一种可靶向溶酶体的双重响应荧光探针，用于检测非酒精性脂肪肝疾病中的过氧亚硝酸盐和粘度变化

《Dyes and Pigments》：Lysosome-targetable dual-responsive fluorescent probe for imaging peroxynitrite and viscosity in non-alcoholic fatty liver disease

　　

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  这种新型的双响应探针能够同时监测ONOO^?和微粘度。
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  与ONOO^?的特异性反应会引发明显的荧光增强，且该探针对粘度变化具有较高的敏感性。
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  该探针可用于体外细胞溶酶体成像和体内组织成像。
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  该探针既能用于体外成像，也能用于体内成像，并适用于非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的早期病理评估。

引言

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝脏疾病之一，与肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征密切相关[[1], [2], [3]]。这种疾病从单纯的脂肪变性发展到非酒精性脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化，最终可能发展为肝细胞癌[4,5]。NAFLD患者的慢性系统性代谢失调通常伴随着胰腺等肝外器官中的异常脂质沉积，这进一步引发溶酶体功能障碍、氧化-硝化应激以及胰腺组织内的微粘度变化。值得注意的是，尽管已经发生了显著的代谢重编程和细胞内功能障碍，但NAFLD的早期阶段往往没有症状，这凸显出迫切需要能够捕捉这些早期病理变化的敏感工具[6]。越来越多的证据表明，活性氮物种，特别是ONOO^?，在NAFLD的进展中起着关键作用，它们会诱导线粒体功能障碍、脂质过氧化和炎症信号传导级联[7], [8], [9]]。值得注意的是，在脂肪变性的早期阶段就观察到了ONOO^?的过度产生，这表明它可能作为疾病发生的早期生化指标[10], [11], [12]]。然而，由于其极短的半衰期、高反应性和低稳态浓度，在复杂的生物系统中准确、实时地检测ONOO^?仍然具有挑战性[5,[13], [14], [15]]。除了化学氧化应激之外，物理微环境（尤其是细胞内粘度）的变化也被认为是代谢紊乱的重要特征[3,[16], [17], [18]]。在NAFLD中，脂质堆积会导致大分子聚集和细胞器重塑，从而提高微粘度，进一步影响分子扩散和细胞代谢[19], [20], [21], [22]]。然而，大多数现有的荧光探针要么仅关注活性物种，要么仅关注物理参数，无法提供关于疾病相关微环境的全面信息[23], [24], [25], [26]]。为了解决这些局限性，人们迫切需要能够同时监测化学和物理微环境变化的双响应荧光探针[27], [28], [29], [30]]。在本研究中，我们报道了一种双响应荧光探针（CMN），它结合了ONOO^?引发的反应性和对粘度敏感的分子旋转特性，从而能够同时检测体外细胞溶酶体中的ONOO^?和微粘度。该探针由三个模块组成：一个香豆素荧光团、一个用于实现双重响应性的亚胺桥接单元以及一个用于靶向溶酶体的吗啉基团，这三个部分分别实现了粘度感应、对过氧亚硝酸盐（ONOO^?的特异性识别以及在酸性溶酶体中的选择性积累。吗啉基团赋予了分子pH依赖性的溶酶体捕获能力，与市售的LysoTracker有很高的共定位系数[31], [32], [33]]。这一特性有效消除了来自其他细胞内器官的背景信号，确保检测到的粘度和ONOO^?信号仅来源于溶酶体微环境原位。中心的CN Schiff碱亚胺键是ONOO^?的特异性识别位点。当ONOO^?引发CN键的氧化断裂时，右侧的苯胺-吗啉靶向片段会分离，而左侧的香豆素骨架会转化为水杨醛衍生物。这种结构重排改变了分子 conjugated 系统，重新改变了分子内的电荷转移（ICT）路径，从而产生显著的荧光增强[34], [35], [36]]。在低粘度条件下，CN键周围的自由旋转促进了激发态分子中的扭曲分子内电荷转移（TICT），其中激发能量主要通过非辐射性热衰减耗散，产生较弱的荧光。相反，溶酶体自噬、脂质积累或膜损伤会显著提高溶酶体内的粘度；空间阻碍限制了CN键的自由旋转，抑制了TICT过程[37], [38], [39]]。此时，激发能量通过辐射荧光发射释放，荧光强度随粘度的升高而增强，从而可以实现微粘度的定量测量。此外，我们还在NAFLD小鼠模型的肝组织和胰腺组织中实现了粘度和ONOO^?变化的同步可视化，为NAFLD的早期诊断和病理研究提供了有用的工具。

章节片段

ONOO^?的检测

我们系统评估了这种荧光探针对ONOO^?的选择性。新鲜制备的ONOO^?储备溶液（10 mM）以及一系列可能引起干扰的物种（包括H₂O₂、•OH、¹O₂、HClO、NO、O₂•^-、NaNO₂、TBHP、GSH、Cys、Hcy、K⁺、Na⁺、Mg²⁺）均溶解在去离子水中。简言之，通过使用摩尔吸收系数ε₃₀₂?=?1670?M^?1?cm^?1，在302?nm处测量其紫外-可见光吸收来确定新鲜制备的ONOO^?储备溶液的浓度

探针CMN的合成

向50 mL圆底烧瓶中加入4-甲基-7-羟基-8-甲酰香豆素（0.10?g，0.49?mmol），然后加入甲苯（25?mL）。搅拌后加热至60?°C，随后加入4-吗啉苯胺（0.10?g，0.59?mmol）。再将反应温度升高至85?°C并保持回流状态。在回流过程中，反应混合物变得清澈。随后，通过逐滴加入3?mol/L盐酸将反应溶液的pH值调整至4–5

结论

成功开发了一种双响应荧光探针，用于生物系统中ONOO^?和微粘度的敏感检测。该探针对ONOO^?具有高选择性和高敏感性，并且对粘度变化表现出明显的荧光响应。此外，该探针在生物应用中表现出优异的性能，能够在活细胞中实时成像细胞内的ONOO^?，同时具有低细胞毒性和高成像对比度。

CRediT作者贡献声明

张迪：撰写——原始草稿，实验研究。侯毅：概念构思。邓一平：正式分析。吴娟娟：实验研究。傅春华：正式分析。季欣宇：方法学研究。韩瑞彦：数据管理。王晓丽：撰写——审稿与编辑，概念构思。闫凡：资源获取，资金申请。朱超：概念构思。孙婉：撰写——审稿与编辑，资金申请，概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了山东省科技创新计划（2023KJ271, 2025KJH188）、德州市重点研发计划（ZD2025ZC002, ZD2025ZC026）、德州市大学研究项目资助（2024xjrc130）、德州市实验技术项目（SYJS25003, SYJS25007）的支持。

张迪|侯毅|邓一平|吴娟娟|傅春华|季欣宇|韩瑞彦|王晓丽|闫凡|朱超|孙婉