一种用于急性肝损伤中髓过氧化物酶活性光学评估的近红外荧光探针

《Dyes and Pigments》：A near-infrared fluorescent probe for optical evaluation of myeloperoxidase activity in acute liver injury

　　

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  本研究设计并开发了一种新型近红外荧光探针 Cy-Probe-MPO（Aem ≈ 810 nm），该探针通过髓过氧化物酶（MPO）催化产生的次氯酸（HOCl）触发的机制，特异性响应 MPO 活性。探针在暴露于 HOCl 后发生特异性裂解，释放近红外荧光团，从而实现 MPO 酶活性的选择性、精准的检测。系统表征结果表明：（1）Cy-Probe-MPO 对 MPO-HOCl 体系展现出优异的分析性能，检测限低至 1.14 nM，且对多种活性氧/氮物种（ROS/RNS）具有显著选择性，响应强度高出 12 倍以上；（2）在 LPS/IFN-γ 诱导的巨噬细胞炎症模型中验证了其生物特异性；（3）在三种经典小鼠急性肝损伤模型中成功实现了肝内 MPO 活性的离体成像，且背景荧光干扰极小。
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  总体而言，Cy-Probe-MPO 代表了新一代结合分子机制特异性、化学稳定性和体内适用性的光学探针。本研究在肝损伤早期预警、客观病理分级以及抗氧化/抗炎治疗疗效的精准评估方面具有广阔前景，在炎症性疾病的诊断和治疗监测中具有显著潜力。

引言

髓过氧化物酶（MPO）是一种主要表达于中性粒细胞和单核细胞来源巨噬细胞的血红素依赖性过氧化物酶，是固有免疫中的关键效应酶[[1], [2], [3], [4]]。在生理条件下，MPO 利用过氧化氢（H₂O₂）和氯离子（Cl^?）催化产生具有强效杀菌氧化作用的次氯酸（HOCl），同时促进羟基自由基（·OH）和亚硝酰氯（NOCl）等次级活性物种的形成[[5], [6], [7]]。这些氧化剂选择性地破坏入侵病原体的关键生物分子——蛋白质、脂质和核酸——从而赋予广谱抗菌和抗真菌活性，构成关键的生化防御前线[8,9]。然而，在慢性炎症、自身免疫或代谢紊乱状态下，MPO 发生持续过度表达和异常激活，导致病理性 HOCl 蓄积[10]。这驱动氧化性翻译后修饰——包括蛋白质 3-氯代酪氨酸形成、脂质过氧化链式反应和氧化性 DNA 损伤——最终导致进行性组织损伤[11,12]。现有的临床和临床前证据充分证实，MPO 驱动的氧化应激是多种高负担疾病的核心病理节点：动脉粥样硬化、心力衰竭、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、阿尔茨海默病、帕金森病以及肿瘤进展——包括多种实体瘤获得化疗耐药性[13,14]。因此，对 MPO"功能性"活性的定量化和空间分辨评估——而非仅仅其丰度——已成为分层炎症严重程度、预测临床预后和指导精准抗炎或抗氧化干预不可或缺的生物标志物范式[[15], [16], [17]]。

在临床实践中，可靠测量"催化活性"MPO 的工具仍极为匮乏。虽然酶联免疫吸附测定（ELISA）被常规使用，但它检测的是 MPO 总蛋白，不区分酶活性能力——从而将功能完整的酶与不可逆氧化、错误折叠或蛋白水解截断的失活亚型混为一谈[18,19]。其实用局限性同样显著：多步骤复杂操作（总检测时间 4–6 小时）、高试剂成本（依赖已验证的单克隆抗体和酶标记检测试剂）、可扩展性差，以及与活体动物成像或动力学监测的根本不兼容性[[20], [21], [22]]。新兴纳米酶联免疫策略虽部分改善了检测性能，但仍无法区分活性 MPO 与失活蛋白组分[23]。相比之下，活性基于的荧光探针具有显著优势：对 MPO 独特生化产物（HOCl）的分子水平特异性、亚分钟级响应动力学、极高灵敏度（检测限跨度从低纳摩尔到皮摩尔级）以及操作简便性——仅需标准荧光读数仪或体内成像平台[24,25]。关键在于，由于 MPO 是唯一能从生理性 Cl^? 和 H₂O₂ 产生 HOCl 的哺乳动物酶，HOCl 选择性探针可作为"真正的"MPO 酶活性的忠实间接报告者。因此，推进兼具高保真度、时间精度和生物相容性的探针，是解构炎症-氧化轴的重要化学生物学工具[[26], [27], [28], [29]]。

近年来，靶向 MPO 或其主要催化氧化产物次氯酸（HOCl）的活性荧光探针因其操作简便、优异的空间分辨率和快速响应动力学，已成为非侵入性生物成像不可或缺的化学工具[[30], [31], [32]]。尽管取得了重大进展，但由于现有探针固有的结构和光学局限性，设计能够在复杂生物组织模型中灵敏、选择性报告 MPO 活性的探针仍是一个重要目标。例如，近期一项突破性研究报道了一种基于 2-硫代噻噁二唑功能化的溶剂致变色探针，可实现活体中性粒细胞中 NETosis 过程中 MPO 动态的无洗涤可视化。然而，该设计依赖于酶活性位点的共价占据，且其荧光发射仅限于可见光区域（λem = 510–600 nm）。该光谱窗口内的严重光散射和组织自发荧光阻碍了其在深层组织成像中的应用[30]。为提高组织穿透能力，七甲氰基探针 Cy7-NphS（λem = 789 nm）已被开发用于监测活细胞中线粒体 HOCl。然而，该探针灵敏度中等（LOD = 620 nM），不足以检测早期组织损伤中酶活性的细微变化[31]。此外，一种酰肼连接的亚甲基蓝传感器 FD-301（λem = 686 nm，LOD = 43.9 nM）已被开发用于在关节炎和结肠炎等炎症模型中追踪 MPO[32]。然而，同时实现深层近红外发射（λem > 800 nm）和单纳米摩尔级检测灵敏度，仍然是追踪深层器官中细微早期 MPO 酶活性爆发的重大挑战。这些代表性探针的光学和析性能的系统比较总结于表 S1。

为克服上述局限性，我们合理设计了一种可激活的近红外一区（NIR-I）荧光探针（Cy-Probe-MPO，λem = 810 nm），将 HOCl 响应的二甲基硫代氨基甲酸酯裂解结构单元与刚化的七甲氰基骨架相结合。得益于优化的分子内电荷转移（ICT）猝灭-恢复机制，该探针展现出卓越的灵敏度，理论检测限低至 1.14 nM，显著优于当前报道的光学 MPO 探针（如 Cy7-NphS 的 620 nM 和 FD-301 的 43.9 nM）。此外，Cy-Probe-MPO 在痕量浓度范围（0.02–0.6 μM）内呈现可靠的线性响应，且具有良好的选择性（对 HOCl 的偏好高于其他竞争 ROS/RNS 12 倍以上）。我们进一步在三种病因学不同的小鼠急性肝损伤模型中评估了其应用价值——对乙酰氨基酚诱导的肝毒性、四氯化碳诱导的急性坏死性炎症损伤和急性乙醇诱导损伤——实现了对特定进展阶段肝内 MPO 相关氧化应激的敏感离体光学评估。这一能力为肝损伤的早期诊断、客观组织病理学分级以及氧化还原调控干预的离体疗效评估提供了严谨可定量化和高度灵敏的分子成像平台。

摘要

材料

髓过氧化物酶（MPO）和 4-氨基苄苯甲酸酰肼（ABAH）购自 Sigma-Aldrich。脂多糖（LPS）和干扰素-γ（INF-γ）购自 MedChemExpress（MCE）。对乙酰氨基酚（APAP）和四氯化碳（CCl₄）由阿拉丁生化科技有限公司提供。近红外 MPO 荧光探针 Cy-Probe-MPO（称为探针 A，MW = 851 g/mol）及其对应的裂解荧光产物 Cy-NH₂ 经合成、纯化并进行结构

结果与讨论

本研究系统阐明了 Cy-Probe-MPO 的分子设计原则及其在多种急性肝损伤模型中的多模态近红外荧光成像应用（图 1）。Cy-Probe-MPO 以二甲基氨基磺酸酯作为其 MPO 特异性响应单元，该单元被 MPO 催化产生的次氯酸（HOCl）选择性氧化裂解。该反应触发分子内结构重排，释放出游离氰基染料 Cy-NH₂，具有

结论

总之，本研究设计并合成了一种可激活的近红外荧光探针 Cy-Probe-MPO，用于选择性光学报告髓过氧化物酶（MPO）活性。该探针响应 MPO 来源的 HOCl，具有长波长发射（λem ≈ 810 nm），表现出可靠的选择性和微摩尔级线性响应范围。在三种经典小鼠急性肝损伤模型中，Cy-Probe-MPO 成功实现了肝内 MPO 相关氧化应激的离体光学评估

作者贡献声明

张宁：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法论，经费获取，数据整理。彭明涛：撰写——初稿，方法论，数据整理。李洛逸：撰写——初稿，数据整理。刘梦莎：数据整理。赵雅琴：数据整理。李国春：数据整理。王西达：数据整理。冉莉：撰写——初稿，数据整理。张晴：撰写——审阅与编辑，经费获取，撰写——初稿，数据整理。

利益冲突声明

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

本研究由国家自然科学基金（编号82202448）和重庆市自然科学基金（编号CSTB2023NSCQ-MSX0350）资助；重庆市教育委员会科技研究项目（KJQN202501151）；湖北省关键学科与转化再生医学重点实验室开放基金（2025zsyx02）；重庆理工大学研究生创新创业计划（gzlcx20253275

张宁|彭明涛|李洛逸|刘梦莎|赵雅琴|李国春|王西达|冉莉|张晴