后，确定决定疾病严重程度的分子机制仍是一个主要挑战。年龄、性别和既有病理状况已被证明会影响临床预后。遗传因素可能在疾病进展中发挥关键但尚不完全理解的作用。对GEN-COVID联盟（n=2,446）的外显子组测序数据应用机器学习模型，使我们能够鉴定出TROP1/EPCAM基因的p.Met115Thr（M115T）（rs1126497；c.344T>C）多态性作为COVID-19病程的独立预后因素。其他遗传变异也与COVID-19严重程度相关，其中包括位于染色体3p21.31位点的多态性（该位点包含LZTFL1转录因子、SLC6A20溶质载体家族6成员20、CCR9趋化因子和CXCR6趋化因子受体等基因）。参与维持上皮组织架构的TROP1/EPCAM基因多态性与COVID-19严重程度的关联，提示T115等位基因可能参与肺上皮细胞病理过程。

TROP1/EPCAM基因（星号方法——命名法）编码Trop-1/EpCAM，一种单体跨膜糖蛋白，能够传导细胞内钙信号。在上皮细胞中，Trop-1/EpCAM参与相邻细胞接触位点处细胞-细胞粘附结构的形成。Trop-1/EpCAM不属于其他已知的细胞-细胞粘附分子类别，且尽管早期有提示，它并非本身就是一种粘附分子，而是下调E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的粘附功能。

Trop-1/EpCAM由增殖的上皮细胞以及上皮、生殖和造血谱系的祖细胞表达。值得注意的是，Trop-1/EpCAM也被大量人类癌症表达，其中Trop-1/EpCAM阳性CD44阳性细胞构成增殖区室/祖细胞。Trop-1/EpCAM经蛋白水解切割激活后，触发肿瘤细胞生长和恶性进展。

本文中，我们展示TROP1/EPCAM基因的一个常见多态性（p.M115T）是一种驱动严重COVID-19肺损伤的宿主因素。Trop-1/EpCAM是癌症驱动因子，大规模肿瘤DNA测序项目（www.cbioportal.org/datasets）频繁将TROP1/EPCAM p.M115T（rs1126497；c.344T>C）多态性列为突变（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P16422/entry），主要是因为缺乏与胚系数据的肿瘤序列比较。

在本文中，我们发现了T115 Trop-1/EpCAM是肿瘤细胞生长的驱动因子，而M115 Trop-1/EpCAM几乎没有（或完全没有）诱导细胞生长的能力。我们在实验细胞模型中评估了M115与T115 Trop-1/EpCAM等位基因诱导的差异性生长。我们通过在TBV-2小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行靶向基因替换获得mTrop1失活。我们发现单倍体TROP1/EPCAM ES细胞的增殖能力较低，这表明对内源性TROP1/EPCAM基因存在定量反应。成纤维肉瘤L细胞转染T115与M115 Trop-1/EpCAM等位基因的结果显示，T115等位基因赋予过度增殖特性，而M115等位基因基本上没有诱导细胞增殖的能力。T115/M115杂合细胞显示出中间的增殖速率，提示其与T115 Trop-1/EpCAM表达水平之间存在定量关系。通过CRISPR-Cas9敲除KM12SM人结肠癌细胞中的TROP1/EPCAM并转入两个等位基因进行转基因，正式证实了这些发现。在该细胞系统中，仅T115等位基因保留了驱动生长的能力。

这些发现使我们推测，T115 Trop-1/EpCAM作为伤口愈合细胞增殖诱导剂，在COVID-19患者受损肺上皮中发挥关键作用。对COVID-19患者尸检肺部的免疫组织化学（IHC）分析表明，从上皮损伤修复的最早阶段开始，II型肺泡细胞（AT2）中就诱导了Trop-1/EpCAM表达。随后出现T115 Trop-1/EpCAM阳性细胞的过度增殖，并形成多层肺泡细胞层，严重阻碍了氧气扩散。T115 Trop-1/EpCAM表达也见于炎症细胞中，在严重疾病的COVID-19患者肺部组织中，它与免疫细胞增殖相关。这种过度炎症状态导致肺泡内透明膜形成，进一步降低了氧气渗透性。

这些发现表明了一种意想不到的病毒感染后急性肺损伤途径，该途径与严重COVID-19预后相关。

结果

p.M115T TROP1/EPCAM基因与COVID-19严重程度相关

通过对一组2,446名不同疾病严重程度的SARS-CoV-2感染受试者应用后孟德尔遗传模型，我们鉴定出TROP1/EPCAM（NM_002354.3）p.M115T（rs1126497，c.344T>C）多态性对疾病预后的贡献。

为了评估该多态性的病理作用，我们将严重COVID-19患者（病例组）与无疾病症状的感染个体（对照组）进行比较（n=1848）。所识别的频率符合哈迪-温伯格平衡。我们队列中的小等位基因频率（37.05%）与意大利基因组网络数据库（NIG；http://nigdb.cineca.it/）报告的频率（37.3%）相似。我们队列中的多态性等位基因频率与gnomAD报告的欧洲（非芬兰）人群频率也相应相似（表1）。我们将患者分为两类：具有杂合或纯合TROP1/EPCAM p.T115多态性的患者以及p.M115纯合的患者（表2）。我们发现p.T115纯合子患严重COVID-19的风险增加（比值比[OR]为1.52，95%置信区间[CI] 1.15–2.01），p值为2.9×10?3（表3）。

核苷酸 氨基酸 等位基因频率gnomAD 等位基因频率GEN-COVID队列 人群
c.344T Met115 0.57 0.63 欧洲（非芬兰）
c.344C Thr115 0.43 0.37 欧洲（非芬兰）

表1 TROP1/EPCAM基因中rs1126497（c.344T>C）多态性在欧洲（非芬兰）人群（gnomAD）和GEN-COVID队列（病例加对照）中的等位基因频率

Trop-1/EpCAM第115位氨基酸 总数 M115/M115纯合 M115/T115杂合 T115/T115纯合
患者数 713 887 248 1,848

表2 TROP1/EPCAM基因中rs1126497（c.344T>C）多态性在GEN-COVID队列（病例加对照）中的患者数量

表型 M115T纯合 其他 总计
严重 160 871 1031
非严重 887 298 1185
总计 248 1,600 1,848

表3 TROP1/EPCAM多态性与GEN-COVID队列中疾病风险的统计学分析
OR=1.52（95%CI 1.15–2.01）p=2.9×10?3

肿瘤基因组中的TROP1/EPCAM序列变异

Trop-1/EpCAM表达对乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌及其他肿瘤的进展有影响。在癌细胞中，Trop-1/EpCAM作为野生型分子过表达时发挥增殖驱动因子的作用。

我们在博德研究所网络库、国际癌症基因组联盟（ICGC）、全球变异组共享莱顿开放变异数据库（LOVD）、cBioportal和ClinVar等Web库中对M115T变异的普遍性和功能进行了系统分析。M115T多态性在癌症序列数据库中广泛被误分类为突变（图1A和1B）。其与Lynch综合征及儿科癌症的关联最初被用来支持致突变模型。这些发现现在可重新解释为支持胚系T115 Trop-1/EpCAM变异的肿瘤进展作用。

图1 Trop-1/EpCAM M/T变异体的普遍性及结构/功能关联

(A) TROP1/EPCAM基因的序列分析。
(B)（上）T115变异体在测序癌症基因组中的普遍性。（下）M115T多态性在儿科泛癌研究中（cBioportal；www.cbioportal.org/datasets）被列为主要变异体。
(C和D) Trop-1/EpCAM T115变异体的结构。PDB ID 4mzv以二聚体形式显示。Trop-1/EpCAM青色对照绿色单体。红色：T115。(C) 卡通结构表示。(D)（上）分子表面表示。红色：T115。（下）分子表面放大。T115球体表示。
(E) 使用T115 Trop-1/EpCAM（4mzv）结构作为模板获得M115 Trop-1/EpCAM的模型结构。将T115（绿色）和M115（青色）Trop-1/EpCAM变异体用PyMol（https://www.pymol.org/）叠加。红色箭头：T115（绿色）和M115（青色）空间填充模型。
(F) Trop-1/EpCAM T115和M115的Φ和Ψ肽键角的Ramachandran图分析。在T115与M115 Trop-1/EpCAM结构中，Φ和Ψ角基本保持不变。显示按常规着色的残基图。绿色阴影：允许区域。

M115与T115 Trop-1/EpCAM的结构

关于M115T多态性对Trop-1/EpCAM结构和功能影响方面的实验证据非常有限。Trop-1/EpCAM T115与M115转染体的比较未显示表达水平有显著差异，表明该多态性对两种多态性Trop-1/EpCAM的转运和稳定性影响有限（如果有影响的话）。Sorting Intolerant From Tolerant（SIFT）分析（https://sift.bii.a-star.edu.sg/）可根据序列同源性以及氨基酸的物理性质，预测氨基酸替换是否影响蛋白质功能。SIFT计算表明，Thr和Met在第115位作为耐受残基具有高分值（图S1）。

使用T115 Trop-1/EpCAM（4mzv）结构作为模板获得M115 Trop-1/EpCAM的结构（图1C–1E）。随后使用PyMol（https://www.pymol.org/）将T115和M115 Trop-1/EpCAM变异体叠加（图1C）。这显示两种结构之间没有明显的分歧。通过Ramachandran图分析进行了正式评估（图1F）。这揭示了T115和M115 Trop-1/EpCAM结构中Φ和Ψ肽键的基本不变性，提示T115与M115多态性残基对Trop-1/EpCAM结构的影响差异有限。

T115/M115被证明是分子表面空腔中溶剂可暴露的残基，该空腔基本上由Met的疏水侧链填充（图1D和1E）。再加上Thr侧链的极性，提示与Trop-1/EpCAM该区域的结合伙伴的潜在相互作用可能因多态性改变为Met而受到影响。

mTrop1+/-敲除细胞显示增殖能力降低

我们此前已证明Trop-1/EpCAM可在控制细胞增殖中发挥关键作用。因此，我们研究了Trop-1/EpCAM T115与M115等位基因在驱动细胞生长中的作用。

通过在TBV-2小鼠ES细胞系中进行靶向基因替换获得小鼠mTrop1失活。从TBV-2 ES基因组DNA中PCR扩增外显子1上游85 bp处的一个1,267 bp DNA片段（5'同源区域[HR]），以及从C57/Bl6小鼠细菌人工染色体（BAC）文库中PCR扩增从内含子3到内含子5的一个3,700 bp DNA片段（3' HR）。含有5'和3' HR flank的floxed磷酸甘油酸激酶（PGK）-neo盒子的靶向载体经线性化后电穿孔导入TBV-2 ES细胞。mTrop1位点的同源重组预计通过用一个2,341 bp区域（包含mTrop1开放阅读框的转录和翻译起始位点及前27个密码子）替换PGK-neo选择盒来产生空等位基因（图2A）。候选基因替换ES克隆通过G418/更昔洛韦抗性筛选获得。

图2 通过靶向基因替换获得mTrop1+/-敲除细胞

(A) 通过靶向基因替换实现mTrop1失活的策略示意图，改编自Guerra等人。5'HR和3'HR（同源区域；粗蓝线）表示在靶向载体中克隆的5'和3'基因组mTrop1序列，夹在mPgk1-neo抗性盒（黄色；红色箭头：lox位点）两侧。在HR外部，载体携带mPgk1-TK自杀盒（红色）。载体携带的mTrop1 HR可与相应的基因组序列发生同源重组，用抗性盒替换mTrop1位点（灰色）之间的序列，从而产生空mTrop1等位基因。

探针位置、相关限制性内切酶及相应的DNA片段长度用于5′（洋红色）和3′（棕色）。Southern杂交分析。PGK，磷酸甘油酸激酶启动子；neo，新霉素磷酸转移酶基因；TK，胸苷激酶基因。(B) ES细胞在丝裂霉素C处理的鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上培养，在相差显微镜下呈现为折光性细胞聚集体（20×物镜）。半合子mTrop1+/? ES细胞的细胞聚集体大小低于mTrop1 ES细胞。比例尺，50 μm。(C) 在无LIF条件下，野生型mTrop1 ES细胞（WT-LIF）和半合子mTrop1+/? ES细胞（敲除[KO]-LIF）的生长曲线。KO-LIF的增殖能力低于WT-LIF。在防止分化的条件下（培养于饲养细胞层上，培养基中补充白血病抑制因子[LIF]），TROP1/EPCAM敲除与野生型ES细胞的生长显示出不同的增殖模式（图2B）。然而，LIF可能干扰Trop-1/EpCAM功能。因此，进一步在无LIF和无饲养细胞的条件下评估了TROP1/EPCAM敲除细胞的生长。结果表明，半合子TROP1/EPCAM ES细胞的增殖能力低于wtTROP1/EPCAM（图2C），提示细胞生长对TROP1/EPCAM基因存在定量应答。

T115 Trop-1/EpCAM是细胞生长的独特驱动因子。Trop分子在不同正常和转化细胞中驱动生长信号传导。其中，L细胞被证明对TROP1/EPCAM基因的表达存在定量应答。我们将L细胞转染T115或M115 Trop-1/EpCAM等位基因。流式细胞术分选筛选出Trop-1/EpCAM+细胞，以平行表达水平检测细胞膜上各Trop-1/EpCAM变异体的表达（图3A，左）。细胞生长实验表明，T115等位基因赋予过度增殖特性，而M115等位基因几乎没有或极少表现出促生长能力（图3A，右）。我们获得了共表达T115和M115 Trop-1/EpCAM等位基因的转染体。T/M与T/T与M/M Trop-1/EpCAM等位基因的对比评估显示，T/M的细胞生长诱导水平居中。换言之，我们发现M115 Trop-1/EpCAM对T115等位基因不存在显性负效应，而是对T115 Trop-1/EpCAM等位基因表达水平存在定量依赖性（图3A，右）。

图3 T115 Trop-1/EpCAM诱导细胞生长（A）L细胞转染体。（左）鼠纤维肉瘤L细胞（不含内源性mTrop-1）转染TROP1/EPCAM M115（蓝色）、T115（红色）及M115+T115（青色）后的Trop-1/EpCAM流式细胞术分析图谱。（右）L细胞转染体相应的体外细胞增殖测定。数据以三重复样品的均值±标准误表示。(B–E) KM12SM敲除细胞。(B) 生成不含Trop-1/EpCAM的人类癌细胞实验策略。针对人TROP1/EPCAM基因特定区域（外显子1和2）设计的两种CRISPR-Cas9 sgRNA被亚克隆至慢病毒载体LentiCRISPRv2中。包装HEK-293细胞与重组LentiCRISPRv2及辅助质粒pVSVG和psPAX2共转染。组织培养上清液中的重组病毒粒子用于感染KM12SM靶细胞。用嘌呤霉素筛选敲除细胞。(C) 经CRISPR-Cas9稳定灭活TROP1/EPCAM表达后，KM12SM细胞中Trop-1/EpCAM表达的流式细胞术分析。（黑色）未染色细胞。（洋红色）用阴性对照CRISPR（空载LentiCRISPRv2病毒粒子，阴性对照CR）感染的细胞。（青色）用CRISPR1病毒粒子感染KM12SM后Trop-1/EpCAM表达缺失（KO CR1）。（绿色）用CRISPR2病毒粒子感染KM12SM后Trop-1/EpCAM表达缺失（KO CR2）。(D)（绿色）KM12SM敲除细胞转染Trop-1/EpCAM变异体M-mod或T-mod后的Trop-1/EpCAM免疫荧光/共聚焦显微镜分析。（蓝色）DAPI细胞核复染。比例尺，10 μm。(E) 稳定转染TROP1/EPCAM M-mod（蓝色）、T-mod（红色）变异体或空载体的KM12SM敲除细胞的体外细胞增殖测定。数据以三重复样品的均值±标准误表示。

转基因T115 Trop-1/EpCAM驱动CRISPR-Cas9 TROP1/EPCAM敲除癌细胞的增殖。人KM12SM结肠癌细胞持续表达Trop-1/EpCAM并对其促生长活性存在定量应答。因此，我们通过CRISPR-Cas9敲除了KM12SM细胞中的内源性TROP1/EPCAM基因，使用了两种独立的移码单导向RNA（sgRNAs），分别靶向TROP1/EPCAM基因的不同区域（图3B和S2；及STAR Methods）。流式细胞术分析证实了基因成功消融，表现为表面Trop-1/EpCAM蛋白表达丧失（图3C）。随后，我们将T115 Trop-1/EpCAM（T-mod）或M115 Trop-1/EpCAM（M-mod）表达载体稳定转染至TROP1/EPCAMKO KM12SM细胞中（图3D）。为阻止CRISPR-Cas9损伤被转导的TROP1/EPCAM基因，在T-mod和M-mod TROP1/EPCAM cDNA的每个CRISPR靶区引入了三个沉默突变。这使得T-mod和M-mod转基因错配，并对靶向内源性wtTROP1/EPCAM而设计的CRISPR1和CRISPR2复合物具有抗性（图S2）。这一策略使我们在KM12SM/EPCAMKO细胞中获得了T-mod和M-mod Trop-1/EpCAM的稳定表达。体外细胞增殖能力对比显示，T115等位基因赋予过度增殖特性，而M115等位基因对癌细胞生长几乎没有或极少影响（图3E）。

Trop-1/EpCAM T115与M115的信号传导调控。早期证据表明，Trop-1/EpCAM与CD9在人癌细胞质膜上紧密相互作用并调节细胞增殖。在此，我们发现通过CRISPR-Cas9灭活基因抑制Trop-1/EpCAM表达会导致CD9下调（图S3）。值得注意的是，重新表达M115 Trop-1/EpCAM（M-mod）可将CD9表达恢复到原有水平。另一方面，在Trop-1/EpCAM敲除细胞中重新表达T115 Trop-1/EpCAM（T-mod）未能挽救CD9表达（图S3）。CD9被报道作为转化细胞生长的分子抑制因子。因此，我们的发现与Trop-1/EpCAM T-mod通过抑制CD9表达来诱导细胞增殖的作用相符。

T115 Trop-1/EpCAM患者中过度增殖性肺泡修复。分析因COVID-19去世患者的尸检肺标本（表S1）。所有病例均观察到急性弥漫性肺泡损伤（DAD）的组织学发现，其中65%检测到DAD晚期阶段。20例中有15例（75%）发现透明膜（表S1和S2）。20例中有4例（20%）出现鳞状上皮化生。20例中有7例（35%）存在毛细血管微血栓。其中17例患者我们能够评估T115/M115（M/T）多态性状态：7例为M115纯合状态（M/M），1例为T115纯合状态（T/T），9例为M/T杂合状态。由于样本量较少，将T/T纯合病例与9例M/T杂合病例合并分析。20例尸检肺标本中有18例可评估Trop-1/EpCAM表达。所有病例在DAD区域的AT2肺泡细胞增生区均发现Trop-1/EpCAM膜免疫反应（图4）。20例中有14例（70%）在过度增殖的AT2肺泡细胞中发现Trop-1/EpCAM高弥漫性表达（图4）。M/T患者中AT2细胞表达Trop-1/EpCAM的比例高于M/M患者（67.8% ± 5.4%；均值±标准误 vs 40.9% ± 8.9%）（p = 0.017，独立样本t检验），与T115 Trop-1/EpCAM作为异常过度增殖性肺泡修复驱动因子的模型一致（表S1A）。

图4 Trop-1/EpCAM表达在肺泡细胞增生中被诱导。患者样本全片（表S1A和S1B）进行了系统性检查。按照STAR Methods所述方法显影的Trop-1/EpCAM表达，使用20×物镜在每张切片上的十个随机视野点进行定量。20×物镜显微视野对应主径为1 mm的面积。统计分析按STAR Methods所述方法进行。（左）COVID-19患者AT2肺泡细胞增生中Trop-1/EpCAM弥漫性免疫染色（箭头所指）。肺泡细胞呈增大和非典型形态。主图：比例尺，50 μm；放大图：比例尺，25 μm。（右）AT2肺泡细胞增生中Trop-1/EpCAM表达分布的箱线图。因COVID-19去世患者肺自检验标本（n = 18）。箱图上下边界：分别为第75和第25百分位。条：置信区间。水平实线：中位数值。M/T病例Trop-1/EpCAM表达高至2倍。M/T杂合患者AT2细胞表达Trop-1/EpCAM的比例高于M/M纯合患者（67.8% ± 5.4%；均值±标准误 vs 40.9% ± 8.9%）（p = 0.017，独立样本t检验）。这些图片为所分析样本的代表性图像。

上皮细胞增殖率通过IHC对Ki67表达进行测定，使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织。M/M纯合和M/T杂合患者肺泡细胞中Ki67表达图谱见图5。COVID-19患者AT2肺泡细胞中Ki67表达中位值远高于对照组，表明COVID-19患者存在过度增殖性肺泡修复（Mann-Whitney U检验；U值 = 0，MW p = 0.0000014）。M/T杂合患者Ki67+ AT2肺泡细胞数量显著高于M/M纯合患者（U值 = 4.0，MW p = 0.04），与T115 Trop-1/EpCAM驱动增殖的作用一致。

图5 肺损伤修复中上皮细胞增殖——Ki67免疫染色（A）M/M纯合。（B）M/T杂合。（C）T/T纯合患者。箭头所指：肺泡II型Ki67阳性细胞。(D) 按Trop-1/EpCAM变异体分组（Met/Met（红色）或Thr/Met（绿色））COVID-19患者肺泡细胞Ki67阳性百分比分布的箱线图。未受COVID-19影响的患者对照组的相应分布以蓝色显示。Met/Met患者巨噬细胞增殖中位数为12%，Thr/Met病例为19%，支持其在驱动过度炎症中的作用。箱图上下边界：分别为第75和第25百分位。条：置信区间。水平实线：中位数值。圆点：个体数值。COVID-19患者AT2肺泡细胞中Ki67表达中位值高于对照组（Mann-Whitney U检验；U值 = 0，MW p = 0.0000014）。M/T杂合患者Ki67+ AT2肺泡细胞数量显著高于M/M纯合患者（U值 = 4.0，MW p = 0.04）。这些图片为所分析样本的代表性图像。比例尺：(A)中为15 μm，(B)和(C)中为25 μm。患者样本全片（表S1A和S1B）进行了系统性检查。按照STAR Methods所述方法显影的Ki67表达，使用20×物镜在每张切片上的十个随机显微视野点进行定量。20×物镜显微视野对应主径为1 mm的面积。统计分析按STAR Methods所述方法进行。

在损伤修复早期阶段即发现Trop-1/EpCAM高表达，即在AT2肺泡细胞单层中（图6，左）。在晚期阶段，肺泡腔由多层增殖上皮细胞覆盖，这些细胞在细胞膜上均匀表达高水平Trop-1/EpCAM（图6，右）。

图6 AT2肺泡细胞增生中Trop-1/EpCAM免疫染色高表达（箭头所指）。（左）：Trop-1/EpCAM M115纯合患者样本中Trop-1/EpCAM阳性细胞单层。比例尺，20 μm。（右）：Trop-1/EpCAM M115/T115杂合患者样本中Trop-1/EpCAM阳性多层增生细胞。比例尺，50 μm。这些图片为所分析样本的代表性图像。

透明膜形成与DAD相关（图7；表S1）。所有出现透明膜形成的病例、所有出现鳞状上皮化生的病例以及67%出现毛细血管微血栓的病例均发现Trop-1/EpCAM阳性（图8；表S1）。

图7 透明膜存在于弥漫性肺泡损伤区域。所有COVID-19病例均观察到急性弥漫性肺泡损伤（DAD）的组织学发现，其中65%患者出现DAD晚期阶段。20例患者中有15例（75%）发现透明膜（表S2）。（左）Trop-1/EpCAM M115纯合患者样本。（右）Trop-1/EpCAM M115/T115杂合患者样本。比例尺，50 μm。这些图片为所分析样本的代表性图像。

图8 透明膜和表达Trop-1/EpCAM的II型肺泡细胞在大多数COVID-19患者中存在。*：透明膜。AT2肺泡细胞中相关Trop-1/EpCAM免疫染色阳性（棕色区域，箭头所指）。Trop-1/EpCAM M115/T115杂合患者样本。比例尺，25 μm。所展示图片为所分析病例系列样本的代表性图像。

由于Trop-1/EpCAM的旁系同源物Trop-2可发挥平行的功能作用，为使分析完整，我们调查了COVID-19患者肺组织中Trop-2的表达。

与我们模型一致，在存在透明膜的区域，上皮增殖修复区域中的AT2肺泡细胞增生诱导了Trop-2表达。Trop-2在AT2细胞中的表达分布显示，M/T杂合患者（58.0 ± 14.3）高于M/M纯合患者（41.0 ± 16.5）（图S4），这表明Trop分子在肺部对病毒感染反应中具有协同作用。需要进一步研究以验证Trop-2在COVID-19患者AT2细胞增生中的潜在参与作用。

**COVID-19患者免疫细胞过度增殖T115 Trop-1/EpCAM**

固有免疫反应对于建立有效的早期抗SARS-CoV-2感染反应至关重要，适应性免疫细胞对于清除SARS-CoV-2感染也很重要。与先前的发现一致，在所有COVID-19患者的肺部均观察到炎症浸润，其主要组成包括肺泡腔内的巨噬细胞和间质中的淋巴细胞，后者导致三级淋巴滤泡的形成，作为局部超免疫反应的指标（图9A和9B）。

图9 COVID-19患者肺部的炎症细胞反应

(A) 肺泡内巨噬细胞中Trop-1/EpCAM表达的免疫染色（箭头）。比例尺，25 μm。（插入图）放大的巨噬细胞（底部箭头），Trop-1/EpCAM主要呈膜定位。

(B) ?：MT患者过度炎症肺中正在形成的三级淋巴滤泡。比例尺，50 μm。

(C) COVID-19患者巨噬细胞中Ki67反应性分布的箱须图，按Trop-1/EpCAM变异体分类。Met/Met（红色），Thr/Met（绿色）。对照患者（未受COVID-19影响）中相应的分布以蓝色显示。巨噬细胞增殖中位数为：Met/Met患者7%，Thr/Met病例17.5%。箱形上下边界分别为第75百分位和第25百分位。横杠：置信区间。水平实线：中位值。圆点：个体值。COVID-19患者中Ki67+巨噬细胞的中位比例显著高于对照组（Mann-Whitney U检验；U值 = 0，p = 0.000008）。与M/M纯合病例相比，M/T杂合患者中Ki67+巨噬细胞的中位比例显著更高（U值 = 0.5，MW p = 0.008）。这些图片是分析样本的代表性图像。

患者样本的全切片（表S1A和S2B）进行了系统检查。巨噬细胞中Trop-1/EpCAM的表达按STAR Methods中描述的方法进行显色，并使用20×物镜对每张切片上的十个随机显微视野点进行定量分析。20×物镜显微视野对应于主轴为1 mm的表面。统计分析按STAR Methods中描述的方法进行。

与Trop-1/EpCAM的免疫调节作用一致，在检测到透明膜的79%的肺部中，肺泡内巨噬细胞显示Trop-1/EpCAM高表达（图9A），这表明Trop-1/EpCAM在炎症细胞中具有激活作用，并且异常上皮修复与巨噬细胞募集和过度增殖相关，进而与组织过度炎症相关。

通过Ki67表达免疫组织化学分析了M/M与M/T COVID-19患者中巨噬细胞的增殖率。COVID-19患者中Ki67+巨噬细胞的中位比例显著高于对照组（Mann-Whitney U检验；U值 = 0，p = 0.000008）。在表达病例中，M/T患者中Ki67+巨噬细胞的中位比例显著高于M/M病例（U值 = 0.5，MW p = 0.008）（图9B）。因此，Trop-1/EpCAM T115患者显示免疫细胞增殖显著增加，这与T115 Trop-1/EpCAM具有促炎、驱动增殖的作用一致。

由于Trop-1/EpCAM可调节E-cadherin的细胞间黏附功能和β-catenin的信号传导，对FFPE肺组织进行了E-cadherin和β-catenin表达的免疫组织化学分析。在20例中的2例内皮细胞中发现膜间E-cadherin表达，呈局灶性表达；在20例中的10例纤毛柱状细胞中（2例局灶性表达，8例弥漫性表达）；以及在20例中的11例肺泡上皮细胞中（7例呈弥漫性染色）。β-catenin表达的局灶性模式很少被检测到（20例中的2例内皮细胞；20例中的5例纤毛柱状细胞）。在肺泡上皮细胞中，β-catenin免疫染色基本上检测不到（表S1）。

**过度增殖的肺泡修复产生氧扩散障碍**

COVID-19引起的肺损伤包括透明膜、鳞状细胞增生和化生，以及毛细血管微血栓。我们的发现表明，表达T115 Trop-1/EpCAM的严重COVID-19病理患者的肺部广泛发生组织修复诱导的架构重排（图10）。正常的肺泡衬里细胞经过进化优化，通过薄的上皮层与肺毛细血管密切接触，提供大面积的气体交换表面。因此，我们分析了肺部病理变化对COVID-19患者氧扩散速率的影响。

图10 肺损伤和修复后的氧扩散

示意图概述了急性SARS-CoV-2感染后肺部的主要损伤和修复机制。（左上）透明膜的形成。（右侧）AT2肺泡细胞增生。Trop-1/EpCAM的免疫组织化学染色。?：1–5 μm上皮厚度；??：6–15 μm；???：16–26 μm；????：≥27 μm。（左下）正常条件下及病理变化下肺泡半径和总表面积模型。蓝色箭头表示疾病进展路径。比例尺：左上图片为50 μm，右侧图片为20 μm。

气体通过介质扩散遵循Fick定律。氧通过肺泡膜的扩散由肺泡（100 mmHg）与毛细血管（40 mmHg）之间的压力梯度Δp驱动。扩散速率则由氧的溶解度、渗透性和扩散系数决定（STAR Methods）。

由于氧在脂质中的溶解度约为水中的25倍，氧扩散的限制因素是跨水层的扩散速率。为了与红细胞中的血红蛋白结合，氧必须穿越肺泡肺泡细胞、毛细血管壁、血浆（相当于1 μm厚的不搅拌水层）和红细胞（平均厚度1.6 μm）。这些过程导致平均氧扩散速率为0.2 cm/s。在最大运动时，红细胞在肺毛细血管中的通过时间为0.25 s。分子动力学模拟表明，0.2 cm/s的氧扩散速率允许在剧烈运动下红细胞血红蛋白达到≤95%的平衡。因此，急性SARS-CoV-2感染过程中发生的病理变化，通过DAD、间质水肿、毛细血管微血栓，可能影响氧扩散。然而，随后的损伤修复可能是对肺功能产生负面影响的最严重因素，通过形成透明膜和由过度增殖的异型增生/化生上皮细胞进行的异常肺泡修复。

如前所述，在75%的COVID-19病例中检测到透明膜。在代表性患者病例中系统地测量了透明膜的厚度（n = 154）。平均厚度为7.5 ± 0.3 μm（均值 ± SEM）（表S2）。由于正常肺中I型肺泡细胞平均厚度为0.36 μm，预计这将导致含有透明膜区域的氧流量减少≥20倍。

在70%的COVID-19病例中检测到AT2肺泡细胞增生。我们系统地评估了替代病毒损伤的AT1肺泡细胞的AT2增殖上皮的厚度。结果显示细胞单层厚度增加到1.5 μm，表明氧扩散路径延长了约5倍。在后续阶段，上皮细胞生长为多层聚集体，肺泡衬里膜厚度增加到31 μm。这代表了氧扩散路径延长了约100倍，相应地减少了受影响肺泡中的氧流量（图10）。这些发现表明，COVID-19患者损伤后修复可导致受影响区域气体交换能力的大幅降低。

肺泡表面积也严重减少。球体表面积"A"为A = 4πr2，其中r为球体半径。肺泡平均半径约为100 μm，平均肺泡表面积为125,600 μm2（图10）。根据COVID-19患者的测量，当肺损伤/肺损伤修复产生多层上皮细胞和透明膜时，肺泡腔半径可降低至近一半（≈61.5 μm半径）（图10）。这将导致气体交换面积相应严重减少。

**讨论**

SARS-CoV-2肺部感染引发急性病变和急性后反应，严重损害氧交换。然而，其潜在的分子过程知之甚少。我们的发现表明，p.T115 TROP1/EPCAM与严重COVID-19病理相关。然而，关于这一多态性的信息极少，且M115T在癌症序列数据库中普遍被错误分类为突变。在本文中，我们证明T115 Trop-1/EpCAM是细胞增殖的独特诱导因子。这在TROP1/EPCAM+/?胚胎干细胞和L细胞纤维肉瘤转染体中得到了验证。通过CRISPR-Cas9在人Trop-1/EpCAM依赖性结肠癌细胞中敲除TROP1/EPCAM基因，随后用T115等位基因与M115 Trop-1/EpCAM等位基因进行转基因，正式确认了T115 Trop-1/EpCAM的过度增殖能力。

这些发现为我们探索COVID-19病理的基本决定因素提供了线索。对已故COVID-19患者的肺部标本分析了Trop-1/EpCAM表达的患病率以及与T115等位基因相关的病理参数。免疫组织化学分析显示，几乎所有创伤愈合的AT2肺泡细胞中Trop-1/EpCAM呈细胞膜表达。Ki67+增殖上皮细胞的比例与Thr115患者表型呈现紧密相关，支持了上皮过度增殖作为病毒感染应答的病理机制与疾病严重程度相关。

在所有出现鳞状化生的病例、三分之二伴有毛细血管微血栓的病例以及五分之四伴有透明膜形成的病例中均发现Trop-1/EpCAM表达，表明上皮细胞过度增殖与其他与疾病严重程度相关的病变具有叠加影响。在损伤修复的早期阶段即可发现Trop-1/EpCAM高表达，例如在替代病毒损伤AT1细胞的AT2肺泡细胞单层中。在损伤修复的后期阶段，肺泡空间出现多层增殖的Trop-1/EpCAM高表达上皮细胞衬里。

肺中氧扩散遵循Fick定律，并取决于氧的溶解度、渗透性和扩散系数。氧在脂质中的溶解度约为水中的25倍。因此，氧扩散的限制因素是跨水层的扩散速率。上皮细胞进行的肺泡修复似乎对氧扩散构成了严重限制。替代正常I型肺泡细胞的异型增生/化生AT2增殖细胞使细胞单层厚度从0.36 μm增加到1.5 μm，氧扩散路径延长了5倍。衬里肺泡空间的上皮细胞膜厚度随后在多层区域增加到≥30 μm，氧扩散路径延长了约100倍，相应地减少了受影响肺泡中的氧流量。当过度增殖修复产生多层上皮细胞时，肺泡表面积也似乎严重减少。在75%的COVID-19病例中检测到透明膜形成。由于透明膜的平均厚度为7.5 μm，预计透明膜的存在将导致氧流量在正常肺基础上进一步减少≥20倍。

此外，Trop-1/EpCAM可通过增加炎症细胞的迁移能力和耐受性发挥免疫调节作用，诱导Trop-1/EpCAM表达在肺泡内巨噬细胞中被揭示，并与肺部间质中三级淋巴滤泡的形成相关，符合局部过度活跃免疫反应的特征。因此，我们的发现支持Trop-1/EpCAM与导致DAD、间质水肿、毛细血管微血栓和透明膜形成的过度炎症过程的关联，进一步加剧了氧交换速率降低的严重程度。

最近的发现确定了成纤维细胞介导的病理机制在肺部损伤修复中的触发作用。在严重损伤后，肺泡成纤维细胞促进气道干细胞与肺泡干细胞之间的竞争。作为结果，在创伤修复期间，异型的气道来源Krt5+基底上皮细胞侵入肺泡。Notch激活抑制了受损肺泡中的Wnt/成纤维细胞生长因子（FGF），随后建立了一个无法解决的微环境，稳定维持异型肺泡表型。

修复后的病变通常无法完全恢复至生理状态，从而阻碍了重症患者正常气体透过性的恢复。T115 Trop-1/EpCAM多态性被证实为疾病严重程度的独立危险因素，在考虑竞争风险调整后依然如此。换言之，在考虑了其他风险因素（如年龄、性别和既有病理状况）的人群中，T115 Trop-1/EpCAM患者的异常高增殖性修复独立地增加了疾病风险，并通过降低受影响肺泡中的氧气扩散速率，与严重临床结局相关联。这些发现表明，T115 Trop-1/EpCAM的遗传决定因素可能有助于将患者分层为两组具有截然不同COVID-19疾病风险的二分类队列。针对T115病例，可探索以Trop-1/EpCAM为靶点的治疗性干预措施。研究局限性本研究的主要局限性在于患者亚组中COVID-19尸检样本数量较少。另一局限性在于缺乏对已分析COVID-19患者中氧气扩散速率降低的活体验证，因为该研究基于死亡患者和尸检样本。最后，还需要进一步工作来证明T115 Trop-1/EpCAM相关的促炎性变化在COVID-19疾病严重程度中发挥作用。资源可用性主要联系人更多信息以及资源和试剂的请求应发送至主要联系人Saverio Alberti（[e-mail]）并获得回复。材料可用性本研究产生的试剂将应要求提供，但如果存在商业化应用的潜在可能，我们可能需要付款和/或签署材料转让协议。数据和代码可用性•本文稿产生的所有数据均可在合理要求下从主要联系人处获取。GEN-COVID数据可通过意大利基因组网络（http://www.nig.cineca.it）中的COVID-19专用板块（http://nigdb.cineca.it）进行共享。此处引用的数据和样本存放在GEN-COVID患者登记库和GEN-COVID生物样本库中，可供查阅。•本文不报告原始代码。重新分析本文报告数据所需的任何额外信息均可应要求从通讯作者处获取。机构审查委员会声明所有入组受试者均为成人（年龄≥18岁），其本人或法律授权代表均提供了参与知情同意。标本由锡耶纳COVID-19生物样本库提供，该库是锡耶纳遗传生物样本库的一部分，BBMRI-IT成员、Telethon遗传生物样本库网络成员（项目编号GTB18001）及欧洲生物样本库成员。本研究是GEN-COVID多中心研究（https://sites.google.com/dbm.unisi.it/gen-covid）的一部分，该意大利多中心研究旨在确定COVID-19宿主的遗传基础。GEN-COVID多中心研究已获锡耶纳大学医院（Azienda ospedaliero-universitaria Senese）伦理审查委员会批准（第16917号，日期2020年3月16日）及所有参与招募医院的本地IRB批准。致谢本研究是GEN-COVID多中心研究（https://sites.google.com/dbm.unisi.it/gen-covid）的一部分，该意大利多中心研究旨在确定COVID-19宿主的遗传基础。标本由锡耶纳COVID-19生物样本库提供，该库是锡耶纳遗传生物样本库的一部分，BBMRI-IT成员、Telethon遗传生物样本库网络成员（项目编号GTB18001）、欧洲生物样本库及RD-Connect成员。本文所有作者均为欧洲罕见呼吸系统疾病参考网络ERN-LUNG成员。我们感谢CINECA联盟提供的计算资源和意大利基因组网络（NIG；http://www.nig.cineca.it）的支持。我们感谢私人捐赠者对A.R.（锡耶纳大学医学生物技术系）COVID-19宿主遗传学研究项目（第18号法令，2020年3月17日）提供的支持。我们还感谢COVID-19宿主遗传学倡议（https://www.COVID-19hg.org/）、意大利大学与科研部（MIUR）"卓越系部2018-2020"项目对意大利锡耶纳大学医学生物技术部的支持，以及"托斯卡纳COVID-19研究专项"项目对锡耶纳大学医院的资助。我们感谢意大利邮政银行（Intesa San Paolo）2020年慈善基金（项目编号N B/2020/0119）"识别意大利人群中决定COVID-19临床反应变异性的遗传基础"项目的资助。感谢意大利大学与科研部在"2020年FISR专项"COVID-19项目中对"针对Sars-CoV-2的RNA编辑：破解病毒以鉴定分子靶标并减轻感染-HACKTHECOV"项目的资助，以及意大利创价学会佛教研究所对"PAT-COVID：COVID-19宿主遗传学与发病机制"项目的资助（编号2020-2016_RIC_3）。感谢欧盟项目H2020-SC1-FA-DTS-2018-2020，题为"整合基因组学预测国际联盟（INTERVENE）"——资助协议号101016775。我们感谢圣保罗基金会（资助编号2489IT）、意大利大学与科研部（MIUR，意大利）（SCN_00558）、意大利发展部（MI01_00424）、阿布鲁佐大区（POR FESR 2007-2013：活动1.1.1 B线）以及意大利癌症研究协会的慷慨支持。我们同样感谢Maurizio Traglio夫人、Enzo Cattaneo和Alberto Borella的私人捐赠慷慨支持。图形摘要由BioRender制作，E.G.（2026）https://BioRender.com/p4mbqap。作者贡献C.F.、M.T.、R.L.和S.A.负责研究构思、设计及稿件撰写；M.B.负责数据获取及稿件撰写；S.M.、G.R.和B.T.负责数据分析与解释；G.B.负责统计分析；C.A.、V.G.、C.P.、A.M.和F.M.P.负责图像分析及数据获取与验证；L.B.负责实验肺功能评估；N.L.F.、E.G.、M.C.和L.P.负责mTrop1/mEpcam基因敲除、CRISPR-Cas9 TROP1/EPCAM基因失活及转基因实验，以及细胞培养和患者样本中的细胞增殖实验；N.f.I.G.和G.-C.M.S.联盟负责机器学习、训练、应用及外显子组测序数据分析；A.R.、S.A.、E.B.和C.B.负责研究监督、数据分析与解释及稿件重要智力内容的批判性修订。所有作者均已阅读并批准最终稿件。利益冲突声明作者声明不存在竞争利益。STAR★方法关键资源表试剂或资源 来源 标识符抗体 Anti-Trop-2 美国模式培养物收藏中心（ATCC） 货号HB-187，RRID:AB_2287132 Anti-Trop-2 Guerra等人 T16；RRID:CVCL_N336 Anti-CD44 Santa Cruz生物技术 货号sc-52536，RRID:AB_629078 Anti-Trop-1/EpCAM（流式细胞术） Klein等人 HT-29/26；RRID:CVCL_J690 Anti-Trop-1/EpCAM（免疫组化） Schon等人 MH99；RRID:CVCL_C5W0 Anti-Trop-1/EpCAM（Western blot） Life technologies 货号MA5-29246，RRID:AB_2785146 Anti-CD9 Santa Cruz生物技术 货号sc-59140，RRID:AB_1120766 Anti-Ki67（克隆30-9） Roche 货号05278384001，RRID:AB_2631262 Anti-E-cadherin（克隆36） Roche 货号05905290001，RRID:AB_3714871 Anti-β-catenin克隆14 Roche 货号760-4242，RRID:AB_2861317生物样本 肺尸检组织 锡耶纳COVID-19生物样本库 N/A 化学品、肽及重组蛋白 结晶紫 Sigma 货号C-3886 胰蛋白酶 Corning 货号25-054-CI Dulbecco改良鹰式培养基（DMEM） Euroclone 货号ECM0060 LES级胎牛血清（FCS） Gibco 货号16141079 白血病抑制因子（LIF） Merck 货号ESG1106 G418/遗传霉素 Life Technologies 货号10131035 更昔洛韦 Life Technologies 货号461710050 Lipofectamine 2000 Life Technologies 货号11668030 Lipofectamine LTX Life Technologies 货号15338030 关键商业试剂盒 Alexa Fluor 488羧酸琥珀酰亚胺酯 Life Technologies A20000 实验模型：细胞系 TBV-2小鼠胚胎干细胞（ES）细胞系 Guerra等人 RRID:CVCL_0063 L细胞（LTK-） Alberti等人；Alberti和Herzenberg RRID:CVCL_3392 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）——饲养层 Guerra等人 N/A HEK-293T细胞 Guerra等人 RRID:CVCL_0063 KM12SM细胞 Trerotola等人 RRID:CVCL_9548 实验模型：生物体/品系 小鼠：129S2/SvPas Guerra等人 N/A 寡核苷酸 TROP1/EPCAM_Crispr1.for 5′ caccgGGCAAAAGTCGCCGTCGCCG 3′ N/A TROP1/EPCAM_Crispr1.rev 5′ aaacCGGCGACGGCGACTTTTGCCc 3′ N/A TROP1/EPCAM_Crispr2.for 5′ caccgGTGCACCAACTGAAGTACAC 3′ N/A TROP1/EPCAM_Crispr2.rev 5′ aaacGTGTACTTCAGTTGGTGCACc 3′ N/A 其他 gnomAD v2.1.1 百德研究所，ICGC gnomad.broadinstitute.org/variant/2-47601106-T-C?dataset=gnomad_r2_1 LOVD v.3.0 Build 30b 全球变异共享LOVD数据库 databases.lovd.nl/shared/variants/EPCAM/unique ClinVar GRCh38 ClinVar www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ ICGC ARGO 国际癌症基因组联盟加速基因组肿瘤学研究（ICGC ARGO） https://platform.icgc-argo.org IntelliSite图像管理系统 Philips https://www.usa.philips.com/healthcare/product/FDP0912/intellisite-image-management-system GEN-COVID登记库和生物样本库 GEN-COVID联盟 https://sites.google.com/dbm.unisi.it/gen-covid DNA序列门户 cBioPortal癌症基因组学门户 www.cbioportal.org/datasets 意大利遗传变异数据库 意大利基因组网络（NIG） http://nig.cineca.it/ COVID-19宿主遗传学倡议数据库 COVID-19宿主遗传学倡议 https://www.COVID19hg.org/ 蛋白质数据库 RCSB PDB https://www.rcsb.org/ NovaSeq6000 DNA测序系统 Illumina RRID:SCR_016387 Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH系统 Roche RRID:SCR_025506 FACS Canto II细胞分析仪 BD生命科学 N/A FACS Aria III细胞分选仪 BD生命科学 N/A LSM-510 META共聚焦显微镜 Zeiss N/A LSM-800 AiryScan共聚焦显微镜 Zeiss N/A 病理扫描仪SG60 Philips N/A 重组DNA LentiCRISPRv2 Addgene RRID:Addgene_52961 pVSVG Addgene RRID:Addgene_8454 psPAX2 Addgene RRID:Addgene_12260 pΔEYFP/M-Mod 本文 N/A pΔEYFP/T-Mod 本文 N/A pFM54 Guerra等人 N/A C57Bl/6J小鼠细菌人工染色体（BAC）克隆RP24-315D17 GenBank AC163652.3） BACPAC资源中心（BPRC） https://bacpacresources.org/ 软件和算法 PyMOL Version 2.0 Schr?dinger, LLC. http://www.pymol.org Swiss PDB model Expasy https://swissmodel.expasy.org/ Fiji（ImageJ） NIH https://fiji.sc/ ZEN 2009 Light Edition Zeiss https://www.zeiss.com VistaVision ISS Inc. https://www.iss.com SimFCS 4 荧光动力学实验室 https://www.lfd.uci.edu/ Sigma Stat 4.0 Systat Software, Inc. https://systatsoftware.com SIFTSIFT https://sift.bii.a-star.edu.sg/ SISASISA https://www.quantitativeskills.com/sisa QuPath 开源生物图像分析软件 https://qupath.github.io/ GraphPad Prism7 GraphPad Software, Inc. https://www.graphpad.com SPSS Version 15.0 SPSS, Chicago, IL https://www.ibm.com/ 在新标签页中打开表格实验模型及研究参与者详情细胞培养L细胞和KM12SM细胞在含有10%（v/v）热灭活血清（FCS）的Dulbecco改良鹰式培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO2条件下培养。KM12SM和L细胞通过短串联重复序列（STR）分析进行鉴定（分别使用PowerPlex 16 System，Promega和IDEXX Bioresearch），并通过形态学和流式细胞术评估进一步验证。定期通过PCR分析和DAPI染色结合荧光显微镜确认无支原体污染。L和KM12SM转染体以1.5-3.0 ×103个细胞/孔接种于96孔板中（每个数据点五个平行孔）。在接种后的连续时间点通过结晶紫染色定量细胞生长，并以细胞参考曲线进行归一化（2倍系列稀释的细胞样本）。mTrop1敲除细胞mTrop1失活通过在129S2/SvPas小鼠的TBV-2小鼠ES细胞系中进行靶向基因替换获得，如Guerra等人所述。基因替换使用pFM54载体。该载体含有正选择（新霉素磷酸转移酶基因盒，neo）和负选择（单纯疱疹病毒胸苷激酶基因盒，TK），位于小鼠磷酸甘油酸激酶（mPgk1）启动子之下。ES细胞在含有15%（v/v）热灭活ES级FCS和1,000单位/毫升白血病抑制因子（LIF）（Esgro，Chemicon，Temecula，CA）的DMEM中培养。细胞在经丝裂霉素-C处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上培养。MEF由Lorenza Ronfani（意大利米兰San Raffaele医院条件性突变核心设施）惠赠。TBV-2克隆在200 μg/mL G418（Invitrogen）中选择。样本和伦理批准标本由锡耶纳COVID-19生物样本库提供，该库是锡耶纳遗传生物样本库的一部分，BBMRI-IT成员、Telethon遗传生物样本库网络成员（项目编号GTB18001）及欧洲生物样本库成员。本研究是GEN-COVID多中心研究（https://sites.google.com/dbm.unisi.it/gen-covid）的一部分，该意大利多中心研究旨在确定COVID-19宿主的遗传基础。GEN-COVID多中心研究已获锡耶纳大学医院（Azienda ospedaliero-universitaria Senese）内部审查委员会批准，第16917号，2020年3月16日，意大利锡耶纳，以及所有参与招募医院的本地IRB批准。方法细节命名法Trop-1最初在滋养层细胞中鉴定。,编码Trop-1的基因有多个别名，包括TROP1/EPCAM/TACSTD1/M4S1/GA733-2等。为清晰起见，本文仅使用最常用的名称，即Trop-1/EpCAM指代蛋白质，TROP1/EPCAM指代基因。Western blot从KM12SM细胞中获得的蛋白质裂解物是通过在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、1% Triton X-100及蛋白酶/磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中刮取细胞获得的。裂解物在非还原条件下通过SDS-PAGE分离，使用12.5%聚丙烯酰胺凝胶，然后转移至硝酸纤维素膜上。Western blot分析中，膜在室温下与一抗孵育3小时，与二抗孵育1小时。外显子组测序和统计分析全外显子组测序覆盖率至少为97%、深度为20x，使用NovaSeq6000系统（Illumina，圣地亚哥，CA，美国）按照先前描述的方法进行。一个由GEN-COVID联盟收集的2,446例SARS-CoV-2阳性受试者队列用于通过机器学习算法鉴定p.M115T Trop-1/EpCAM多态性与更差疾病预后的关联。,意大利人群中多态性/等位基因频率的细节见意大利基因组网络（NIG；http://nigdb.cineca.it/）数据库。癌症基因组序列数据分析M115T（M/T）变异体的流行率/功能分析使用关键资源表中列出的数据库进行。CRISPR-Cas9灭活TROP1/EPCAM基因表达我们使用CRISPR-Cas9通过两种不同的sgRNA靶向TROP1/EPCAM基因，灭活了内源表达的TROP1/EPCAM基因。敲除和转基因细胞的制备如下：L细胞/转染体——pΔEYFP空载体。L细胞/TROP1/EPCAM转染体——pΔEYFP/M-Mod。L细胞/TROP1/EPCAM转染体——pΔEYFP/T-Mod。KM12SM/TROP1/EPCAM Crispr1 #1。KM12SM/TROP1/EPCAM Crispr1 #1/转基因pΔEYFP/M-Mod。KM12SM/TROP1/EPCAM Crispr1 #1/转基因pΔEYFP空载体。KM12SM/TROP1/EPCAM Crispr2 #1。KM12SM/TROP1/EPCAM Crispr2 #1/转基因pΔEYFP/M-Mod预分选。KM12SM/TROP1/EPCAM Crispr2 #1/转基因pΔEYFP/T-Mod预分选。KM12SM/TROP1/EPCAM Crispr2 #1/转基因pΔEYFP空载体。两种设计的CRISPR-Cas9 sgRNA靶向人TROP1/EPCAM基因的特异性区域（外显子1和外显子2），按照指定程序亚克隆至慢病毒载体LentiCRISPRv2中。引入LentiCRISPRv2载体的引物序列见关键资源表。包装HEK-293细胞与重组LentiCRISPRv2及相应辅助质粒pVSVG和psPAX2共转染。重组病毒颗粒在48小时后从组织培养上清液中收集，用于感染KM12SM靶细胞。再经过48小时后，使用嘌呤霉素筛选细胞，获得稳定的敲除细胞。携带CRISPR-Cas9灭活的TROP1/EPCAM基因的细胞群体通过流式细胞术筛选，并确认表面无Trop-1/EpCAM表达。构建Thr115（T-mod）及Met115（M-mod）变体的Trop-1/EpCAM表达载体，使这两个变体错配并抵抗靶向内源TROP1/EPCAM的CRISPR1和CRISPR2复合体。

以下是用 Go 语言实现的红黑树（Red-Black Tree）算法，包含完整的插入、删除、搜索、后继和中序遍历功能：

```go
package main

import "fmt"

const (
Red = false
Black = true
)

type Node struct {
Key int
Value int
Left *Node
Right *Node
Parent *Node
Color bool
}

type RedBlackTree struct {
Root *Node
Nil *Node
}

func New() *RedBlackTree {
n := &Node{Color: Black}
return &RedBlackTree{Root: n, Nil: n}
}

func (t *RedBlackTree) Insert(key, value int) {
z := &Node{Key: key, Value: value, Color: Red, Left: t.Nil, Right: t.Nil}
y, x := t.Nil, t.Root
for x != t.Nil {
y = x
if z.Key < x.Key {
x = x.Left
} else {
x = x.Right
}
}
z.Parent = y
if y == t.Nil {
t.Root = z
} else if z.Key < y.Key {
y.Left = z
} else {
y.Right = z
}
t.insertFix(z)
}

func (t *RedBlackTree) insertFix(z *Node) {
for z.Parent.Color == Red {
pp := z.Parent.Parent
if z.Parent == pp.Left {
y := pp.Right
if y.Color == Red {
z.Parent.Color = Black
y.Color = Black
pp.Color = Red
z = pp
} else {
if z == z.Parent.Right {
z = z.Parent
t.leftRotate(z)
}
z.Parent.Color = Black
pp.Color = Red
t.rightRotate(pp)
}
} else {
y := pp.Left
if y.Color == Red {
z.Parent.Color = Black
y.Color = Black
pp.Color = Red
z = pp
} else {
if z == z.Parent.Left {
z = z.Parent
t.rightRotate(z)
}
z.Parent.Color = Black
pp.Color = Red
t.leftRotate(pp)
}
}
}
t.Root.Color = Black
}

func (t *RedBlackTree) leftRotate(x *Node) {
y := x.Right
x.Right = y.Left
if y.Left != t.Nil {
y.Left.Parent = x
}
y.Parent = x.Parent
if x.Parent == t.Nil {
t.Root = y
} else if x == x.Parent.Left {
x.Parent.Left = y
} else {
x.Parent.Right = y
}
y.Left = x
x.Parent = y
}

func (t *RedBlackTree) rightRotate(x *Node) {
y := x.Left
x.Left = y.Right
if y.Right != t.Nil {
y.Right.Parent = x
}
y.Parent = x.Parent
if x.Parent == t.Nil {
t.Root = y
} else if x == x.Parent.Right {
x.Parent.Right = y
} else {
x.Parent.Left = y
}
y.Right = x
x.Parent = y
}

func (t *RedBlackTree) Search(key int) *Node {
x := t.Root
for x != t.Nil && x.Key != key {
if key < x.Key {
x = x.Left
} else {
x = x.Right
}
}
return x
}

func (t *RedBlackTree) Min() *Node {
return t.min(t.Root)
}

func (t *RedBlackTree) Max() *Node {
x := t.Root
for x.Right != t.Nil {
x = x.Right
}
return x
}

func (t *RedBlackTree) min(x *Node) *Node {
for x.Left != t.Nil {
x = x.Left
}
return x
}

func (t *RedBlackTree) Successor(x *Node) *Node {
if x.Right != t.Nil {
return t.min(x.Right)
}
y := x.Parent
for y != t.Nil && x == y.Right {
x = y
y = y.Parent
}
return y
}

func (t *RedBlackTree) Delete(key int) {
z := t.Search(key)
if z == t.Nil {
return
}
t.delete(z)
}

func (t *RedBlackTree) delete(z *Node) {
y := z
yOrigColor := y.Color
var x *Node
if z.Left == t.Nil {
x = z.Right
t.transplant(z, z.Right)
} else if z.Right == t.Nil {
x = z.Left
t.transplant(z, z.Left)
} else {
y = t.min(z.Right)
yOrigColor = y.Color
x = y.Right
if y.Parent == z {
x.Parent = y
} else {
t.transplant(y, y.Right)
y.Right = z.Right
y.Right.Parent = y
}
t.transplant(z, y)
y.Left = z.Left
y.Left.Parent = y
y.Color = z.Color
}
if yOrigColor == Black {
t.deleteFix(x)
}
}

func (t *RedBlackTree) transplant(u, v *Node) {
if u.Parent == t.Nil {
t.Root = v
} else if u == u.Parent.Left {
u.Parent.Left = v
} else {
u.Parent.Right = v
}
if v != t.Nil {
v.Parent = u.Parent
}
}

func (t *RedBlackTree) deleteFix(x *Node) {
for x != t.Root && x.Color == Black {
if x == x.Parent.Left {
w := x.Parent.Right
if w.Color == Red {
w.Color = Black
x.Parent.Color = Red
t.leftRotate(x.Parent)
w = x.Parent.Right
}
if w.Left.Color == Black && w.Right.Color == Black {
w.Color = Red
x = x.Parent
} else {
if w.Right.Color == Black {
w.Left.Color = Black
w.Color = Red
t.rightRotate(w)
w = x.Parent.Right
}
w.Color = x.Parent.Color
x.Parent.Color = Black
w.Right.Color = Black
t.leftRotate(x.Parent)
x = t.Root
}
} else {
w := x.Parent.Left
if w.Color == Red {
w.Color = Black
x.Parent.Color = Red
t.rightRotate(x.Parent)
w = x.Parent.Left
}
if w.Right.Color == Black && w.Left.Color == Black {
w.Color = Red
x = x.Parent
} else {
if w.Left.Color == Black {
w.Right.Color = Black
w.Color = Red
t.leftRotate(w)
w = x.Parent.Left
}
w.Color = x.Parent.Color
x.Parent.Color = Black
w.Left.Color = Black
t.rightRotate(x.Parent)
x = t.Root
}
}
}
x.Color = Black
}

func (t *RedBlackTree) Inorder() {
t.inorder(t.Root)
}

func (t *RedBlackTree) inorder(x *Node) {
if x == t.Nil {
return
}
t.inorder(x.Left)
c := "R"
if x.Color == Black {
c = "B"
}
fmt.Printf(" %d:%d(%s)", x.Key, x.Value, c)
t.inorder(x.Right)
}

func main() {
tree := New()
for i, v := range []int{10, 20, 5, 30, 15, 25, 12, 18, 3, 8, 1, 35, 28, 22, 17} {
tree.Insert(v, i)
}
fmt.Println("中序遍历:")
tree.Inorder()
fmt.Println()

if n := tree.Search(15); n != tree.Nil {
c := "Red"
if n.Color == Black {
c = "Black"
}
fmt.Printf("搜索 15: value=%d, color=%s\n", n.Value, c)
}
fmt.Printf("最小值: %d\n", tree.Min().Key)
fmt.Printf("最大值: %d\n", tree.Max().Key)
fmt.Printf("15 的后继: %d\n", tree.Successor(tree.Search(15)).Key)

tree.Delete(15)
fmt.Println("\n删除 15 后:")
tree.Inorder()
fmt.Println()
}
```

编译运行：`go run rbt.go`

---

**核心设计：**
- **哨兵节点（Nil）**：统一处理边界情况，避免大量空指针判断
- **插入**：新节点初始为红色，通过 `insertFix` 的变色和旋转修复红黑性质（CLRS 六种情况）
- **删除**：根据子节点数量分三种情况处理，使用 `transplant` 替换节点，必要时调用 `deleteFix` 修复性质（CLRS 四种情况）
- **旋转**：`leftRotate` / `rightRotate` 同步更新父指针，保证树的结构性正确
- **所有操作时间复杂度**：O(log n)