在阿尔茨海默病中，Artemether通过PGC-1α介导的线粒体稳态机制，减轻了Aβ 1–42诱导的神经元细胞损伤

《Cellular Signalling》：Artemether alleviates Aβ 1–42-induced neuronal cell damage via PGC-1α-mediated mitochondrial homeostasis in Alzheimer's disease

　　

摘要

背景

阿尔茨海默病（AD）是全球最常见的神经退行性疾病，也是导致痴呆的主要原因。线粒体功能障碍是驱动神经元损伤和疾病进展的关键病理事件。因此，保护神经元细胞免受线粒体损伤已成为预防和治疗AD的关键治疗靶点。我们之前的研究表明，青蒿醚可以保护PC12细胞免受Aβ和缺氧葡萄糖引起的氧化应激损伤，但其背后的调控机制仍不清楚。因此，阐明青蒿醚在Aβ诱导的线粒体损伤中的作用和机制至关重要。

目的

评估青蒿醚对AD中Aβ诱导的线粒体功能障碍的保护作用及其潜在的分子机制。

方法

由于HT-22细胞系和原代海马神经元与海马神经元损伤具有更高的生理相关性，因此在本研究中使用了这些细胞。为了评估青蒿醚对神经元细胞线粒体损伤的保护作用，我们进行了Cell Counting Kit-8 assay来检测细胞存活率，并通过LDH释放测定来测量细胞毒性。此外，我们还评估了线粒体膜电位，量化了ATP含量，并检测了Aβ诱导的神经元细胞损伤中的ROS产生。另外，我们使用透射电子显微镜观察了线粒体的超微结构变化，并通过免疫荧光染色分析了线粒体蛋白的定位和形态。在AD小鼠模型中，我们进行了行为测试以评估认知功能，同时使用H&E染色、免疫组化和TUNEL染色来评估青蒿醚对AD相关病理特征的影响。此外，我们还通过Western blot分析来解析青蒿醚对Aβ诱导的线粒体损伤的保护作用所涉及的分子机制，重点研究了PGC1/ERRα/TFAM信号通路中关键蛋白的表达。

结果

青蒿醚可保护HT-22细胞免受Aβ_1–42引起的线粒体损伤，并改善AD小鼠模型中Aβ_1–42注射引起的记忆缺陷、线粒体功能障碍和神经炎症。从机制上讲，青蒿醚处理上调了PGC1蛋白的水平，这有助于维持线粒体稳态并进一步激活ERRα/TFAM信号通路。此外，抑制PGC1α会消除青蒿醚的保护作用。

结论

我们的研究结果表明，神经元线粒体功能障碍是AD发病机制的核心驱动因素，通过青蒿醚激活PGC1α/ERRα/TFAM轴为AD的预防和治疗提供了一种有效且可行的策略。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种以认知衰退和行为功能障碍为特征的常见神经退行性疾病。随着中国人口老龄化加剧，近年来与AD相关的死亡人数急剧增加。AD发病率的上升给家庭和全球医疗系统带来了沉重的社会经济负担[1]。尽管已经有一些临床批准的药物治疗AD，如美金刚和多奈哌齐，但这些药物的临床应用受到严重不良反应的限制。因此，迫切需要开发新的预防和治疗方法来应对AD[2]。

随着对AD发病机制的深入理解，神经元线粒体功能障碍已被认为是一个关键的病理现象，它推动了AD的发生和发展[3],[4]。更重要的是，线粒体是β-淀粉样蛋白积累的最初细胞亚区之一[5]。此外，线粒体功能障碍是AD患者大脑中最早出现且最显著的病理特征之一[6]。因此，针对神经元线粒体功能障碍是一种可行的治疗策略，有可能在疾病早期可逆阶段阻断其进展。

天然产物具有良好的安全性、多样的生物活性以及调节多种病理途径的独特能力。鉴于阿尔茨海默病的治疗选择有限，将天然产物开发成抗AD药物是一个极具前景的策略[7],[8]。越来越多的实验证据表明，某些天然产物具有调节AD相关病理的潜力。例如，芹菜和西兰花中的芦丁是一种黄酮类化合物，它可以抑制小胶质细胞激活和NF-κB信号通路，从而抑制神经炎症；同时，它还可以通过上调抗氧化酶来减少Aβ引起的氧化应激[9]。尿石素A是鞣花酸的肠道微生物群代谢产物，能够清除受损的线粒体并维持线粒体生物能量代谢，从而减轻AD对神经元的损伤[10]。在我们之前的研究中，我们还证明了青蒿醚在AD模型中具有强大的神经保护作用，包括改善学习和记忆功能、减少Aβ沉积以及减轻线粒体膜电位的下降。然而，青蒿醚调节线粒体功能的分子机制尚未明确，这仍然是将其用于临床应用的关键障碍。

鉴于青蒿醚介导的线粒体调节机制尚不明确，我们假设青蒿醚通过激活PGC1α相关的信号通路来提供对Aβ_1–42诱导的线粒体损伤的保护。我们的数据表明，青蒿醚在HT-22细胞和AD小鼠模型中通过触发PGC1α/ERRα/TFAM信号通路发挥线粒体保护作用。总体而言，这些发现证实了青蒿醚作为AD治疗候选物的潜力，并确定了PGC1α依赖的线粒体功能调节机制是其神经保护效果的可能机制。

章节片段

材料

分析级青蒿醚购自中国广州的大连美仑生物技术有限公司。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA和牛血清白蛋白购自中国上海的GIBCO公司。Aβ_1–42购自中国广州的Squirrel生物技术有限公司。Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自美国德克萨斯州休斯顿的APE×BIO SCIENCE公司。活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA）和线粒体膜电位相关试剂亦来自该公司。

原代海马神经元和HT-22细胞

HT-22细胞系在添加了10%胎牛血清、100?U/mL青霉素和100?μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养（GIBCOTM，美国加利福尼亚州圣地亚哥），培养条件为37°C和5%二氧化碳湿润环境。本研究使用的是传代3至8代的HT-22细胞。

原代海马神经元从C57BL/6小鼠出生后第1天（P1）的海马区在无菌条件下分离获得。具体操作如下：

青蒿醚保护HT-22细胞免受Aβ_1–42引起的线粒体功能障碍

为了评估Aβ_1–42对HT-22细胞的损伤作用，我们将细胞暴露于不同浓度的Aβ_1–42下24小时。随后的CCK-8细胞毒性测定显示，随着Aβ_1–42浓度的增加，细胞存活率显著下降。具体而言，4?μM Aβ_1–42使细胞存活率降低了40%（图1A），这促使我们选择这一浓度进行后续实验。我们发现，将HT-22细胞预先用不同浓度的青蒿醚处理2小时后

讨论

尽管对AD病理机制的研究不断深入，但AD药物的开发长期以来一直面临高失败率的挑战。长期以来，临床批准的药物治疗主要限于胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂，这些药物只能暂时缓解认知和行为症状，无法防止或逆转疾病进展。最近的研究表明，针对CCKBR Gq信号通路的合成偏爱激动剂具有

研究的局限性

虽然本研究主要验证了青蒿醚在AD中的线粒体保护作用，但它存在一些需要讨论的局限性。首先，我们的体外和体内实验系统中没有包含阳性对照药物，这限制了我们直接将候选化合物的治疗效果与已建立的参考药物进行比较的能力。因此，未来的研究需要加入阳性对照药物以进一步证实我们的观察结果。

CRediT作者贡献声明

蔡军：撰写——原始草稿，数据管理。罗静怡：数据管理。蔡永古：数据管理。徐越：数据管理。冉仁森：方法学设计。肖梅军：数据管理。叶巧园：撰写——审稿与编辑，资金获取。郑文华：监督，资金获取。李帅：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念设计。

机构审查委员会声明

所有涉及动物的实验程序均获得了澳门大学动物伦理委员会的批准（批准编号：UMAEC-018-2023，批准日期：2023年4月14日）。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82201620）和广东省医科大学博士后启动基金（项目编号：4SG25233G）广东省医科大学高层次人才科研启动基金（项目编号：4SG25005G）广东省中医药管理局基金（项目编号：20241161）广东省医学研究基金（项目编号：B2026156）的支持。

利益冲突声明

作者声明，在进行本研究过程中，不存在可能被视为利益冲突的商业或财务关系。

致谢

在准备本文时，作者使用了ChatGPT来提高语言表达的清晰度和可读性。使用该服务后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容负全部责任。

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隶属单位：中国广东医学大学东莞松山湖中央医院，东莞523326