基于CASS条形码的FISH可解码空间分辨突触连接组图谱绘制

《Cell Reports Methods》：Spatially resolved synaptic connectome mapping with FISH-decodable CASS barcodes

　　

绘制神经元连接图谱对于理解神经环路的结构与功能至关重要。尽管利用条形码狂犬病毒的高通量、低成本方法提供了有价值的细胞水平见解，但其受限于条形码测序的空间分辨率。为提供兼容荧光原位杂交（FISH）的空间条形码读取替代方案，研究人员开发了CASS（combination of artificial short sequences，人工短序列组合）条形码，一种错误鲁棒且可进行原位杂交检测的工具有。通过将CASS条形码与狂犬病毒单突触追踪结合，研究人员实现了基于FISH条形码解码的原位连接组图谱绘制。利用该方法，研究人员在3只小鼠初级视觉皮层中识别出1,532对具有空间精度的突触连接对，证明了其效率与可扩展性。该方法提供了一种基于FISH、带空间背景的神经元连接识别途径，并可能促进未来连接图谱与分子谱分析的整合，从而推进对神经环路的理解。

研究背景与立项依据

连接组学旨在绘制神经接线图，但实现具空间背景的细胞分辨率连接图谱仍是一大挑战。基于三维重建的方法虽推进了人们对解剖投射的理解，但提供的是结构邻近性而非直接突触证据。条形码狂犬病毒单突触追踪通过标记直接相连神经元克服了这一点，但当读取依赖组织解离后测序时，每个标记细胞的空间坐标丢失，使连接数据与解剖环路架构脱钩。为解决此问题，研究人员开发了FISH可检测条形码系统，在保留解剖信息的同时实现带完整位置与连接读取的突触图谱绘制。

研究概述与结论

研究人员提出CASS条形码（由人工短寡核苷酸序列组合生成的条形码），作为FISH兼容的空间连接组分析策略。与传统DNA条形码不同，CASS以20 bp人工短序列为基本单元，经八循环多重FISH（fluorescent in situ hybridization，荧光原位杂交）解码，可在标准共聚焦显微镜下实现原位条形码读取，避免组织解离带来的空间信息丧失。研究人员将CASS条形码植入SAD株狂犬病毒（rabies virus，RV）基因组，对Neurod6-cre小鼠初级视觉皮层（V1）兴奋性神经元进行单突触逆向追踪，在3只小鼠中成功解码89.3%的BFP⁺细胞，获得213个起始细胞（starter cell）与1,532个输入细胞（input cell）的配对连接及全细胞空间坐标。该方法以较低通量换取空间保真，在《Cell Reports Methods》发表，为介观连接组学提供了基于FISH、可衔接细胞类型鉴定（如MERFISH、EASI-FISH）的实用方案。

主要关键技术方法

研究采用3只雄性Neurod6-cre小鼠（C57BL/6背景）作为起始细胞标记来源；构建含CASS条形码的SAD-B19ΔG-BFP狂犬病毒池，经一步电转包装与质量控制保证条形码多样性约6,561、唯一性>80%（注射颗粒<650）；开发半自动化八循环多重FISH系统（每循环3探针、光漂白后重杂交）于标准共聚焦显微镜解码8-trit条形码；结合QuickNII将冠状切面亮场图配准至Allen脑图谱（CCF v3），用Cellpose3分割细胞、MATLAB做位移校正与条形码可靠性评分；连接判定通过起始细胞与输入细胞条形码精确匹配（允许多周期缺失的容错通配），并以10,000次置换检验评估区域连接特异性。

研究结果

病毒生产与质量控制

研究人员通过改性一步RV包装获得高均匀性CASS条形码病毒池，质粒池与病毒池频率分布一致；模拟显示当投递病毒颗粒<650时>80%为唯一条形码，<140时>95%，据此设注射上限以平衡通量与标记效率。

半自动化多重FISH与解码

研究人员建立明场全切面定位、FISH前荧光识靶、八循环FISH拍照漂白流程，并用单片机控制蠕动泵与电磁阀实现半自动杂交冲洗；八循环产生8位三进制码（如11322213），Cycle 5作模板校正微位移，解码严格度阈值使约60% ROI×cycle免人工复核，整体BFP⁺细胞解码率达89.3%。

小鼠视觉皮层原位连接组图谱

在3只小鼠中共分析213个合格起始细胞与1,532个输入细胞；起始细胞输入数1–80，皮层2/3、4、5层差异显著且与深度呈弱正相关（深层接收更多输入）。空间分布上输入细胞偏后外侧，随注射位点（V1-only或V1+V2）而变。区域连接矩阵经10,000次degree-preserving置换检验，发现dLGN→L4、L4→L4、L5→L5等显著高于随机，L5→L4低于随机，与经典新皮层回路一致。共支配（co-innervation）分析显示L6前突触细胞对及dLGN细胞对倾向共支配同一起始细胞，皮层-皮层与丘脑-丘脑对共支配概率高于皮层-丘脑对。SST（somatostatin，生长抑素）免疫荧光显示SST输入细胞多条形码比例偏高；EASI-FISH初步证明CASS可与Slc17a7、Cux2、Gad1等内源基因共检。

讨论与结论翻译

研究人员在讨论中指出，CASS条形码以短序列而非单核苷酸为单元，兼顾杂交解码与突变鲁棒性（RV为RNA病毒、突变率高），在保留空间背景上优于MAPseq等解离测序法，在设备门槛上优于BARseq等原位测序法。其多样性受病毒包装上限制约（实用理论多样度~10⁴），可通过增候选序列扩至3¹²=531,441需12循环FISH。局限包括多条形码细胞因杂交原理无法定序对必须剔除、非唯一条形码起始细胞源于helper⁺RV^?细胞污染、RV偏好高活性突触致连接数为下界估计、低滴度（5×10⁶）换精度弃通量。CASS可拓至HSV前向追踪或逆转录病毒谱系追踪。

结论部分翻译：研究人员呈现了CASS条形码——一种FISH可检测、错误鲁棒的工具有，其与狂犬病毒单突触追踪整合实现空间分辨连接组图谱绘制，相较原位测序或EM法潜在降低实验成本。借助短人工序列作条形码基元，该方法保留细胞空间信息（解离测序中丧失）同时在小鼠视觉皮层数千细胞中达89.3%解码率。应用揭示层特异输入模式、区域特异连接偏好（如皮层-皮层vs丘脑-丘脑共支配）及起始细胞深度与输入数相关——既契合经典新皮层回路又提供单细胞空间粒度。局限在于需剔除多条形码细胞及因低滴度病毒致输入数适中（为精度权衡）。该方法与现有FISH细胞类型标记（MERFISH、抗体染色）兼容且可扩展（增短序列理论多样度至5×10⁵），适配从下丘脑环路到谱系追踪的多样连接组问题。通过平衡通量、成本与空间分辨率，CASS条形码法为介观连接组学提供实用FISH途径，补位原位测序、高成本EM重建与解离测序，使实验室尺度跨脑区连接研究带直接空间背景成为可能。未来优化CVS株RV包装降毒与多条形码高分辨解码将进一步释放潜力。