酒精衍生的血清代谢物与直接乙醇暴露对小鼠窦前卵泡发育的不同影响

《Chemico-Biological Interactions》：Differential effects of alcohol-derived serum metabolites and direct ethanol exposure on mouse preantral follicle development

　　摘要：已知急性酒精暴露会损害女性的生殖功能；然而，目前尚不清楚酒精摄入后体内代谢物对卵泡发育的生物学效应与直接乙醇暴露的效应有何不同。因此，我们比较了急性酒精暴露小鼠血清与添加乙醇的培养基对小鼠窦前卵泡体外发育的影响，并探讨了这些效应的潜在机制。通过腹腔注射56%（体积/体积，v/v）的乙醇建立急性酒精暴露模型，随后收集血清。将窦前卵泡分别培养在三种系统中：胎儿牛血清（FBS）对照组、酒精暴露小鼠的血清以及添加等浓度乙醇的培养基中。评估了卵泡形态、类固醇激素分泌、基因表达、氧化应激、细胞凋亡、卵母细胞成熟以及随后的胚胎发育能力。急性酒精暴露改变了血清成分，其特征是乙基亚油酸水平升高和胆固醇水平降低。与FBS对照组相比，用酒精暴露小鼠血清培养的卵泡显示出窦腔扩大和 cumulus 组织膨胀，同时伴随着减数分裂在初级卵泡（GV）和中期 I 阶段（mid-MI）的延迟。酒精暴露血清增加了卵泡刺激素水平并上调了 forkhead box L2（Foxl2）的表达，从而促进了雌二醇的合成，同时抑制了卵泡发育过程中的孕酮分泌。相比之下，直接乙醇暴露通过降低线粒体膜电位和诱导细胞凋亡来损害卵泡发育。尽管酒精暴露小鼠血清中的氧化应激标志物水平升高，但卵母细胞通过增强抗氧化防御机制（包括过氧化物歧化酶1（Sod1）、谷胱甘肽过氧化物酶1（Gpx1）、线粒体内膜转运蛋白23（Tim23）和多核苷酸核苷酸转移酶1（Pnpt1）的表达）维持了正常的活性氧水平。值得注意的是，用酒精暴露血清培养的卵母细胞在体外受精后表现出更好的胚胎发育能力。因此，酒精暴露小鼠的血清对窦前卵泡发育的生物学效应不同于直接乙醇暴露。

引言：酒精是一种高度成瘾性的全球普遍存在的 recreational 饮料，属于世界上消费最广泛的成瘾性物质之一[1][2]。大约三分之一的全球人口饮用酒精[3]，其中15岁及以上的成年人中有23.48亿人（占全球人口的43%）是目前饮酒者[3]。酒精消费习惯存在明显的性别差异，男性饮酒率（53.6%）几乎是女性的两倍（32.3%）[4]。然而，随着社会生活方式的变化，性别间的饮酒差距逐渐缩小，尤其是在年轻人群中[5][6]。酒精消费的普遍性已成为一个主要的全球公共卫生问题，对健康构成重大风险。过量饮酒会引发人体内的多种不良反应，导致肝脏和大脑等器官的不可逆损伤，并严重干扰生殖系统的正常功能[7][8][9][10]。由于男女在体重和水分组成上的差异，女性在生理上比男性更容易受到酒精的毒性影响[11][12]。近年来女性饮酒者比例的增加引发了人们对酒精相关女性生殖风险的广泛关注[13]。过量饮酒会扰乱女性的月经周期和内源性雌激素分泌[14][15]。此外，怀孕期间的酒精暴露可能会损害胎儿发育，甚至导致胎儿酒精谱系障碍[16][17][18]。因此，探索酒精对女性生殖系统影响的潜在机制对于酒精引起的生殖功能障碍的临床治疗和保护女性生殖健康至关重要。酒精主要通过小肠吸收，随后输送到肝脏进行代谢分解[19]。在肝脏中，酒精通过乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化系统转化为乙醛，乙醛进一步转化为乙酸和醋酸完成代谢循环[20]。酒精代谢过程中会产生大量活性氧（ROS）[21]。过量的 ROS 可能引发脂质过氧化，破坏身体的氧化平衡，导致持续的氧化应激[21]。酒精及其代谢物可以进入血液循环并扩散到全身各组织和器官。女性生殖系统特别容易受到毒性物质的损害，先前已有研究表明血液中的酒精代谢物会对生殖系统造成广泛的影响[22][23][24]。卵泡的生长和成熟是女性生殖能力的关键决定因素，正常的卵泡发生过程对维持生育能力至关重要[25][26]。作为卵巢卵泡的早期发育阶段，窦前卵泡对外源性毒性刺激非常敏感，使其成为研究环境或化学因素引起的生殖毒性的理想模型。窦前卵泡的体外培养系统能够在受控的实验条件下有效模拟卵巢微环境，从而支持卵泡的生长、成熟和排卵。这一成熟的培养平台不仅为生育力保存和辅助生殖技术的优化提供了重要的技术支持，还可以作为生殖生物学研究的宝贵实验模型。许多研究利用体外卵泡培养技术来研究不同处理条件下的卵泡发育动态和功能变化[27][28][29]。最近在卵巢生物学方面的进展表明，卵泡发育和萎缩是受到氧化应激、细胞凋亡、自噬和内分泌信号相互作用密切调控的过程[30]。颗粒层细胞通过为卵母细胞提供代谢支持、调节类固醇激素合成以及介导卵泡生长和成熟所需的内分泌反应，在维持卵泡稳态中起着不可或缺的作用[31]。越来越多的证据表明，生理性自噬对于维持原始卵泡池和正常的卵泡发生是必要的，而失调的自噬、氧化应激引起的线粒体功能障碍和脱氧核糖核酸（DNA）损伤会促进颗粒层细胞凋亡、干扰类固醇生成并加速卵泡萎缩[32][33][34]。这些病理事件通过多种信号通路（包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、腺苷单磷酸（AMP）激活的蛋白激酶和丝裂原激活的蛋白激酶通路）协调进行，最终损害卵巢内分泌功能和女性生育能力[35]。因此，了解颗粒层细胞的病理反应对于阐明卵巢功能障碍和生殖毒性的机制至关重要。先前的超微结构分析研究表明，卵泡萎缩期间颗粒层细胞表面形态发生显著变化，包括细胞收缩、细胞间接触中断和表面突起的丢失，这突显了颗粒层细胞形态作为卵泡健康和退化指标的重要性[36]。尽管体外窦前卵泡培养系统应用广泛，但该实验系统存在局限性。不成熟的培养技术可能导致卵泡损伤和颗粒层细胞凋亡，从而限制了实验结果的稳定性[37]。体外培养微环境无法完全复制生物体的复杂体内环境[38]。此外，现有关于酒精与卵泡发育相关性的研究明显存在偏向性。大多数相关研究直接将乙醇添加到培养基中以模拟酒精暴露，而忽略了体内酒精代谢后产生的血清酒精代谢物的生物学效应。因此，直接酒精刺激和血清代谢物刺激对卵泡发育的影响差异仍不清楚，限制了对酒精引起的生殖毒性机制的全面理解。因此，本研究建立了急性酒精暴露小鼠模型以获取含有酒精代谢物的血清。为了阐明酒精代谢物和直接乙醇暴露对窦前卵泡体外发育的不同影响，设计了三种实验培养系统：胎儿牛血清（FBS）对照组、添加酒精暴露小鼠血清的培养基组以及直接乙醇处理组。本研究旨在探讨酒精暴露小鼠血清对窦前卵泡体外发育的影响，并区分酒精代谢物与直接乙醇暴露的生物学效应。具体目标包括：分析急性酒精摄入后血清成分的变化；评估酒精暴露血清对卵泡生长、激素分泌和基因表达的影响；评估卵母细胞的氧化应激、线粒体功能和减数分裂能力；以及检查体外受精后的早期胚胎发育情况。通过对从卵泡发生到早期胚胎发生过程的生殖后果进行全面评估，本研究为酒精引起的女性生殖毒性机制提供了新的见解，并可能有助于制定保护女性生殖健康的策略。

部分章节内容：
化学品：除非另有说明，所有化学试剂和检测套件均来自Sigma-Aldrich（中国上海）。
实验动物：成年雌性KM小鼠（28–35克）和10天大的雌性KM幼崽来自西安交通大学实验动物中心。它们被饲养在温度为24°C ± 2°C、湿度为50% ± 10%的环境中，光照和黑暗周期为12小时，可自由获取标准饲料和无菌水。