多种肉类基质中肌肽和鹅肌肽的优化提取及验证HPLC-DAD定量分析

《Methods and Protocols》：Quantification of Carnosine and Anserine in Diverse Meat Matrices via Optimized Extraction and Validated HPLC-DAD

　　

肌肽和鹅肌肽是含有组氨酸的生物活性二肽，因其抗氧化、pH缓冲和神经保护功能而闻名。然而，由于二者结构高度相似以及复杂基质诱导的分析干扰，其精确定量常受到损害。本研究开发并验证了一种优化的简化提取方案，耦合高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD），用于在多种肉类基质中同时测定这两种二肽，包括泰国本土乌骨鸡（Nin-Kaset）、商品肉鸡、猪肉、牛肉和水牛肉。通过调节溶液pH系统优化了提取效率。在优化条件下，验证方法展示了优异的线性范围（1–200 μg mL^?1，r² ≥ 0.9990），肌肽和鹅肌肽的检测限/定量限（LOD/LOQ）分别为0.0093/0.0283 mg g^?1和0.0139/0.0420 mg g^?1。方法准确度通过满意的回收率（96.64%–102.68%）得到确认，重复性（RSD）为0.70%–14.18%。应用于实际基质揭示了不同的二肽分布特征。猪肉含有最高水平的肌肽（3.59 ± 0.19 mg g^?1），而白羽Nin-Kaset乌骨鸡表现出最高水平的鹅肌肽（6.77 ± 0.40 mg g^?1）。总体而言，该验证框架为常规二肽分布分析提供了一种快速、经济高效且稳健的方法，支持未来在食品真实性鉴别、营养评估和功能性食品开发中的应用。

**论文解读：基于优化提取与验证HPLC-DAD的多种肉类基质中肌肽和鹅肌肽定量分析**

**一、研究背景与问题阐述**

过去几十年间，全球肉类消费格局经历了显著变化，人口增长、城市化进程及饮食偏好转变共同推动了肉制品需求的持续扩张。尤其值得注意的是，禽肉生产与消费增速远超红肉，这主要归因于其高粗蛋白、低肌内脂肪的理想营养特征。数据显示，鸡肉在全球肉类消费中的占比已从1990年的19.21%攀升至2023年的39.55%，跃居全球消费量最大的肉类品种。与此同时，消费者对膳食与健康关联的认知不断提升，促使人们积极寻求不仅提供基础营养、还富含生物活性化合物的功能性食品。鸡肉中含有肌肽（β-丙氨酰-L-组氨酸）和鹅肌肽（β-丙氨酰-3-甲基-L-组氨酸）等含组氨酸二肽，二者以抗氧化功能著称，并展现出包括抗炎、免疫调节、抗衰老、抗糖尿病、抗癌及认知功能改善等多种生理活性。然而，尽管这两种二肽的治疗潜力已被广泛研究，其在肉类中的精确定量却面临显著挑战。二者的高极性和结构相似性常干扰色谱分离，导致定量分辨率不足；已有研究报道了因分析物极性相似而造成的肌肽和鹅肌肽分离不完全问题。现有分析技术如液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、毛细管电泳（CE）和伏安法等虽可应用，但普遍存在仪器昂贵、需专业操作人员和分析时间长等局限。因此，开发一种简化、快速、低成本且有效的样品前处理方案，结合无需衍生化的高效液相色谱定量方法，对于肉类中这两种生物活性二肽的常规检测具有重要意义。此外，泰国本土乌骨鸡Nin-Kaset由农业大学热带动物遗传特殊研究单元（TAGU）培育，被认为具有较高水平的功能性化合物；系统比较其与商业品种及红肉中二肽分布特征，将为其功能性食品定位提供科学依据。

**二、研究内容与主要结论**

本研究旨在开发并验证一种简化的快速样品制备方案，耦合无需衍生化的高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）方法，在环境温度下同时测定多种肉类基质中的肌肽和鹅肌肽。研究系统优化了提取效率，通过在温和条件下调节溶液pH和酸性溶剂与样品比例来最小化基质干扰。验证后的工作流程成功应用于猪肉、牛肉、水牛肉、商品肉鸡以及本土Nin-Kaset乌骨鸡等多种商业和本土肉类基质的二肽分布图谱测绘。研究结果表明，该验证框架提供了一种快速、经济高效且稳健的常规二肽分析方法，为食品真实性鉴别、营养评估和功能性食品开发提供了有力支撑。值得注意的是，Nin-Kaset乌骨鸡被发现具有显著高于商品肉鸡的肌肽（约为2.0倍）和鹅肌肽（约为1.5倍）水平，凸显了其作为高价值功能性食品的潜力。

**三、关键技术与方法**

研究人员采用了多项核心技术手段。样品来源方面，鸡胸肉、猪肉和牛肉样品购自泰国曼谷超市的三种不同商业品牌，白羽和黑羽泰国本土鸡胸肉及水牛肉由泰国农业大学热带动物遗传特殊研究单元（TAGU）提供，共65个肉样，每个进行五次定量重复。样品经?20 °C冷冻、绞碎后进行后续处理。提取方案采用0.01 M盐酸结合涡旋、超声和离心处理，随后以乙腈进行蛋白沉淀。色谱分析采用Asahipak NH2P-50 4E离子交换柱（4.6 × 250 mm，5 μm），配备同材质保护柱，使用Shimadzu LC-20A HPLC系统连接光电二极管阵列紫外检测器，在环境温度下操作；流动相为乙腈和50 mM NaH₂PO₄的45:55（v/v）混合液，流速1.0 mL/min，进样量60 μL，检测波长210 nm，分析时间13分钟内完成。方法验证参照AOAC指南，涵盖线性、灵敏度、准确度和精密度评估，并采用两因素方差分析（ANOVA）结合Duncan多重检验进行统计分析。

**四、主要研究结果**

**4.1 简化提取方案的优化**

肌肽（H₃Car）及其甲基化衍生物鹅肌肽（H₃Ans）具有三个可电离官能团：咪唑环、氨基和羧基，因此其质子化状态、整体分子极性和色谱行为高度依赖pH值。研究人员将300 μg mL^?1的肌肽和鹅肌肽混合标准品分别配制于乙腈-磷酸盐缓冲液混合物（3:1，v/v）和超纯水中进行考察。结果显示，在乙腈-磷酸盐缓冲液（3:1 v/v）中，混合标准液平衡pH为5.20，两种分析物主要以单一正电荷质子化形态（H₂Ans⁺和H₂Car⁺）存在，产生明确的单峰，鹅肌肽和肌肽的保留时间分别为7.73和10.83分钟。相比之下，超纯水稀释导致平衡pH升至6.06，接近鹅肌肽（7.04）和肌肽（6.79）的第二解离常数（pKa₂），两种分析物发生部分去质子化，多种离子形态共存，导致与固定相的相互作用不一致，色谱上表现为两种分析物的双峰现象。该发现强调，在分析复杂肉类基质时，严格控制样品提取和流动相制备过程中的pH至关重要。

**4.2 方法验证**

校准曲线在1–200 μg mL^?1浓度范围内构建，两种分析物均表现出优异的线性，相关系数（r²）≥ 0.9990。基于信噪比（S/N）方法计算的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为：肌肽0.0093/0.0283 mg g^?1，鹅肌肽0.0139/0.0420 mg g^?1，与HILIC、UHPLC-QqQ-MS/MS和HPLC-MS等先前报道的方法灵敏度相当。通过加标回收实验评估方法准确度，在三个加标水平（10、50和200 μg mL^?1）下，两种二肽的平均回收率为96.64%–102.68%，证明优化后的样品制备方案有效减少了基质诱导的干扰。重复性以相对标准偏差（RSD）表示，范围为0.70%–14.18%，即使最低加标水平的RSD略高，仍完全符合AOAC指南对食品基质痕量分析的可接受限值。

**4.3 多种肉类基质中肌肽和鹅肌肽的定量**

将开发并验证的方法成功应用于本土Nin-Kaset乌骨鸡、商品肉鸡、猪肉、牛肉和水牛肉等多种基质的内源性二肽含量测定。结果显示两种二肽的分布呈现明显的物种特异性特征。禽肉样品中鹅肌肽为主要二肽，含量范围为2.60–6.77 mg g^?1，而肌肽含量较低，为1.15–2.28 mg g^?1。相反，红肉样品（猪肉、牛肉和水牛肉）的鹅肌肽含量显著较低（0.10–0.50 mg g^?1），但肌肽含量明显更高（2.40–3.59 mg g^?1）。这种禽肉以鹅肌肽为主、红肉以肌肽为主的二肽谱倒置现象具有统计学显著性（p < 0.001）。在方法实施过程中，采用0.01 M HCl提取脂质并通过CH₃CN进行蛋白沉淀有效缓解了白肉和红肉中不同脂质及蛋白质含量带来的基质效应。

**4.4 泰国本土鸡（Nin-Kaset）与商业品种的比较**

白羽泰国本土鸡胸肉表现出显著高于商品肉鸡的鹅肌肽浓度（p < 0.001）；猪肉中肌肽浓度最高（p < 0.001），而黑羽泰国本土鸡胸肉的肌肽水平与牛肉相当。这种物种间二肽分布的代谢差异在生化层面受肌肽N-甲基转移酶（由组胺N-甲基转移酶样（HNMT-like）基因编码）活性的调控。该酶在禽类中催化肌肽甲基化生成鹅肌肽，但该基因在哺乳动物基因组中进化上缺失，因此鹅肌肽在禽肉中占主导而肌肽在红肉中占优。本土Nin-Kaset乌骨鸡表现出显著的营养优势，其鹅肌肽和肌肽浓度分别约为商品肉鸡的1.5倍和2.0倍，这些升高的二肽浓度可能受品种特异性生理特征调节，包括骨骼肌纤维组成差异、增强的氧化代谢、更高的抗氧化需求以及较慢的生长相关代谢成熟度。

**五、讨论与结论总结**

在讨论部分，研究人员强调了pH控制对保证色谱分离质量和定量可靠性的关键作用，以及所开发方法相对于依赖衍生化或离子对试剂的传统方法在简化操作、降低成本和环境温度下运行方面的优势。研究结论部分指出，本研究展示了一种快速、简便、无需衍生化的HPLC-DAD方法，可在多种肉类基质中同时定量肌肽和鹅肌肽。研究人员使用低浓度酸性溶液简化了提取方法，并通过0.01 M氢氧化钾溶液调节磷酸盐缓冲液稳定了肌肽和鹅肌肽的结构。在pH 5.0下配合3:1乙腈-磷酸盐缓冲液比例的策略性pKa调控被证明对控制两种二肽的质子化状态至关重要，有效消除了化学形态异质性，确保在环境温度下无需柱前衍生化即可获得优异的色谱分辨率和峰对称性。严格的分析验证确认了该方法用于常规分析的可靠性和适用性：优异线性（r² ≥ 0.9990）、满意灵敏度（LOD：0.0093–0.0139 mg g^?1；LOQ：0.0283–0.0420 mg g^?1）、可接受回收率（96.64%–102.68%）和稳健重复性（RSD ≤ 14.18%）。该方法在多个物种中的应用成功绘制了物种特异性二肽分布图谱，证实鹅肌肽在禽肉中占主导地位（2.60–6.77 mg g^?1），而肌肽是红肉中的主要二肽（2.40–3.59 mg g^?1）。本土Nin-Kaset乌骨鸡被确定为优质功能性食品来源，其肌肽和鹅肌肽水平分别约为商品肉鸡的2.0倍和1.5倍。研究工作的验证以禽肉作为肌肉基质分析的概念验证，样品制备步骤成功减轻了脂质和蛋白质干扰。未来工作旨在扩展到多实验室验证，涵盖更广泛的红肉类别如猪肉和牛肉。该研究不仅确立了Nin-Kaset乌骨鸡作为生物活性二肽优越来源的地位，还为常规食品分析提供了可持续且高效的工具，符合食品工业大规模营养评估的实际需求。